摘要：目的 建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定萬古霉素血藥濃度，并結(jié)合藥物代謝動(dòng)力學(xué)/藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)（PK/PD）參數(shù)調(diào)整老年患者給藥方案。方法 將含有萬古霉素的血漿樣品經(jīng)100 μL 的10%高氯酸—甲醇—乙腈（2∶1∶1）混合蛋白處理劑沉淀后，渦旋離心取上清液150 μL于內(nèi)襯管，以乙腈—水（含25 mmol/L磷酸二氫鉀，pH=3.2，V/V=8∶92）為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18 （ 250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm進(jìn)行分析?？疾旆椒ǖ膶傩浴⒕€性、精密度與回收率。同時(shí)根據(jù)患者多劑量靜脈滴注萬古霉素達(dá)穩(wěn)態(tài)后血藥濃度，采用一室模型計(jì)算患者輸注段和消除段相關(guān)PK參數(shù)，建立萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型，結(jié)合患者輸注段、消除段血藥濃度評(píng)價(jià)老年患者中AUC0～24 h/MIC達(dá)標(biāo)情況。結(jié)果 本研究建立的HPLC專屬性強(qiáng)，不易受其他藥物干擾，幾乎無殘留。萬古霉素血藥濃度在1.18～75.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.999 4；日內(nèi)、日間精密度（RSD）值均lt;15%。萬古霉素在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下穩(wěn)定性好，RSD值均lt;15%。本研究建立了便捷的萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型，并將該模型應(yīng)用于多例老年患者調(diào)整用藥方案，調(diào)整后患者臨床指標(biāo)均好轉(zhuǎn)。結(jié)論 本研究建立測(cè)定萬古霉素血藥濃度的HPLC符合生物樣品測(cè)定要求，可用于臨床萬古霉素血藥濃度測(cè)定。同時(shí)，結(jié)合萬古霉素AUC0～24 h/MIC結(jié)果可制定調(diào)整患者給藥方案。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；萬古霉素；血藥濃度；藥物代謝動(dòng)力學(xué)；藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)

doi：10.3969/j.issn.2096-9058.2023.02.005

中圖分類號(hào)：R969" " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " "文章編號(hào)：2096-9058（2023）02-0025-06

Determination of vancomycin drug concentration in plasma by high performance liquid chromatography and clinical application of PK/PD

ZHANG Yan1， HU Qin2， HU Kai3， ZHANG Yingfan4， HUANG Ling1， LUO Rongyao1， HUANG Qi2

1 College of Pharmacy， Dali University， Dali 671000， China；2 Department of Pharmacy， Xiangya Hospital Central South University， Changsha 410008， China；3 Department of Neurology， Xiangya Hospital Central South University， Changsha 410008， China；4 Operating Room， Xiangya Hospital Central South University， Changsha 410008， China

Corresponding Author： HUANG Qi （E-mail： huangqi20021986@163.com）

Abstract： Objective To establish high-performance liquid chromatography （HPLC） method for determining the blood concentration of vancomycin， and to adjust the dosage regimen of elderly patients combined with pharmacokinetics/pharmacodynamics （PK/PD） parameters. Methods After plasma samples containing vancomycin were precipitated with 100 μL of 10% perchloric acid-methanol-acetonitrile （2∶1∶1）， then was vortex and centrifugation， final getting the 150 μL supernatant was taken into the lined tube. The plasma samples containing vancomycin separation and analysis were carried out on Agilent ZORBAX SB-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm） at 40 ℃. The mobile phase was acetonitrile-water （containing 25 mmol/L potassium dihydrogen phosphate， pH = 3.2， V/V = 8 ∶92） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelength was 220 nm. The specificity， linearity， precision， and recovery rate of the method were investigated. According to the blood concentration of patients after muti-dose intravenous infusion vancomycin reached a steady state， and the pharmacokinetic parameters of the infusion segment and elimination segment of patients were calculated. The calculation model of vancomycin AUC0～24 h/MIC based on pharmacokinetic theory was established by adopting one-compartment model. Then combined with the infusion segment and elimination concentration to assess AUC0～24 h/MIC whether up to standard in elderly patients. Results The HPLC method established in this study had strong specificity， less possibility interfered with by other drugs， and almost no residue. The linearity of vancomycin was good in the range of 1.18 to 75.80 μg/mL， R2 = 0.999 4. The intra-day and inter-day RSD were less than 15%. Vancomycin had good stability under the condition of room temperature， 4 ℃ and -20 ℃ which RSD was less than 15%. We established a convenient AUC0～24 h/MIC calculation model. The model was used to adjust the medication of many elderly patients in our hospital， and the results showed that all patients clinical index improved after adjusting the medication plan. Conclusions The established vancomycin HPLC method meets the criterion of biological sample determination which can be used for the determination of clinical vancomycin plasm concentration. Meanwhile， combined with vancomycin AUC0～24 h/MIC results which can formulate and adjust the patient dosage regime of patients.

Key words： high performance liquid chromatography； vancomycin； blood drug concentration； pharmacokinetics； pharmacodynamics

萬古霉素屬于三環(huán)糖肽類抗菌藥物，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有強(qiáng)大的殺滅作用［1］。其殺菌機(jī)制為通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性以及阻止細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)RNA的合成，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)菌的殺滅作用［2-3］。金黃色葡萄球菌為醫(yī)藥學(xué)界關(guān)注的重要病原菌之一，是革蘭陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染，如重癥肺炎、皮膚軟組組感染、心內(nèi)膜炎、菌血癥等［2-3］。萬古霉素對(duì)金黃色葡萄球菌引起各種感染的治療效果較好，并且2021年英國(guó)指南和2011年美國(guó)傳染病協(xié)會(huì)推薦將萬古霉素作為臨床上治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌所致感染的首選用藥［4-5］。萬古霉素治療窗較窄且藥物代謝動(dòng)力學(xué)（PK）特征個(gè)體差異大，體內(nèi)藥物暴露濃度過高會(huì)增加腎毒性與耳毒性不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而濃度過低會(huì)導(dǎo)致治療效果不佳，同時(shí)也可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的發(fā)生，尤其對(duì)特殊人群（老年人、兒童等），則需通過在血藥濃度監(jiān)測(cè)下，在PK和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)（PD）原理的指導(dǎo)下，最大程度地發(fā)揮藥物的治療作用，同時(shí)減少藥物對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)，降低耐藥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［1-3］。臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)萬古霉素輸注段和消除段血藥濃度，并利用AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型得出相關(guān)PK參數(shù)，這對(duì)于制定調(diào)整給藥方案，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化、精準(zhǔn)化用藥至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于萬古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）、酶放大免疫法（EMIT）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、熒光偏振免疫法（FPIA）、熒光免疫層析法（FICA）、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法（CMIA）等［6-8］。研究表明，LC-MS/MS設(shè)備昂貴，儀器操作較復(fù)雜；EMIT、CMIA專屬性差；ELISA、FPIA、FICA操作簡(jiǎn)單易行，但穩(wěn)定性差且成本高。本研究擬通過優(yōu)化HPLC法，建立快速測(cè)定血漿中萬古霉素濃度的方法，以期建立快速、準(zhǔn)確、全面、可靠的HPLC測(cè)定方法用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)；同時(shí)根據(jù)PK理論基礎(chǔ)，建立了萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型，為臨床制定和調(diào)整患者給藥方案提供參考。

1" 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1260（HPLC7111A四元泵、G7129A自動(dòng)進(jìn)樣器、G7116A柱溫箱、G7115A二級(jí)陣列管檢測(cè)器）；TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；Mini-14K高速離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）；MS205DU半微量電子天平（METTLER TOLEDO國(guó)際有限公司）；pHS-3C型酸度計(jì)（上海盛磁儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑 萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130360-202103）；去甲萬古霉素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130338-201704）。乙腈（色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆涣姿岫溻洠ǚ治黾?，?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純化水（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院自制）；磷酸、高氯酸、甲醇、乙腈均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈—水（含25 mmol/L磷酸二氫鉀，pH=3.2，V/V=8∶92）；流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為40 ℃。

1.2.2 流動(dòng)相配置 稱取磷酸二氫鉀3.4 g，用純化水溶解后配置成1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.2，即得濃度為25 mmol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液。

1.2.3 蛋白沉淀劑的配置 將10%高氯酸—甲醇—乙腈按2∶1∶1進(jìn)行混合配置。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置 精密稱取0.037 9 g萬古霉素于25 mL容量瓶，以純化水溶解后定容，搖勻，即得濃度為1 516 μg/mL的萬古霉素儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱保存，臨用時(shí)用純化水稀釋成濃度分別為11.84、23.69、47.38、94.75、189.50、379、758 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。精密稱取0.041 9 g去甲萬古霉素于25 mL容量瓶，以純化水溶解后定容，搖勻，即得濃度為1 470 μg/mL的去甲萬古霉素儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱保存，并用純化水稀釋成濃度為183.75 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.5 血漿樣品預(yù)處理 取含有萬古霉素的待測(cè)樣品200 μL于1.5 mL EP管中，加入上述1.2.3蛋白處理液100 μL渦旋1 min，14 500 r/min，離心8 min，取上清液150 μL于內(nèi)襯管，10 μL進(jìn)樣分析。

1.2.6 萬古霉素專屬性考察 取空白血漿、萬古霉素和去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品混合液、萬古霉素和去甲萬古霉素血漿混合液各200 μL經(jīng)1.2.5方法處理后進(jìn)行分析。

1.2.7 萬古霉素干擾和殘留實(shí)驗(yàn) 根據(jù)我院臨床聯(lián)合用藥現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)主要考察了美羅培南和伏立康唑?qū)θf古霉素的干擾。按1.2.1色譜條件分別測(cè)定美羅培南、伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液。同時(shí)，將萬古霉素、去甲萬古霉素和實(shí)驗(yàn)室已知濃度的美羅培南、伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品混合于血漿中，經(jīng)1.2.5方法處理后，按1.2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定考察聯(lián)合用藥對(duì)該方法的干擾。取濃度為758 μg/mL萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液與血漿混合稀釋成濃度為75.8 μg/mL，將該樣品和空白血漿按照1.2.5進(jìn)行處理，依次進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.8 萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密移取160 μL空白血漿至1.5 mL EP管中，加入183.75 μg/mL去甲萬古霉素20 μL，加入1.2.4項(xiàng)下配置的萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)液各20 μL，使萬古霉素血漿終濃度為1.18、2.37、4.74、9.48、18.95、37.90、75.80 μg/mL，按1.2.5方法進(jìn)行處理。以萬古霉素與去甲萬古霉素的峰面積比為Y軸，血漿中萬古霉素濃度為X軸，進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.9 精密度和回收率計(jì)算 精密移取160 μL空白血漿，加入萬古霉素、去甲萬古霉素各20 μL，萬古霉素為低、中、高濃度（濃度分別為2.37、18.95、37.90 μg/mL），按照1.2.5方法進(jìn)行處理，低、中、高3個(gè)濃度日內(nèi)分別平行測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度（RSD）。連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間RSD。相同方法配置萬古霉素低、中、高濃度，按照1.2.5進(jìn)行處理，平行測(cè)定5次，將該方法下檢測(cè)所得藥物濃度除以實(shí)際配置的濃度，計(jì)算回收率。

1.2.10 穩(wěn)定性檢測(cè) 取含有萬古霉素的低、中、高血漿質(zhì)控標(biāo)本各3份。2份分別置于室溫、4 ℃下24、48 h重復(fù)測(cè)定；1份置于-20 ℃冰箱冰凍保存5、10、15 d后測(cè)定濃度，考察樣品穩(wěn)定性。每次對(duì)低、中、高3個(gè)濃度樣品平行測(cè)定5次。

1.2.11 萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型建立 根據(jù)藥動(dòng)學(xué)的相關(guān)文獻(xiàn)［9-10］，建立萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型。采用一室模型對(duì)患者多劑量靜脈滴注萬古霉素達(dá)穩(wěn)態(tài)后，在Excel編制的萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型中，輸入患者的劑量、給藥間隔、輸注時(shí)間、最小抑菌濃度、輸注段血藥濃度、消除段血藥濃度，擬合出患者血藥濃度隨時(shí)間變化曲線。采用最小二乘法設(shè)置目標(biāo)函數(shù)（OFV）為實(shí)測(cè)血藥濃度和擬合血藥濃度的方差，進(jìn)行線性擬合計(jì)算清除速率常數(shù)（Ke）和表觀分布容積（Vd），帶入公式計(jì)算患者AUC0～24 h/MIC值。

（Dose： 給藥劑量；t：整個(gè)給藥時(shí)間間隔內(nèi)任意時(shí)刻；Tin：輸注時(shí)間；τ：給藥間隔；MD：維持劑量，如1 g每12 h一次則為1 g）據(jù)中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)研究，為大范圍覆蓋對(duì)萬古霉素敏感的革蘭陽(yáng)性菌，推薦MIC經(jīng)驗(yàn)值為0.5，1.0，指南推薦AUC0～24 h/MIC范圍為400～600［11-13］。

2" 結(jié)果

2.1 萬古霉素專屬性考察結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)條件下，萬古霉素和去甲萬古霉素與血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)分離情況良好、峰型良好，空白血漿中無干擾雜質(zhì)峰。萬古霉素和去甲萬古霉素的保留時(shí)間分別為16.5、12.0 min。

2.2 聯(lián)合用藥和高濃度殘留對(duì)萬古霉素測(cè)定的影響 在1.2.1色譜條件下美羅培南和伏立康唑出峰時(shí)間分別為12.5、4.5 min，采用1.2.5方法處理后，美羅培南、伏立康唑未出峰，表明對(duì)萬古霉素和去甲萬古霉素?zé)o干擾。殘留實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度的萬古霉素進(jìn)樣后再進(jìn)行空白血漿的測(cè)定，空白血漿中萬古霉素的殘留低于其定量下限的1%，表明本方法幾乎無殘留。

2.3 萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系 萬古霉素在1.18～75.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.051 8X-0.008 7，R2=0.999 4；萬古霉素的定量下限為1.18 μg/mL，檢測(cè)限為0.59 μg/mL。

2.4 萬古霉素精密度和回收率 萬古霉素低、中、高3個(gè)濃度日內(nèi)RSD分別為1.51%、0.33%、0.22%，日間RSD分別為10.41%、6.97%、7.90%，均lt;15%，表明精密度好，數(shù)據(jù)集中。萬古霉素低、中、高3個(gè)濃度回收率分別為92.40%、97.09%、93.94%，位于85%～115%，準(zhǔn)確度較高。

2.5 萬古霉素穩(wěn)定性考察結(jié)果 萬古霉素低、中、高3個(gè)濃度室溫、4 ℃、-20 ℃穩(wěn)定性結(jié)果顯示，在以上條件下萬古霉素的RSDlt;15%，表明萬古霉素在上述條件下穩(wěn)定性好，見表1～3。

2.6 萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算及臨床應(yīng)用 患者男，63歲，主因“右側(cè)開顱術(shù)后40 d余，傷口處出現(xiàn)少量膿性分泌物”，診斷為“顱內(nèi)感染”收治入院。患者體溫36.6 ℃，呼喚無應(yīng)答，言語(yǔ)不能，異常面容，表情呆滯，神志淺昏迷。既往發(fā)生過多次“腦梗死”，口服華法林治療；有高血壓、房顫病史；吸煙30年，至今戒煙7年；其他無特殊。經(jīng)會(huì)診后，經(jīng)驗(yàn)性使用“美羅培南、萬古霉素”進(jìn)行抗感染治療。經(jīng)家屬同意后，采用本研究建立的HPLC對(duì)患者血藥濃度進(jìn)行測(cè)定，通過血藥濃度值擬合計(jì)算出患者個(gè)體化Ke和Vd，帶入AUC0～24 h計(jì)算公式，得出患者AUC0～24 h/MIC。萬古霉素劑量為1.0 g，每12 h一次，用藥達(dá)穩(wěn)態(tài)后分別于下一次給藥后1 h、給藥前0.5 h采集患者血樣做為萬古霉素輸注段和消除段血藥濃度。經(jīng)本法測(cè)定得萬古霉素給藥后1 h濃度為17.018 μg/mL；給藥前0.5 h濃度為5.109 μg/mL；計(jì)算得出該患者AUC0～24 h/MIC為469，235。臨床藥師建議可以增加劑量至1.0 g，每8 h一次，同時(shí)應(yīng)警惕萬古霉素的腎損害?；颊哐帩舛染€性擬合圖見圖1。

調(diào)整劑量前患者體溫38 ℃，白細(xì)胞計(jì)數(shù)13.59×109/L，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)12.57×109/L，中性粒細(xì)胞百分比92.5%，降鈣素原0.99 ng/mL。醫(yī)生結(jié)合患者的情況以及臨床藥師的建議，調(diào)整萬古霉素的給藥方案為1.0 g，每8 h一次。調(diào)整劑量后患者的各項(xiàng)指標(biāo)：體溫37.1 ℃，白細(xì)胞計(jì)數(shù)12.82×109/L，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)11.65×109/L，中性粒細(xì)胞百分比90.8%，降鈣素原0.11 ng/mL。與調(diào)整劑量前各項(xiàng)指標(biāo)有下降趨勢(shì)，肝腎功能無顯著變化。痰液、腦脊液培養(yǎng)結(jié)果均為肺炎克雷伯菌，停用萬古霉素。后續(xù)采用美羅培南2.0 g，每8 h一次，多粘菌素B 15萬單位，每8 h一次霧化吸入，多粘菌素B 5萬單位，每天一次鞘內(nèi)注射，阿米卡星頭部引流管每天一次注藥30 mg進(jìn)行抗感染治療?；颊叩捏w溫、降鈣素原、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)至正常。同時(shí)對(duì)我院使用萬古霉素的其他患者采用該方法測(cè)定并計(jì)算了萬古霉素AUC0～24 h/MIC，對(duì)于PK參數(shù)未達(dá)標(biāo)或超標(biāo)的患者進(jìn)行了給藥方案的調(diào)整，調(diào)整給藥方案后患者的炎癥指標(biāo)和臨床癥狀均明顯好轉(zhuǎn)?；颊哐帩舛缺O(jiān)測(cè)資料見表4。

3" 討論

3.1 萬古霉素HPLC方法流動(dòng)相比例和內(nèi)標(biāo)的選擇 有機(jī)相、緩沖鹽比例的改變和流動(dòng)相pH的變化會(huì)影響藥物在色譜體系中的保留時(shí)間。查閱相關(guān)文獻(xiàn)［1，6-8］，萬古霉素檢測(cè)流動(dòng)相選擇多數(shù)選用甲醇—磷酸二氫鉀、乙腈—磷酸二氫鉀進(jìn)行梯度或等度洗脫，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)中的色譜峰型相關(guān)數(shù)據(jù)和保留時(shí)間，最終確定流動(dòng)相體系為乙腈—水（含25 mmol/L磷酸二氫鉀，pH=3.2，V/V=8∶92）為流動(dòng)相。因萬古霉素和去甲萬古霉素結(jié)構(gòu)類似，經(jīng)過條件優(yōu)化，兩種藥物在該流動(dòng)相條件下可實(shí)現(xiàn)完全分離，故選擇去甲萬古霉素為內(nèi)標(biāo)［14-16］。

3.2 萬古霉素HPLC方法系統(tǒng)柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 隨著柱溫的改變，樣品在流動(dòng)相中的溶解度也隨之發(fā)生變化，利用該原理，本研究通過調(diào)整柱溫從而調(diào)整目標(biāo)化合物的保留時(shí)間［6］。在方法學(xué)建立階段，對(duì)不同柱溫（25、30、35、40 ℃）進(jìn)行了考察，其保留時(shí)間分別為22.3、19.2、16.8、15.7 min，為達(dá)到快速檢測(cè)的目的，因此本研究選擇柱溫為40 ℃下的色譜條件。文獻(xiàn)推薦萬古霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)為205、210、220 、236 nm［15-18］，通過本研究中色譜條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在樣本雜質(zhì)峰不干擾檢測(cè)的情況下，在波長(zhǎng)220 nm的檢測(cè)條件下，檢測(cè)響應(yīng)值最優(yōu)，靈敏度最高。

3.3 樣品處理方式的選擇 萬古霉素和去甲萬古霉素均屬于水溶性化合物，不適宜采用液液萃取方法除去蛋白。研究表明采用10%硫酸鋅溶液和10%三氯乙酸溶液直接沉淀血漿，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證后，前者處理方法存在蛋白沉淀不完全的現(xiàn)象，后者處理樣品后則會(huì)出現(xiàn)內(nèi)源性干擾，以致無法實(shí)現(xiàn)完全色譜分離［1］。文獻(xiàn)報(bào)道酸作為蛋白沉淀劑回收率較低，單純用有機(jī)試劑進(jìn)行處理所需有機(jī)試劑體積較大，樣品中的藥物濃度被極大稀釋［15］。本研究采用混合型蛋白處理液，對(duì)3種不同蛋白沉淀劑和使用處理劑的量進(jìn)行了對(duì)比：6%高氯酸—乙腈（6∶1）100、 200 μL；10%高氯酸—甲醇—乙腈（2∶1∶1）100、150 、200 μL；60%高氯酸50、100、150、200 μL。強(qiáng)酸對(duì)血漿進(jìn)行處理之后放置一段時(shí)間易出現(xiàn)渾濁，樣品不穩(wěn)定，并且強(qiáng)酸會(huì)與色譜柱填料發(fā)生作用生成不可逆吸附層，使色譜柱性能發(fā)生變化，增加檢測(cè)成本； 6%高氯酸—乙腈處理后血漿的穩(wěn)定性不佳。最終，根據(jù)檢測(cè)峰面積、內(nèi)源性干擾、回收率、響應(yīng)值等因素綜合考慮，選擇10%高氯酸—甲醇—乙腈（2∶1∶1）100 μL為最優(yōu)蛋白處理方式。采用10%高氯酸—乙腈—甲醇可以很好的去除蛋白，同時(shí)具有較高的回收率，內(nèi)源性干擾小。

3.4 萬古霉素HPLC方法建立和驗(yàn)證 本研究對(duì)萬古霉素血藥濃度HPLC的建立在流動(dòng)相比例、內(nèi)標(biāo)物、柱溫等方面進(jìn)行了優(yōu)化。同時(shí)對(duì)該HPLC在專屬性、精密度、回收率等方面進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，在本研究所得的色譜條件下萬古霉素測(cè)定專屬性強(qiáng)，不易受其他藥物的干擾；精密度、回收率、穩(wěn)定性均良好，符合生物樣品測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立的HPLC為內(nèi)標(biāo)法，選擇去甲萬古霉素作為內(nèi)標(biāo)，能降低不同批次樣本以及其他不可控因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。選擇10%高氯酸—甲醇—乙腈（2∶1∶1）為蛋白處理劑，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，有利于快速進(jìn)行臨床萬古霉素血藥濃度的測(cè)定。

3.5 萬古霉素PK/PD結(jié)果指導(dǎo)個(gè)體化用藥 對(duì)于重癥感染患者入院后需立即進(jìn)行抗感染治療，相關(guān)藥敏實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)通常情況下都會(huì)有延遲的情況。因此，醫(yī)生通常會(huì)首選采用經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療，以緩解患者的癥狀。本研究列舉案例為顱內(nèi)感染患者，根據(jù)共識(shí)可知中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染以革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌為主，因此采用美羅培南聯(lián)合萬古霉素進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療［19］。在明確病原菌為肺炎克雷伯菌之后停用萬古霉素，聯(lián)合使用對(duì)革蘭陰性菌具有抗菌效應(yīng)的美羅培南、多粘菌素、阿米卡星。共識(shí)表明多粘菌素聯(lián)合氨基糖胺類和碳青霉烯類抗菌藥具有協(xié)同效應(yīng)，并且多粘菌素聯(lián)合用藥病死率比單藥更低［20］。

結(jié)合血藥濃度監(jiān)測(cè)和相關(guān)PK/PD參數(shù)結(jié)果，給臨床反饋藥物治療信息，可以使患者在很大程度上的用藥安全性和有效性得到保證。監(jiān)測(cè)患者用藥達(dá)穩(wěn)態(tài)后，根據(jù)滴注時(shí)間，采集給藥后1 h和給藥前0.5 h血樣。檢測(cè)患者萬古霉素輸注段和消除段血藥濃度，根據(jù)建立的萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型，計(jì)算萬古霉素PK參數(shù)。將PK參數(shù)與指南推薦的參考范圍進(jìn)行比較，結(jié)合患者的具體情況調(diào)整患者的給藥方案。當(dāng)AUC0～24 h/MIC值低于指南推薦值時(shí)，可以采用增加劑量、縮短給藥間隔、延長(zhǎng)輸注時(shí)間等方式使血藥濃度和相關(guān)PK參數(shù)達(dá)到目標(biāo)值范圍；反之可以通過減少劑量、延長(zhǎng)給藥間隔等方式使血藥濃度和相關(guān)PK參數(shù)達(dá)標(biāo)。監(jiān)測(cè)患者輸注段和消除段的血藥濃度，計(jì)算相關(guān)PK參數(shù)并對(duì)其報(bào)告進(jìn)行解讀，最終制定調(diào)整患者的給藥方案。從案例中可以看出，本研究運(yùn)用該模式對(duì)患者的給藥方案進(jìn)行調(diào)整后，相關(guān)的炎癥指標(biāo)有下降趨勢(shì)，表明患者的癥狀有所緩解。由此可以看出基于藥物濃度監(jiān)測(cè)結(jié)合相關(guān)PK/PD參數(shù)制定和調(diào)整給藥方案有助于提高萬古霉素用藥的合理性和有效性。

綜上所述，本研究成功建立并優(yōu)化了HPLC測(cè)定萬古霉素的血漿藥物濃度；該方法具有重現(xiàn)性好、快速、簡(jiǎn)便、靈敏、采血量少成本低等特點(diǎn)，可滿足開展治療藥物監(jiān)測(cè)和進(jìn)行人體PK研究的需要。同時(shí)建立了萬古霉素AUC0～24 h/MIC計(jì)算模型，該模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者調(diào)整給藥方案后的血藥濃度和AUC0～24 h值，為優(yōu)化臨床用藥方案提供了可靠的理論依據(jù)。

利益沖突" 所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明" 張燕：設(shè)計(jì)研究方案，負(fù)責(zé)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，負(fù)責(zé)論文的撰寫修改；黃琪，張穎帆：提供研究思路，修改論文；張燕，黃玲，羅榮耀：負(fù)責(zé)收集整理數(shù)據(jù)，查閱實(shí)驗(yàn)方案相關(guān)資料；胡琴，胡凱，張燕：收集、整理患者病例資料，進(jìn)行患者給藥方案的制定與調(diào)整

參考文獻(xiàn)：

［1］ 崔艷麗，武峰.HPLC法同時(shí)快速測(cè)定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度［J］.中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2011，11（10）：920-922.

［2］ 羅云桃，夏啟航，王慶忠，等.VISA/VRSA相關(guān)耐藥進(jìn)化史及耐藥進(jìn)化代價(jià)［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2021， 42（16）：2001-2005.

［3］ 韋志福.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌院內(nèi)感染的研究進(jìn)展［J］.右江醫(yī)學(xué)，2018，46（3）：363-366.

［4］ BROWN N M， GOODMAN A L， HORNER C， et al. Treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA）： updated guidelines from the UK［J］. JAC Antimicrob Resist， 2021，3（1）：dlaa114.

［5］ LIU C， BAYER A， COSGROVE S E， et al. Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of america for the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in adults and children［J］. Clin Infect Dis， 2011，52（3）：e18-55.

［6］ 王瑞穎，易柳，郭宇鴿，等.萬古霉素血藥濃度快速監(jiān)測(cè)方案的構(gòu)建與應(yīng)用［J］.海峽藥學(xué)，2020，32（9）：48-51.

［7］ 李容.高效液相色譜法測(cè)定人血清萬古霉素濃度［J］.中國(guó)藥業(yè)，2018，27（7）：7-10.

［8］ 趙瑞柯，曹俊華.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度［J］.海峽藥學(xué)，2017，29（11）：38-40.

［9］ OLNEY K B， WALLACE K L， MYNATT R P， et al. Comparison of Bayesian-derived and first-order analytic equations for calculation of vancomycin area under the curve［J］. Pharmacotherapy， 2022，42（4）：284-291.

［10］ JOSEPH T D， WILLIAM J S， WILLLIAM E W， et al. Concepts in clinical pharmacokinetics［M］. 5th ed. Bethesda：Silverchair Science，2010．

［11］ 范亞新，郭蓓寧.萬古霉素治療嚴(yán)重耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的治療藥物監(jiān)測(cè)：2020年美國(guó)衛(wèi)生系統(tǒng)藥師協(xié)會(huì)、美國(guó)感染病學(xué)會(huì)、兒童感染性疾病學(xué)會(huì)和感染病藥師學(xué)會(huì)更新修訂的共識(shí)指南［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2021，21（3）：374-376.

［12］ 李耘，鄭波，呂媛，等.中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)研究2019-2020革蘭氏陽(yáng)性菌監(jiān)測(cè)報(bào)告［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2022，38（4）：369-384.

［13］ 何娜，蘇珊，翟所迪，等.《中國(guó)萬古霉素治療藥物監(jiān)測(cè)指南（2020更新版）》解讀［J］.臨床藥物治療雜志，2021，19（1）：12-16.

［14］ 許大慶，王博.HPLC法測(cè)定萬古霉素血藥濃度的臨床應(yīng)用［J］.北方藥學(xué)，2019，16（7）：3-5.

［15］ 鄭巧玲，張峻，姚勤，等.高效液相色譜法測(cè)定萬古霉素的血藥濃度［J］.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（9）：59-62.

［16］ 劉斌，童彤.HPLC法測(cè)患者血清萬古霉素和去甲萬古霉素濃度［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2015，35（11）：172-174.

［17］ MILLA P， FERRARI F， MUNTONI E， et al. Validation of a simple andeconomic HPLC-UV method for the simultaneous determination of vancomycin，meropenem， piperacillin and tazobactam in plasma samples［J］. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci， 2020，1148：122151.

［18］ 董迪，毛璐，宋菲，等.去甲萬古霉素血藥濃度檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2019，16（3）：146-149.

［19］ 中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)神經(jīng)重癥專家委員會(huì)，北京醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)神經(jīng)外科危重癥學(xué)組.神經(jīng)外科中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診治中國(guó)專家共識(shí)（2021版）［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2021，37（1）：2-15.

［20］ 中國(guó)碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染診治與防控專家共識(shí)編寫組，中國(guó)醫(yī)藥教育協(xié)會(huì)感染疾病專業(yè)委員會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)細(xì)菌感染與耐藥防控專業(yè)委員會(huì).中國(guó)碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染診治與防控專家共識(shí)［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2021，101（36）：2850-2860.

（收稿日期：2022-09-20）

通信作者：黃琪（E-mail： huangqi20021986@163.com）