補 娟, 紀國慶, 葉勒丹·馬漢, 王兆霞, 吳選霞, 牛曉珊

腦卒中是一種高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的疾病,并成為我國第一位致死病因。腦卒中分為缺血性卒中和出血性卒中,其中80%為缺血性卒中[1]。目前缺血性卒中的策略是盡早再通血管,挽救缺血半暗帶。循證醫(yī)學(xué)最為有效的方式是重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)溶栓,但是由于其嚴格的時間窗,臨床患者只有3%～5%能從中獲益[2]。也有報道稱銀杏黃酮苷元、丙泊酚和β-雌二醇等通過調(diào)節(jié)多種信號通路直接減輕卒中后的神經(jīng)元損傷。因此,合理開發(fā)新的神經(jīng)保護劑來減輕卒中引起的神經(jīng)元損傷,可能會產(chǎn)生更好的治療缺血性卒中的方法。

刺槐素(Acacetin)是一種可從雪蓮等植物中提取獲得的黃酮類化合物,具有抗氧化作用和抗炎癥效應(yīng)[3～5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)刺槐素能抑制NLRP3的激活,對小鼠腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用[6]。有研究表明自噬可負向調(diào)控NLRP3炎癥小體[7,8],減輕炎癥反應(yīng),刺槐素能否通過自噬調(diào)節(jié)ROS的釋放進而調(diào)控NLRP3炎癥小體的活化。

本研究建立小鼠小膠質(zhì)細胞OGD模型,給予刺槐素進行干預(yù),研究觀察刺槐素對氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)損傷后細胞的存活和死亡情況,分析刺槐素對活性氧(reactive oxygen species,ROS)、自噬相關(guān)蛋白LC3、beclin-1和NLRP3信號通路的表達,闡明刺槐素是否通過自噬/ROS/NLRP3通路發(fā)揮保護作用,為將來刺槐素發(fā)展成為理想的腦卒中治療藥物提供了實驗依據(jù)和學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 BV2細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司;DMEM-高糖培養(yǎng)基、DMEM-無糖培養(yǎng)基、胎牛血清購于GIBCO公司;MTT購于BIOFROX公司;LDH試劑盒購于南京建成生物工程研究所;DHE細胞ROS檢測試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng) BV2細胞在含10%FBS、青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞的密度達到80%時,對細胞進行傳代,取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞進行試驗。將細胞分為：正常對照組、OGD模型組和OGD+Acacetin組。刺槐素用含0.1%的二甲亞砜稀釋(dimethyl sulfoxide,DMSO)。

1.2.2 OGD模型建立和藥物干預(yù) 參照文獻[9]制備OGD模型。取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的BV2細胞,以5×105個/孔,接入6孔板,37 ℃培養(yǎng)過夜;將完全培養(yǎng)基換成無糖的DMEM培養(yǎng)基,置入?yún)?shù)預(yù)先設(shè)置好的三氣培養(yǎng)箱(氣體參數(shù)設(shè)置為：1% O2、94% N2、5%CO2),O2濃度降至1%時開始計時,穩(wěn)定3 h后,將無糖的DMEM培養(yǎng)基換成含10% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基,并置于正常(氣體參數(shù)設(shè)置為：21% O2、74% N2、5%CO2)的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。藥物干預(yù)組在OGD前30 min、OGD時以及OGD 后24 h在培養(yǎng)基中加入10 μmol/L的刺槐素。

1.2.3 MTT檢測 細胞培養(yǎng)所需時間后,加入5 mg/ml MTT溶液,37 ℃避光培養(yǎng)4 h,吸出培養(yǎng)基,加入150 μl DMSO震蕩10 min,酶標儀測定各孔吸光值OD 568。細胞存活率=(測試組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4 LDH檢測 復(fù)氧24后收集細胞上清液,按LDH試劑盒說明書操作。波長450 nm,酶標儀測定各孔吸光度OD值。以對照組LDH漏出率為100%,計算各組LDH漏出的相對百分比。

1.2.5 ROS檢測 用0.25%胰酶消化細胞,終止消化后收集,1000 rpm,5 min離心,去上清,加PBS重懸;用PBS將細胞潤洗兩次,1000 rpm,5 min離心;按照DHE細胞ROS檢測試劑盒操作說明進行：去掉PBS后加入稀釋好的DHE 1 ml; 37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min,每隔3 min混勻一次;用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次;流式細胞儀上機檢測。

1.2.6 Western blot檢測 細胞樣本棄細胞上清后六孔板每孔加入120 μl RIPA裂解液提取蛋白,采用BCA微量法測定蛋白濃度。按照體積比加入5x蛋白上樣緩沖液,沸水中進行沸水浴10 min,取出后-80 ℃冰凍保存。取40 μg樣品,SDS PAGE凝膠電泳。電泳條件：濃縮膠80 V,分離膠100 V。電泳結(jié)束后,將膠上蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。膜用5%牛血清白蛋白室溫下封閉2 h,分別加入β-actin(1∶5000)、LC3 (1∶1000)、beclin-1 (1∶1000)、caspase-1(1∶1000)、IL-1β(1∶1000)、NLRP3(1∶1000)抗體,4 ℃孵育過夜。TBST洗滌10 min×3次,加入相應(yīng)的二抗抗體(1∶5 000),室溫下孵育2 h。TBST洗滌10 min×3次,將ECL試劑中增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻,滴加工作液于PVDF膜上, X光膠片顯影、定影,掃描膠片,用Band Scan分析膠片灰度值。以目的基因條帶吸光度/β肌動蛋白條帶吸光度比值計算相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 刺槐素對OGD/R后小膠質(zhì)細胞存活和死亡的影響 我們首先在體外驗證刺槐素對OGD誘導(dǎo)的BV2細胞損傷的保護作用,檢測了細胞的存活和乳酸脫氫酶的漏出情況。研究發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,OGD模型組細胞存活率顯著降低(P<0.001),LDH漏出率顯著增加(P<0.01);給予刺槐素治療后,細胞存活率顯著升高(P<0.01),LDH漏出率顯著降低(P<0.05)(見圖1)。結(jié)果表明刺槐素具有神經(jīng)保護作用。

與正常對照組相比***P<0.001,**P<0.01;與OGD模型組相比##P<0.01,# P<0.05

2.2 刺槐素對OGD/R后小膠質(zhì)細胞ROS生成的影響 與正常對照組相比,OGD模型組ROS釋放顯著增加(P<0.001),給予刺槐素治療后,ROS釋放顯著降低(P<0.001)(見圖2)。

與正常對照組相比***P<0.001;與OGD模型組相比###P<0.001

2.3 刺槐素對OGD/R后小膠質(zhì)細胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3表達的影響 Western blot結(jié)果顯示,與正常對照組相比,細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1(P<0.001)表達均增加;與OGD模型組相比,給予刺槐素治療后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(P<0.05)和bclin-1(P<0.001)表達均顯著增加(見圖3)。表明刺槐素能激活小膠質(zhì)細胞OGD后的自噬。

與正常對照組相比***P<0.001;與OGD模型組相比#P<0.05,###P<0.001

2.4 刺槐素對OGD/R后小膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體表達的影響 Western blot結(jié)果顯示,各組間Pro-caspse-1和pro-IL-1β表達無顯著差異;與正常對照組相比,OGD組NLRP3、caspase-1和IL-1β表達均顯著增加(均P<0.001),給予刺槐素治療后,NLRP3、caspase-1和IL-1β表達均顯著降低(見圖4)。表明刺槐素能抑制NLRP3炎癥小體的活化。

與正常對照組相比***P<0.001;與OGD模型組相比##P<0.01,###P<0.001

3 討 論

我們前期在動物實驗上發(fā)現(xiàn)刺槐素能夠減少小鼠梗死體積,改善神經(jīng)功能評分[10]。本研究利用小膠質(zhì)細胞在體外建立OGD/R模型,發(fā)現(xiàn)刺槐素可以增加細胞存活率,降低細胞死亡率,體內(nèi)外試驗均證實刺槐素對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

多項研究表明NLRP3炎癥小體參與了腦缺血再灌注損傷,Silverman[11]等人證明抑制NLRP3炎癥小體可以抑制對腦組織的缺血性損傷。Yang[12]等人研究發(fā)現(xiàn),NLRP3-/-小鼠腦缺血對血腦屏障的破壞較少,導(dǎo)致神經(jīng)血管損傷減弱。靜脈注射免疫球蛋白通過抑制NLRP3炎癥體減少缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[13]。所以,阻斷或抑制 NLRP3的激活是治療腦缺血再灌注損傷的有效策略。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)刺槐素可以抑制小膠質(zhì)細胞OGD損傷后的NLRP3、caspase-1和IL-β的表達,說明刺槐素可以抑制OGD誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活。

ROS是最早發(fā)現(xiàn)的觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活事件之一,多個研究揭示抑制ROS[14～16]能抑制NLRP3炎癥小體活化,減輕腦缺血損傷。在本研究中,OGD損傷后,BV2細胞的ROS生成顯著增加,而刺槐素可以抑制OGD損傷后ROS的生成。

越來越多的證據(jù)表明自噬和NLRP3炎癥小體關(guān)系復(fù)雜,一方面,在NLRP3炎性小體激活過程中會促進自噬;另一方面,自噬的過度激活可以抑制NLRP3炎癥體的激活[17]。同時自噬在缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用[18～20]。刺槐素是否通過調(diào)控自噬抑制NLRP3炎癥小體激活,從而對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用,目前尚未見相關(guān)報道。在本研究中,OGD損傷后,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1均增加,表明腦缺血再灌注損傷后自噬被激活,給予刺槐素處理后能激活自噬。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)刺槐素可以通過抑制腦缺血再灌注損傷后ROS的生成,激活自噬,進而抑制NLRP3炎癥小體的激活,對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用。這些發(fā)現(xiàn)為刺槐素的深入研究和利用奠定了基礎(chǔ),同時也為缺血性卒中的臨床治療提供了一種新的有潛力的治療途徑。