朱紹坤，孫凌俊，高圣華，喬軍，郭薦碩

（1. 遼寧省果樹科學(xué)研究所，遼寧營口 115009；2. 遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧營口 115009）

葡萄是世界重要水果之一，在世界范圍內(nèi)種植廣泛，目前中國鮮食葡萄的產(chǎn)量與面積已居于世界第一[1]。葡萄產(chǎn)業(yè)在遼寧農(nóng)業(yè)中占重要地位，截止2020年葡萄栽培面積已達(dá)4.48萬 hm2，產(chǎn)量90.60萬 t，分別占全國葡萄的5.5%、6.5%，位居全國第五位和第四位。但遼寧省作為葡萄老產(chǎn)區(qū)，隨著種植年限的增加，葡萄連作引起的病蟲害加重、樹體衰弱、再植更新困難等問題，降低了葡萄品質(zhì)與產(chǎn)量[2]，影響了果農(nóng)經(jīng)濟效益，阻礙了葡萄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，間作已經(jīng)成為緩解連作障礙的有效措施之一，合理間作能促進(jìn)植株生長[4]，提高作物產(chǎn)量[5]，降低病害發(fā)生率[6]，顯著改善土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)[7-8]。胡國彬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蠶豆與小麥間作使蠶豆的籽粒產(chǎn)量和百粒質(zhì)量分別提高44.29%和12.17%，枯萎病病情指數(shù)降低57.14%。鄭亞強等[10]研究發(fā)現(xiàn)，玉米間作甘蔗使根際微生物功能多樣性提高，根際微生物活性增強。目前關(guān)于果樹間作的相關(guān)研究多集中在根系、水肥、光照的空間分布與利用等方面，涉及間作對連作果樹根際環(huán)境影響等方面的研究仍需深入和系統(tǒng)化。

葡萄育苗圃是連作危害較重的地塊之一，本研究基于前期試驗結(jié)果[11]，選取3種作物與‘貝達(dá)’葡萄間作種植，研究不同間作物對連作葡萄生長、根際環(huán)境的影響及其相互關(guān)系，探討葡萄間作系統(tǒng)中根際土壤養(yǎng)分、微生物群落結(jié)構(gòu)等的變化規(guī)律及影響因素，旨在為連作葡萄間作效應(yīng)的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為一年生‘貝達(dá)’葡萄扦插苗，間作物為大蔥（C）、花生（H）、苦荬菜（K），種子購自農(nóng)發(fā)源種子公司。試驗地點位于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄試驗園，該園建立于1978年，期間對葡萄更新3次，供試連作土壤基本理化指標(biāo)為：堿解氮為98.35 mg·kg-1、速效磷109.44 mg·kg-1、速效鉀189.8 mg·kg-1、有機質(zhì)26.53 g·kg-1、pH為6.85。

1.2 試驗設(shè)計

采用槽式栽培方式（80 cm×65 cm×70 cm）。將栽于連作土中的‘貝達(dá)’分別與3種間作物定植，間作物與葡萄的行距分別設(shè)為5、10、15、20、25 cm， 共5個處理。葡萄苗株距為10 cm，兩側(cè)為作物種植行，間作物株距為7 cm，以不間作的葡萄苗為對照（CK）。葡萄單臂籬架，避雨栽培，常規(guī)統(tǒng)一管理。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄生理指標(biāo)測定

間作種植80 d（此時植株生長趨于平緩）后取葡萄植株測定地上部、地下部的鮮質(zhì)量。

1.3.2 葡萄根際土壤的收集

用抖根法[12]收集葡萄根際土壤，混勻后統(tǒng)一過20目篩。一部分風(fēng)干保存，用于理化性質(zhì)測定；另一部分保存于﹣80 ℃，用于微生物結(jié)構(gòu)測定。

1.3.3 葡萄根際土壤理化性質(zhì)的測定

堿解氮采用堿解擴散法測定，速效磷采用鉬銻抗比色法測定，速效鉀采用火焰光度計法測定，有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定，pH值用pH測量儀測定[13]。

1.3.4 根際微生物結(jié)構(gòu)多樣性測定

土壤微生物DNA提?。翰捎迷噭┖蟹椒ǎㄉzup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒）。細(xì)菌擴增采用968-GC-F和1401R[14]為引物擴增16S rDNA序列；真菌采用巢式PCR擴增，分別以ITS1F/ITS4[15]和ITS1-GC-F/ITS2[16]為第一輪和第二輪擴增引物。

PCR反應(yīng)條件：第一輪條件為94 ℃變性7 min；94 ℃變性60 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)32次；最后72 ℃延伸15 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若均為清晰條帶進(jìn)行第二輪擴增。第二輪條件為94 ℃變性7 min；94 ℃變性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)32次；最后72 ℃延伸15 min。瓊脂糖電泳檢測出現(xiàn)清晰條帶后，可進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。

變性梯度凝膠電泳所用變性梯度細(xì)菌為40%～60%，真菌為30%～60%，采用8%聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為1×TAE，用微量注射器每孔上樣40 μL，60 ℃下180 V電壓運行6 h，電泳完成后用Genefinder染料進(jìn)行避光染色30 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用化感效應(yīng)指數(shù)（RI）分析生理指標(biāo)，即

其中，T代表處理值，C0代表對照值；RI為正值表現(xiàn)促進(jìn)，RI為負(fù)值表現(xiàn)抑制。

采用Quantity One軟件分析DGGE的指紋圖譜數(shù)據(jù)，用Shannon指數(shù)表示土壤微生物種群多樣性；H′= ﹣∑pi×㏑pi，其中pi為某一條帶密度占該泳道所有條帶密度之和的比值。

采用Excel 2010、SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 間作對連作葡萄生長的影響

間作物對連作葡萄植株鮮質(zhì)量的化感效應(yīng)指數(shù)如圖1。間作大蔥處理對連作葡萄長勢的影響，除C5處理表現(xiàn)為抑制作用外，其他處理均增加植株總質(zhì)量，促進(jìn)作用隨距離的增加呈現(xiàn)先增強后降低的趨勢，其中C20處理促進(jìn)作用最強；在間作花生處理中，間作5 cm處理呈現(xiàn)抑制作用，而10 cm處理具有明顯的促進(jìn)作用；間作苦荬對葡萄質(zhì)量均表現(xiàn)為抑制，K5處理抑制效果最強。

圖1 不同間作處理對葡萄總質(zhì)量的影響Figure 1 Effects of the intercropping treatments on total mass of grape plants

2.2 間作對連作葡萄根際土壤理化性質(zhì)的影響

根據(jù)對不同間作模式下葡萄根際土壤理化性質(zhì)的測定結(jié)果（表1），可得出間作大蔥對各理化性質(zhì)的影響，其中堿解N（C10除外）、速效P（C10除外）、有機質(zhì)（C5除外）、pH（C5除外）與CK相比均無顯著性差異，而速效K（C15、C20除外）有降低的趨勢。與CK相比，間作花生處理降低了堿解N、速效P（H25除外）含量，提高了有機質(zhì)含量（H5除外）；速效K中H5顯著高于CK，H15、H20顯著低于CK?？噍ぬ幚碇兴傩（K5、K15除外）、pH值（K10、K20除外）顯著低于CK。

表1 不同間作模式對葡萄根際土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 Effect of intercropping treatments on physical and chemical properties of grapevine rhizophere soil

土壤肥力是土壤中各種理化性質(zhì)的綜合反應(yīng)，為評價不同間作模式下土壤理化性質(zhì)綜合水平，將土壤養(yǎng)分指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。其中，第一主成分方差貢獻(xiàn)率為48.67%，特征值為2.44；第二主成分方差貢獻(xiàn)率為21.92%，特征值為1.10。兩個主成分累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到70.58%，基本包含了主要土壤理化信息。

由表2可知，各間作處理土壤肥力綜合得分整體低于不間作處理；間作苦荬土壤養(yǎng)分綜合得分（除K5）高于間作大蔥；間作花生土壤養(yǎng)分綜合得分較低。

表2 主成分因子得分及土壤肥力水平綜合得分Table 2 Principal component factor score and comprehensive score of soil fertility level

2.3 間作對連作葡萄根際微生物結(jié)構(gòu)多樣性的影響

通過PCR-DGGE分析不同間作處理對葡萄根際細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)多樣性的影響，如圖2。各間作處理降低了連作葡萄根際細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性，且間作苦荬處理對細(xì)菌多樣性的降低程度大于間作大蔥、花生處理。在間作大蔥模式下，微生物細(xì)菌多樣性為C20＞C25＞C15＞C10＞C5；間作花生處理中，隨間作距離的增加多樣性呈現(xiàn)低-高-低的趨勢；在苦荬間作中，各間作處理細(xì)菌多樣性差異不明顯。

圖2 葡萄根際微生物結(jié)構(gòu)H'值Figure 2 The Shannon index on the structure of the rhizosphere microorganism in grapevines

如圖2所示，間作降低了根際土壤真菌的多樣性，間作苦荬處理的真菌多樣性受抑制程度低于間作大蔥、花生處理。在間作大蔥模式中，C25微生物中真菌多樣性抑制程度最低，C15真菌的抑制程度最高；間作花生處理下，H25處理對根際真菌多樣性降低程度最高，H10、H15處理降低幅度較低；而間作苦荬中，真菌多樣性表現(xiàn)為K5＞K25＞K20＞K10＞K15。隨間作距離的增加，真菌多樣性受抑制程度表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。

圖3 為各間作模式下根際細(xì)菌與真菌結(jié)構(gòu)多樣性比值，均無顯著性差異。間作大蔥、花生中細(xì)菌與真菌比值高于CK，苦荬間作處理的細(xì)菌與真菌比值小于CK。間作大蔥中，C20處理比值最高；花生處理中H10、H15處理的比值較高；間作苦荬處理中K5比值最低。

2.4 間作葡萄根際微生物結(jié)構(gòu)多樣性與植株長勢、土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

通過對葡萄根際土壤微生物細(xì)菌、真菌多樣性比值與各處理葡萄植株總質(zhì)量間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、真菌多樣性比值與葡萄長勢（即總質(zhì)量）間相關(guān)系數(shù)為0.901，存在極顯著正相關(guān)性。

通過對不同間作處理下葡萄根際微生物結(jié)構(gòu)多樣性與各組分土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表3），細(xì)菌的結(jié)構(gòu)多樣性與根際土壤pH值間存在顯著相關(guān)性，真菌的結(jié)構(gòu)多樣性與土壤堿解氮含量間存在顯著相關(guān)性。

表3 根際微生物結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析Table 3 Correlative analysis between the Shannon index of the microbial structure and the physical and chemical properties in rhizosphere soil

3 討論

3.1 間作對連作葡萄生長的影響

間作被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式中的精華，不僅是一種高效的種植模式，而且有抗病、增產(chǎn)等優(yōu)勢[17-18]。間作可優(yōu)化根際土壤生物多樣性及群落組成[19]，顯著提高微生物總數(shù)，影響植物長勢[7-8,20]。本試驗發(fā)現(xiàn)，間作苦荬抑制連作葡萄植株總質(zhì)量，而間作花生、大蔥提高了連作葡萄植株質(zhì)量，促進(jìn)了生長，改善了葡萄的連作障礙，這與前期研究結(jié)果一致[11]。

3.2 間作對連作葡萄根際土壤理化性質(zhì)的影響

根際土壤環(huán)境在連作中占據(jù)極其重要的位置[21]，土壤養(yǎng)分、微生物及植物之間相互作用，共同維持著土壤環(huán)境[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，間作苦荬、花生、大蔥對根際土壤理化性質(zhì)的影響無明顯規(guī)律性，但主成分分析表明，3種間作物均降低了根際土壤肥力水平。推測可能是間作物與葡萄之間存在部分養(yǎng)分競爭關(guān)系或部分作物間作后產(chǎn)生種間促進(jìn)作用，提高了葡萄對土壤養(yǎng)分的吸收利用，從而降低了根際土壤肥力。這一推測與Li等[23]的研究相似，其發(fā)現(xiàn)蠶豆玉米間作后，蠶豆和玉米均增加了對土壤養(yǎng)分磷的吸收，且蠶豆和玉米分別增產(chǎn)26%、43%。

3.3 間作對連作葡萄根際微生物結(jié)構(gòu)多樣性的影響

目前的研究普遍認(rèn)為，連作障礙發(fā)生的重要原因是根際微生物群落失衡，由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變[24]，而間作可使土壤向健康的“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變[25]。本試驗通過微生物結(jié)構(gòu)多樣性研究發(fā)現(xiàn)，間作大蔥、花生土壤中細(xì)菌與真菌的比值高于對照，而間作苦荬處理其比值低于對照，并發(fā)現(xiàn)細(xì)菌與真菌結(jié)構(gòu)多樣性比值與葡萄植株長勢（即總質(zhì)量）具有極顯著相關(guān)性，說明合理間作可提高土壤細(xì)菌比例，并可通過提高葡萄根際土壤細(xì)菌與真菌的比例，改善葡萄連作障礙。

3.4 間作葡萄根際土壤微生物與理化性質(zhì)間的關(guān)系

前人研究表明根際土壤理化性質(zhì)與微生物之間存在相互作用[26]；微生物多樣性受土壤理化性質(zhì)變化的影響[27]，而土壤理化性質(zhì)保持平衡的因素之一是微生物的多樣性[28]。李巧玲等[29]研究發(fā)現(xiàn)，pH在細(xì)菌群落多樣性中發(fā)揮著重要功能；而堿解N與土壤微生物多樣性呈顯著相關(guān)性[30]。本研究得出，根際土壤中細(xì)菌、真菌多樣性分別與土壤pH值、堿解氮存在顯著相關(guān)性。該結(jié)果證實了前人的研究，認(rèn)為土壤理化性質(zhì)中的堿解N與pH值在間作葡萄根際微生物結(jié)構(gòu)多樣性中發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

間作大蔥、花生對連作葡萄長勢有促進(jìn)作用，間作苦荬對連作葡萄有抑制作用。間作可以改變連作葡萄的根際土壤環(huán)境。間作大蔥、花生、苦荬降低了葡萄根際土壤肥力；間作大蔥、花生提高了根際土壤細(xì)菌與真菌結(jié)構(gòu)多樣性比值，間作苦荬降低了其比值；根際土壤細(xì)菌與真菌結(jié)構(gòu)多樣性比值與連作葡萄植株長勢具有極顯著相關(guān)性。因此認(rèn)為，間作大蔥、花生通過提高根際土壤細(xì)菌與真菌結(jié)構(gòu)多樣性比值，從而對葡萄連作障礙緩解發(fā)揮重要作用。