馬 君，楊延龍，師維軍，汪鵬龍，鄭巨云，郭仁松，胡文冉，楊 洋

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所, 烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院庫車陸地棉試驗站，新疆庫車 842000；3.新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】陸地棉適應性廣且產(chǎn)量高，而海島棉高抗黃萎病且纖維品質(zhì)優(yōu)良，但是產(chǎn)量偏低、生育期長[1]。利用海島棉優(yōu)良的纖維品質(zhì)性狀，將其優(yōu)良基因?qū)腙懙孛蓿嘤鲞m應性廣、產(chǎn)量高且纖維品質(zhì)優(yōu)良的陸海漸滲系，是對陸地棉進行優(yōu)良性狀改良的有效方法[2]。在陸地棉高產(chǎn)的基礎(chǔ)上對其進行纖維品質(zhì)的改良也成為當前棉花育種的重要研究方向[3]。棉花的纖維品質(zhì)是由多基因控制的數(shù)量性狀，受環(huán)境因素影響較大，普遍存在基因型與環(huán)境的互作，且與產(chǎn)量構(gòu)成因素存在負相關(guān)等，遺傳機制較復雜[4]。常規(guī)遺傳育種方法在提高陸地棉產(chǎn)量、改良纖維品質(zhì)的過程中起到了重要作用，培育了大面積推廣的優(yōu)良品種。種內(nèi)雜交選育中骨干親本的集中使用和長期的人工選擇會導致陸地棉遺傳基礎(chǔ)狹窄[5-6]。有效發(fā)掘利用海島棉優(yōu)異性狀基因，對拓寬陸地棉栽培種遺傳基礎(chǔ)有重要意義。【前人研究進展】分子標記技術(shù)的快速發(fā)展為標記輔助選擇和QTL聚合育種提供了條件，可以從目標性狀的分子水平上進行選擇，有利于提高表型性狀選擇的準確性，也是提高作物遺傳改良及育種進程的有效途徑[7]。通過構(gòu)建連鎖遺傳圖譜，與棉花纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL(Quantitative trait locus)可以在染色體組上準確定位，通過分子標記輔助選擇育種減少常規(guī)育種選擇的盲目性[2]。目前對陸地棉與海島棉優(yōu)勢結(jié)合進行棉花纖維品質(zhì)性狀QTL定位做了許多研究，構(gòu)建了連鎖遺傳圖譜，并檢測到大量與纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL位點[2,8-14]?！颈狙芯壳腥朦c】優(yōu)良陸海漸滲系群體是基因聚合、QTL定位等研究的理想材料，需研究利用與纖維品質(zhì)緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇育種?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選用早中熟陸地棉品種新陸中60號為母本與優(yōu)質(zhì)抗病海島棉品種新海41號為父本進行雜交，并以新陸中60號為輪回親本構(gòu)建回交群體BC1F2。利用SSR分子標記，對陸海漸滲雜交BC1F2分離群體進行基因型分型，構(gòu)建陸海雜交的遺傳連鎖圖譜，種植BC1F2家系群體，測定纖維品質(zhì)性狀，利用區(qū)間作圖法對纖維品質(zhì)性狀進行QTL定位，檢測與棉花優(yōu)質(zhì)纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的穩(wěn)定QTL位點，為海島棉優(yōu)良基因定位和利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2014年在庫車陸地棉試驗站，利用高純系陸地棉品種新陸中60號為母本與優(yōu)質(zhì)海島棉品種新海41號為父本雜交，獲得F1種子，2015年再以新陸中60號為輪回親本與F1回交獲得BC1F1群體種子。

2018年在庫車陸地棉試驗站種植新陸中60號、新海41號及BC1F2分離群體，在棉花現(xiàn)蕾期取幼嫩葉片采樣后立即用液氮速凍，親本材料隨機各選5株采樣，BC1F2群體選取190株采樣。獲得151份前期已采樣的BC1F2群體。

1.2 方 法

1.2.1 纖維相關(guān)性狀的調(diào)查

于2018年10月田間取樣，在BC1F2群體中選取已標記過的151個單株收花，軋花后取15～20 g纖維樣品送農(nóng)業(yè)農(nóng)村部棉花品質(zhì)監(jiān)督測試中心進行品質(zhì)檢測，檢測指標包括纖維長度、纖維強度、馬克隆值、整齊度和伸長率。

1.2.2 SSR分子標記檢測與PCR 擴增

棉花基因組DNA的提取參照宋國立等[15]改良的CTAB法，其中純化 DNA的操作步驟略作改進，用紫外分光光度計測定DNA濃度。SSR的分析流程參照李立群等[16]方法，優(yōu)化體系參照許玉蘭等[17]的方法，確定最佳反應體系為15 μL體系，模板DNA(5 ng/μL)1 μL，正反引物各1 μL(濃度為10 μmol/mL)，2×PCR mix 7.5 μL(加拿大應用生物材料有限公司(abm Inc.)的2×PCR mix)，dd H2O 4.5 μL。反應程序：94℃ 5 min；95℃ 15 min；Tm 15 s；72℃15 min；30個循環(huán)；72℃10 min；退火溫度(Tm)根據(jù)引物進行調(diào)節(jié)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計SSR多態(tài)性標記，在BC1F2群體中與母本新陸中60號相同的條帶記為A，與父本新海41號相同的條帶記為B，具有雙親性狀的條帶記為H，BC1F2代中有而雙親中都沒有的條帶記為D，缺失數(shù)據(jù)記為-。使用Join Map 4.0軟件構(gòu)建SSR標記遺傳連鎖圖譜，連鎖的最低LOD值為3.0，最大遺傳距離為50 cM，作圖函數(shù)采用Kosambi函數(shù)。采用QTL分析軟件Windows QTL Cartographer 2.5，選用復合區(qū)間作圖(composite interval mapping，CIM)方法，進行纖維相關(guān)性狀的QTL定位和效應檢測，QTL命名方法按照 QTL(q)+性狀(英文縮寫)+染色體(chr)+QTL個數(shù)(數(shù)字)表示。采用單標記分析(Ici Mapping)方法分析纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳圖譜的構(gòu)建與纖維品質(zhì)性狀的QTL位點

研究表明，共獲得105對差異明顯的多態(tài)性引物，其中有23對引物不能檢測出BC1F2代的基因分離，多態(tài)性頻率為42.17%。構(gòu)建了一個包含52個標記、14個連鎖群的遺傳圖譜，該圖譜總長824 cM，覆蓋棉花基因組的18.5%，最長的連鎖群為150.3 cM，包含6個標記，最短的為0.3 cM，包含2個標記。圖1

2.2 親本及BC1F2家系纖維品質(zhì)性狀

研究表明，兩親本間各性狀差異明顯、范圍適中，海陸漸滲系性狀值(纖維長度, 斷裂比強度和伸長率)均高于親本新陸中60號，而馬克隆值和纖維整齊度相對偏低。各項纖維指標在BC1F2家系群體中均呈連續(xù)分布，這些性狀都受多基因控制的數(shù)量性狀，其中，纖維長度略超親本，存在超親分離。纖維品質(zhì)各項指標除伸長率外，偏度都小于1，符合典型的數(shù)量性狀正態(tài)分布特征。表1

圖1 遺傳圖譜與纖維品質(zhì)性狀的 QTL 位點Fig.1 Linkage map and QTL location of fiber quality traits

表1 親本及BC1F2家系纖維品質(zhì)性狀Table 1 Analysis of fiber quality in parent and BC1F2 population

2.3 BC1F2群體纖維品質(zhì)性狀的相關(guān)性

研究表明，BC1F2群體纖維品質(zhì)各性狀間存在著復雜的相關(guān)性，纖維長度與纖維整齊度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.552；纖維長度與馬克隆值呈極顯著負相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為-0.534；斷裂比強度與纖維整齊度和伸長率呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.872與0.983；纖維整齊度和伸長率呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.908。存在正相關(guān)的各纖維品質(zhì)之間可相互促進提高，存在負相關(guān)的各纖維品質(zhì)之間相互制約不可能同步提高。表2

2.4 纖維品質(zhì)性狀的QTL定位

研究表明，檢測到與纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL位點1個，該位點與纖維長度相關(guān)，位于Chr14的32.31 cM處，標記區(qū)間位于BNL1905-BNL3502，LOD值為2.0，加性效應-0.96，顯性效應0，解釋表型變異8.59%；檢測到與馬克隆值相關(guān)的單標記位點1個，引物名稱為NAU1119，位于Chr26上，LOD值為3.0，加性效應-0.15，顯性效應3.7，解釋表型變異8.88%。表2

表2 BC1F2群體纖維品質(zhì)性狀相關(guān)性Table 2 Analysis of correlation among fiber quality in BC1F2 population

3 討 論

海島棉和陸地棉是2個主要的異源四倍體栽培種，在產(chǎn)量、纖維品質(zhì)和生態(tài)適應性等方面存在可互補性[18]。研究選用高純系主推的陸地棉品種新陸中60號為母本與優(yōu)質(zhì)海島棉品種新海41號為父本進行雜交構(gòu)建作圖群體，將二者優(yōu)良特性優(yōu)勢結(jié)合，實現(xiàn)產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的同步提高。選取249對分布于棉花全基因組的SSR分子標記進行多態(tài)性篩選，共獲得105對差異明顯的多態(tài)性引物。當前開發(fā)的棉花分子標記引物多來自海陸群體，遺傳連鎖圖譜的加密主要依賴于開發(fā)的引物數(shù)量和親本遺傳基礎(chǔ)的差異大小。棉花海陸群體QTL定位研究趨于飽和。張正圣等[19]利用陸地棉種間雜交(渝棉1號×T586)F2群體，構(gòu)建了一張包括173個標記位點(159個SSR,11個AFLP和3個形態(tài)標記)的遺傳連鎖圖，覆蓋1 360 cM，約占棉花基因組的3.06%。Ullao等[20]利用陸地棉種內(nèi)雜交(MD5678ne-×Prema)F2群體構(gòu)建的連鎖圖，包括17個連鎖群，81個RFLP 位點，標記間的平均距離8.7 cM，覆蓋700.7 cM，約占棉花基因組的15.8%。

因多效現(xiàn)象在自然界生物進化遺傳中普遍存在，在多環(huán)境多群體中獲得的 QTL位點往往有較高的穩(wěn)定性和精確度。所獲得的1個位點在相關(guān)文獻中已有報道，qFL-14-1與qFM-14-1[21-22]、q FS-14-1[22-24]及q FU-14-1[2]在同一位點，效應不同，該位點對應的等位基因有可能連鎖遺傳，或者是一因多效[24]。在不同群體不同環(huán)境下定位到的QTL，能更準確地反映控制棉花纖維品質(zhì)性狀的等位基因的位置，環(huán)境因素對數(shù)量性狀位點的檢測影響很大。

4 結(jié) 論

共獲得105對差異明顯的多態(tài)性引物。篩選的與優(yōu)質(zhì)性狀相關(guān)SSR標記可應用于棉花優(yōu)質(zhì)分子標記輔助選擇上。檢測到與纖維長度相關(guān)的QTL位點1個，位于Chr14的32.31 cM處，解釋表型變異8.59%。檢測到與馬克隆值相關(guān)的位點1個，位于Chr26上，解釋表型變異8.88%。