魏娜，劉振兵，2

1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)鄂爾多斯臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000；2 鄂爾多斯市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科二區(qū)

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是指冠狀動(dòng)脈（冠脈）血供減少或中斷后造成心肌缺血，待冠脈血運(yùn)恢復(fù)后出現(xiàn)心肌頓抑導(dǎo)致不可逆損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡或壞死。雖然在心肌缺血期間給予心臟保護(hù)干預(yù)措施（治療性低溫、迷走神經(jīng)刺激、遠(yuǎn)程缺血預(yù)適應(yīng)和美托洛爾治療等）可減輕MIRI［1］，但療效有限，還需進(jìn)一步研究心臟保護(hù)策略。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）在心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，可催化底物L(fēng)-精氨酸生成一氧化氮（NO），發(fā)揮心臟保護(hù)作用。本文對(duì)eNOS與MIRI的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 eNOS的來源、結(jié)構(gòu)和功能

eNOS 是血管內(nèi)皮中最重要的NO 合成酶亞型，是一種同源二聚體，可與多種輔因子結(jié)合，將L-精氨酸和氧氣轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸和NO。eNOS 的N 末端由加氧酶結(jié)構(gòu)域組成，含有四氫生物蝶呤、血紅素鐵和L-精氨酸結(jié)合部位，以上輔因子可促進(jìn)酶的二聚化。當(dāng)L-精氨酸和四氫生物蝶呤缺乏時(shí)，eNOS不產(chǎn)生NO 而產(chǎn)生超氧陰離子（O2-），導(dǎo)致氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙，最終加劇eNOS 解偶聯(lián)［2］。每個(gè)eNOS單體的兩個(gè)半胱氨酸殘基之間與鋅離子形成的硫代鋅簇使酶更穩(wěn)定。但當(dāng)該簇被氧化或暴露于過量過亞硝酸鹽中會(huì)導(dǎo)致eNOS解偶聯(lián)。eNOS與不對(duì)稱二甲基精氨酸（ADMA）會(huì)競爭底物精氨酸，所以ADMA 是內(nèi)源性的eNOS 抑制物，當(dāng)其血漿濃度的增加會(huì)使eNOS 解偶聯(lián)，促使氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙發(fā)生和發(fā)展。然而在生理?xiàng)l件下或L-精氨酸充足的情況下不會(huì)發(fā)生。eNOS 的C 末端是還原酶結(jié)構(gòu)域，可與黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸結(jié)合。若要激活eNOS，需兩個(gè)鈣離子激活鈣調(diào)蛋白，解除其與還原酶結(jié)構(gòu)域相連方可激活eNOS。

eNOS 不僅在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并在心肌細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板中表達(dá)，在心血管生理學(xué)中發(fā)揮混合功能，既可以合成NO，擴(kuò)張血管，也可以合成超氧化物，加劇氧化應(yīng)激。

2 eNOS生理作用與MIRI的關(guān)系

2.1 解偶聯(lián) eNOS 解偶聯(lián)可加劇MIRI。偶聯(lián)時(shí)，eNOS 產(chǎn)生NO 以促進(jìn)血液流動(dòng)，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面維持抗炎和抗血栓的作用［3］。解偶聯(lián)時(shí)eNOS功能受損，即不生成NO，而是產(chǎn)生O2-，使NO 生物利用度降低，氧化應(yīng)激增加，并導(dǎo)致或加重內(nèi)皮功能障礙。抑制eNOS 解偶聯(lián)包括加入L-精氨酸底物、抑制精氨酸酶以及補(bǔ)充四氫生物蝶呤和葉酸，后者可提高NO 水平［2］。研究證實(shí)，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中減少eNOS 解偶聯(lián)可通過下調(diào)O2-和過氧亞硝基陰離子（ONOO-）的生成，提高NO 水平，改善缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷和氧化應(yīng)激。此外，氧化應(yīng)激引起的氧化谷胱甘肽水平升高可誘導(dǎo)劑量依賴的eNOS S-谷胱甘肽基化產(chǎn)生，加劇解偶聯(lián)［3］。其次，解偶聯(lián)可將運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的有益的血管效應(yīng)轉(zhuǎn)化為血管損傷的關(guān)鍵事件。在內(nèi)皮腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1 缺乏的情況下，運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了eNOS 介導(dǎo)的超氧化物歧化酶的產(chǎn)生，過氧亞硝酸鹽的形成增加，導(dǎo)致活性氧大量生成，并使內(nèi)皮功能障礙持續(xù)存在［4］。抗阻力運(yùn)動(dòng)可通過限制eNOS 解偶聯(lián)增強(qiáng)其活性，將NO 信號(hào)轉(zhuǎn)化為遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理效應(yīng)，促進(jìn)缺血后心肌收縮功能恢復(fù)，減少致命性心律失常，縮小心肌梗死面積［5］。綜上，eNOS 解偶聯(lián)會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及內(nèi)皮功能障礙加劇MIRI。

2.2 磷酸化 磷酸化是eNOS 活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)方式。eNOS 的磷酸化和去磷酸化依賴于鈣調(diào)蛋白的結(jié)合和電子從還原酶到加氧酶結(jié)構(gòu)域的流動(dòng)。eNOS 被磷酸化的主要部位是絲氨酸殘基（Ser），其次是酪氨酸（Tyr）和蘇氨酸（Thr）殘基。Ser617、635和1179 以及Tyr81 的磷酸化導(dǎo)致eNOS 激活，而Ser116 和Thr495、497、Ser144 的磷酸化會(huì)使eNOS 活性減弱［6］。MIRI 小鼠模型缺血心肌中亞硝酸鹽水平、eNOS 表達(dá)和Ser1177 處的磷酸化顯著減少［7］。與安靜大鼠相比，運(yùn)動(dòng)大鼠心臟中eNOS Ser1177 位的磷酸化在再灌注早期顯著降低，增加心臟對(duì)MIRI的易感性，發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)［4］。高密度脂蛋白通過增加eNOS Ser1177 磷酸化，增加eNOS 活性并保護(hù)血管彈性，進(jìn)而減輕MIRI［8］。在細(xì)胞MIRI 模型中，增加Ser1177 和Tyr81 處磷酸化可促進(jìn)eNOS 產(chǎn)生NO，從而減輕冠脈內(nèi)皮功能障礙。遠(yuǎn)端缺血適應(yīng)可誘導(dǎo)Tyr81 磷酸化使MIRI 心肌中的eNOS 激活［9］。通心絡(luò)可增加缺血心肌eNOS Ser1179 和Ser635 處的磷酸化來減輕無復(fù)流和MIRI。缺血預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)了MIRI誘導(dǎo)的eNOS Ser1177處磷酸化和總eNOS表達(dá)的降低，保護(hù)血管內(nèi)皮。無機(jī)砷可增強(qiáng)男性eNOS Ser1177 磷酸化水平，減輕MIRI，而女性由于雌激素的內(nèi)分泌干擾作用無此效應(yīng)。所以eNOS 的有益磷酸化是確保NO 產(chǎn)生的關(guān)鍵翻譯后修飾，通過逆轉(zhuǎn)凋亡、保護(hù)血管內(nèi)皮發(fā)揮保護(hù)作用。

3 eNOS與MIRI發(fā)病機(jī)制的關(guān)系

3.1 內(nèi)皮功能障礙 血管內(nèi)皮作為最直接暴露于MIRI外源性損傷的器官，MIRI可造成血管內(nèi)皮功能障礙，使eNOS 蛋白表達(dá)嚴(yán)重降低，NO 產(chǎn)生減少。MIRI 發(fā)生后在冠脈血運(yùn)重建時(shí)會(huì)進(jìn)一步加劇內(nèi)皮功能障礙［10］。血管內(nèi)皮功能有大部分經(jīng)eNOS 的功能和活性決定［8］，NO 不僅是血管擴(kuò)張劑，也是減少血小板聚集和中性粒細(xì)胞黏附的抑制劑，只有通過維持足夠的eNOS水平才能改善MIRI引起的內(nèi)皮功能障礙。沉默信息調(diào)節(jié)劑1（SIRT1）已被證明可與eNOS 結(jié)合，并使eNOS 鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域中的賴氨酸K496 和K506 去乙?；瑥亩龠M(jìn)NO 的產(chǎn)生，重置eNOS 活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，eNOS 基因敲除的小鼠可導(dǎo)致嚴(yán)重的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，并導(dǎo)致冠心?。?1］。第三代β1選擇性β受體阻滯劑奈比洛爾可刺激內(nèi)皮NO 的形成，逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能障礙，改善高血壓大鼠模型的氧化應(yīng)激，并防止心肌梗死的多種并發(fā)癥發(fā)生［12］。維生素D缺乏是內(nèi)皮功能障礙的危險(xiǎn)因素。在內(nèi)皮細(xì)胞中，維生素D通過介導(dǎo)eNOS活性來調(diào)節(jié)NO 合成。在致病條件下，由于活性氧過量產(chǎn)生引起的氧化應(yīng)激會(huì)促進(jìn)NO 降解、抑制其合成并降低其生物利用度。維生素D抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性，使活性氧產(chǎn)生受影響，并通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性來提高抗氧化能力［13］。所以內(nèi)皮功能障礙和eNOS 損傷會(huì)相互促進(jìn)，無法起到擴(kuò)血管和保護(hù)內(nèi)皮作用，加劇MIRI。

3.2 氧化應(yīng)激 MIRI 會(huì)誘導(dǎo)過量的活性氧物質(zhì)形成造成氧化應(yīng)激，后者可對(duì)eNOS本身或上下游信號(hào)分子中明確定義的“氧化還原開關(guān)”進(jìn)行不利調(diào)節(jié)?！把趸€原開關(guān)”包括：四氫生物蝶呤的氧化耗竭，鋅硫絡(luò)合物的氧化破壞eNOS二聚體，活性氧引發(fā)的內(nèi)源性eNOS抑制物ADMA水平的增加［14］，還原酶區(qū)域半胱氨酸殘基Cys689 和Cys908 上的S-谷胱甘肽基化［15］，以及Thr495 或Tyr657 的不利磷酸化［16］。導(dǎo)致eNOS 活性喪失，甚至解偶聯(lián)［6］，后兩者會(huì)加速衰老。此外，O2-和ONOO-是介導(dǎo)氧化應(yīng)激、降低的NO 可用性和抑制eNOS 活性的主要自由基，它們會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 造成氧化損傷。O2-通過增加eNOS解偶聯(lián)、降低eNOS 蛋白表達(dá)、上調(diào)eNOS 抑制劑ADMA的形成以及降低輔因子四氫生物蝶呤的生物利用度，造成NO合成減少；ONOO-可誘導(dǎo)eNOS蛋白的構(gòu)象破壞最終加劇O2-產(chǎn)生。在大鼠心肌梗死模型中，抑制ONOO-可減少心肌損傷。紫檀芪通過抑制氧化或硝態(tài)應(yīng)激來減輕MIRI。糖尿病通過抑制eNOS 磷酸化表達(dá)、降低NO 可用性和增加血管收縮因子內(nèi)皮素-1 用量誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙［17］。細(xì)胞水平的氧化應(yīng)激在心肌梗死后的心肌重構(gòu)中也起關(guān)鍵作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在過度表達(dá)eNOS的轉(zhuǎn)基因小鼠中，心肌梗死后的心肌重構(gòu)減弱、血管生成增加、心肌纖維化減少。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，受到過氧亞硝酸鹽或次氯酸的攻擊時(shí)，可使eNOS解偶聯(lián)［18］。其次，NO生物利用度降低也是氧化應(yīng)激造成的結(jié)果。硝酸異山梨酯通過清除過氧亞硝酸鹽替代NO防止有機(jī)硝酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激［12］；NO的過量生成和過氧亞硝酸鹽的生成可導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶-2的激活，降解肌鈣蛋白，改善MIRI［19］。綜上，氧化應(yīng)激會(huì)開啟eNOS氧化還原開關(guān)并加重MIRI。

3.3 炎性反應(yīng) MIRI 可導(dǎo)致廣泛的炎性反應(yīng)，使細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α 及白細(xì)胞介素1、2、6、8和18，黏附分子如血管細(xì)胞黏附因子1、細(xì)胞間黏附分子1和E-選擇素表達(dá)增強(qiáng)，介導(dǎo)白細(xì)胞滾動(dòng)、黏附和跨內(nèi)皮遷移，并引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［14］。降低eNOS啟動(dòng)子活性后可表現(xiàn)為促炎和促凝狀態(tài)，eNOS表達(dá)和活性降低是對(duì)炎癥、免疫或代謝損傷的反應(yīng)，也是內(nèi)皮功能障礙的特征性表現(xiàn)［20］。一種多功能細(xì)胞黏附分子已被證明可維持eNOS 活性和NO 生物利用度，并調(diào)節(jié)炎癥過程中白細(xì)胞的外滲［10］。此外，氧化應(yīng)激和缺氧也可以誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。維生素D通過抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，上調(diào)eNOS 活性來抑制炎性反應(yīng)［13］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)充四氫生物喋呤可使eNOS 活性增加，降低缺血后心肌中性粒細(xì)胞的激活，改善心肌血流灌注。肼丙嗪通過減少炎癥因子釋放，減輕MIRI 和細(xì)胞凋亡［21］。糖尿病可增加MIRI 中白細(xì)胞浸潤，促使左心室功能不全和梗死面積擴(kuò)大［17］。其次，eNOS產(chǎn)生的NO，可維持內(nèi)皮與周圍組織之間的穩(wěn)態(tài)，并作為一種有效的抗炎劑，抑制白細(xì)胞與血管壁的相互作用，從而減少病理性炎癥和血栓形成。在eNOS 基因敲除MIRI 小鼠模型中，白細(xì)胞與血管壁的黏附率提高了10 倍，增加NO 后可抑制炎癥反應(yīng)［6］。綜上，增加eNOS 活性可抑制炎性反應(yīng)，減輕MIRI和心肌細(xì)胞凋亡。

4 eNOS介導(dǎo)的信號(hào)通路與MIRI的關(guān)系

4.1 磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）/eNOS 信號(hào)通路 PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路是激活eNOS、調(diào)節(jié)NO水平的主要信號(hào)通路。eNOS 主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞，是Akt 的下游因子，Akt 使eNOS Ser1177 磷酸化，誘導(dǎo)NO 產(chǎn)生［22］。氫嗎啡后處理通過激活該通路，增加Akt 和eNOS 的磷酸化，上調(diào)總NO 和硝基酪氨酸的水平，發(fā)揮治療MIRI 的作用。高膽固醇血癥可以下調(diào)eNOS 的表達(dá)，減少NO 的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙，影響冠脈功能［23］。現(xiàn)有證據(jù)表明，PI3K/Akt/eNOS 信號(hào)通路通過各種干預(yù)措施（如延遲預(yù)處理、右美托咪定和黃芩苷的應(yīng)用）在心臟保護(hù)機(jī)制中起重要作用。在氧化應(yīng)激方面，MIRI 期間外周阻力血管中過量的活性氧和活性氮可使PI3K /Akt/eNOS 通路變鈍，引發(fā)內(nèi)皮功能障礙。缺血預(yù)處理通過消除活性氧來減弱由過氧亞硝酸鹽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)酪氨酸硝化作用，并激活該通路保護(hù)內(nèi)皮。eNOS基因敲除后可以顯著增加心肌對(duì)MIRI的敏感性，并消除缺血預(yù)處理的保護(hù)效應(yīng)。異黃酮通過激活該通路改善MIRI并減弱的氧化應(yīng)激。在細(xì)胞凋亡方面，肼丙嗪預(yù)處理不僅能阻斷MIRI 誘導(dǎo)的PI3K、Akt 和eNOS 的磷酸化，還通過該通路抑制心肌細(xì)胞凋亡［21］。在炎性方面，激活該同路可增加Akt、eNOS 的磷酸化和NO的生物利用度，減少下游炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用［24］。遂該通路在MIRI 中可發(fā)揮抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激作用。

4.2 SIRT1/eNOS 信號(hào)通路 SIRT1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙酰酶，參與氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡、分化和衰老的調(diào)節(jié)。與正常心臟相比，MIRI 時(shí)心肌組織SIRT1 表達(dá)降低，SIRT1 過表達(dá)時(shí)可減輕MIRI，所以SIRT1使心臟對(duì)MIRI更具抵抗力。SIRT1 是一種強(qiáng)大的調(diào)節(jié)劑，用于維持eNOS功能和活性形式。SIRT1 與eNOS 具有協(xié)同作用，抑制SIRT1 活性可使eNOS 乙酰化并抑制eNOS 活性。SIRT1 可增強(qiáng)糖尿病患者心臟中eNOS 磷酸化，減輕MIRI 和氧化應(yīng)激［25］。SIRT1 并不是eNOS 的直接上游，SIRT1 通過脫乙?；嚢彼?96、506 來激活eNOS，使NO 水平升高，增強(qiáng)eNOS 抗氧化應(yīng)激能力［26］。在大鼠心肌梗死模型中，咖啡酸鄰硝基苯乙酯通過SIRT1/eNOS/核因子-κB 途徑減少腫瘤壞死因子-α 釋放和膠原沉積，激發(fā)SIRT1 和eNOS 的表達(dá)，增強(qiáng)NO 釋放并抑制核因子-κB 信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低丙二醛水平和細(xì)胞壞死，發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、纖維化和壞死細(xì)胞增多癥來改善MIRI，并在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型中抑制細(xì)胞凋亡和活性氧產(chǎn)生來減輕MIRI［27］。姜黃素通過激活SIRT1 信號(hào)通路減輕MIRI誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷。同樣，白藜蘆醇通過激活SIRT1 而減少M(fèi)IRI，而煙酰胺（SIRT1抑制劑）以劑量依賴的方式加重心肌細(xì)胞凋亡，表明SIRT1 可以減輕心肌細(xì)胞凋亡。SIRT1 刺激核因子-κB、eNOS 脫乙?；?，導(dǎo)致核因子-κB 轉(zhuǎn)錄受抑制，使eNOS 活性被促進(jìn)［27］。此外，SIRT1/eNOS 軸是血管衰老的潛在靶標(biāo)，血管老化伴隨著eNOS 表達(dá)或活性降低。與成年人相比，老年人的eNOS 蛋白水平降低，但老年人和兒童之間的eNOS 水平?jīng)]有顯著差異。人源性激肽釋放酶結(jié)合蛋白通過該信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)過氧化氫產(chǎn)生，解除對(duì)eNOS 和SIRT1 的抑制，發(fā)揮抗衰老和抗氧化作用［28］。遂該通路有抗炎、抗凋亡、抗衰老及抗氧化應(yīng)激作用。

4.3 腺苷單磷酸活化蛋白激酶（AMPK）/eNOS/NO信號(hào)通路 AMPK 是一種被視為記錄細(xì)胞能量水平“電量計(jì)”的關(guān)鍵激酶，廣泛表達(dá)于大腦、心臟、卵巢和子宮以及其他組織中，也是啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵分子。eNOS Ser1177 是AMPK 的底物。激活A(yù)MPK/eNOS信號(hào)通路可加速生成新生血管，特別是在缺血應(yīng)激條件下。AMPK 活化后使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS 直接磷酸化并發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮功能作用。AMPK/eNOS通路也參與缺血性心肌的血管保護(hù)。AMPK 通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬、減弱內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)激以及通過eNOS介導(dǎo)的NO 產(chǎn)生來減少心肌耗氧量，從而促進(jìn)缺血性心肌存活［29］。在MIRI過程中，長期過量或過少的NO代謝產(chǎn)物均對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。NO是否作為斑塊進(jìn)展的保護(hù)劑，取決于其濃度、伴隨的介質(zhì)和斑塊發(fā)展的階段。NO 通過抑制低密度脂蛋白氧化，高密度脂蛋白通過載脂蛋白A 介導(dǎo)對(duì)清道夫受體B 型功能的作用，增加NO 的產(chǎn)生［30］。NO 的生物利用度可被eNOS 表達(dá)或活性的減少影響，如eNOS解偶聯(lián)產(chǎn)生O2-，以及通過與O2-反應(yīng)降解NO，導(dǎo)致ONOO-形成，降低NO 的生物利用率［29］。在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中，缺血后處理通過AMPK/eNOS信號(hào)通路增加eNOS 和AMPK 的磷酸化來減輕MIRI。在小鼠心肌梗死模型中，缺血后處理可減少心肌梗死面積并改善心室重構(gòu)。所以該通路通過保護(hù)內(nèi)皮、穩(wěn)定斑塊、調(diào)脂和抗氧化應(yīng)激來減輕MIRI。盡管增加eNOS 有益磷酸化和減少解偶聯(lián)，有減少內(nèi)皮功能障礙、抗氧化應(yīng)激和抗炎作用，并通過PI3K/Akt/eNOS、SIRT1/eNOS、AMPK/eNOS/NO 等信號(hào)通路減輕MIRI，但目前仍需多種治療方法聯(lián)合作用治療MIRI，還需深入探究MIRI 的發(fā)生機(jī)制及涉及通路、調(diào)控靶點(diǎn)指導(dǎo)臨床治療。研究eNOS 及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在MIRI的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用，對(duì)防治MIRI具有重要意義。