王沙沙,黃紹敏,張珂珂,宋 曉,3

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450002;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所,河南鄭州 450002;3.河南省農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450002)

相比于擬南芥和水稻,小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白方面的研究主要集中在小麥NRT1基因家族成員的鑒定方面[6,24-26],而對(duì)于每個(gè)家族成員潛在的分子機(jī)制尚不清楚。因此,本研究擬克隆小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaNRT1.1,并通過生物信息學(xué)分析、不同組織qRT-PCR分析及多態(tài)性篩選等方法對(duì)其進(jìn)行研究,為解析小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的生物學(xué)功能提供參考,并為進(jìn)一步開發(fā)其功能標(biāo)記及小麥分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥品種許科168、鄭麥113、中育1211、周麥27、漯麥18和鄭品麥8號(hào)來自黃淮麥區(qū),具有不同的遺傳背景且氮利用效率差異明顯。取普通小麥中國春露地栽培自然生長(zhǎng)的幼苗根、莖、葉,用于分析TaNRT1.1三個(gè)同源基因在小麥不同組織材料中的表達(dá)模式。取小麥品種周麥27、許科168、鄭麥113苗期的根,用于分析TaNRT1.1基因不同等位變異在小麥根中的表達(dá)模式。所有小麥品種均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所小麥營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)研究室提供。

1.2 DNA、總RNA的提取及cDNA合成

參照Chen等[27]的SLS(十二烷基肌氨酸鈉)方法提取小麥種子DNA,并略有改進(jìn)。利用Trizol法提取中國春幼苗的根、莖、葉總RNA。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa,大連)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20 ℃保存。

1.3 小麥 TaNRT1.1基因的克隆

根據(jù)水稻OsNRT1.1B基因(LOC_Os08g12780)序列,通過中國春參考基因組2.0以及Ensemble Plants進(jìn)行同源Blast,獲得小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaNRT1.1(TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B、TaNRT1-1D)及其cDNA序列。通過矮抗58數(shù)據(jù)庫(未公布)和已克隆的TaNRT1.1三個(gè)同源基因,獲得這三個(gè)同源基因的啟動(dòng)子序列。

分別設(shè)計(jì)TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B、TaNRT1.1-1D基因的特異性引物TaNRT1.1-P1、TaNRT1.1-P2、TaNRT1.1-P3(表1),以中國春cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL,包括cDNA 100 ng,上、下引物(10 pmol·μL-2)各0.5 μL,10×Taqbuffer (Mg2+plus)2.5 μL,dNTP (2.5 mmol·L-1)0.5 μL、TaqDNA聚合酶1.25 U,滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL(以上所有試劑均購自于北京天根生化科技有限公司)。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55～60 ℃(各引物的具體溫度見表1)退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。用含溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測(cè)。之后利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工,上海)進(jìn)行片段回收,回收的目的片段連接至pMD18-T克隆載體上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。用單克隆菌落PCR檢測(cè)篩選陽性克隆,然后送至上海生工工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。用Chromos 2.4.3 (http：//technelysium.com.au/?page_id=13)和FinchTV 1.5.0(http：//www.geospiza.com/ Products/finchtv.shtml)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)和分析。最終選擇測(cè)序正確的單克隆(TaNRT1.1-1A-pMD18-T、TaNRT1.1-1B-pMD18-T和TaNRT1.1-1D-pMD18-T)進(jìn)行搖菌,并提取質(zhì)粒,-20 ℃保存。

表1 本研究所有的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 小麥 TaNRT1.1基因的順式作用元件及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

用SMART軟件(http：//smart.embl-heidelberg.de/)及NCBI-CDD (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)TaNRT1.1編碼蛋白的信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)域;用ProParam (http：//web.expasy.org/protparam/) 分析TaNRT1.1編碼蛋白的氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì);用TMHMM 2.0在線軟件 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)TaNRT1.1編碼蛋白的跨膜區(qū);用SPOMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_opma.html)和SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/workspace/)在線分析軟件預(yù)測(cè)TaNRT1.1編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu);用PSORT II Prediction(http：//psort.hgc.jp/form2.html)在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位;用Plantcare在線軟件(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測(cè)TaNRT1.1基因啟動(dòng)子的順式作用元件。

1.5 小麥 TaNRT1.1基因的表達(dá)模式及其等位變異分析

設(shè)計(jì)3個(gè)TaNRT1.1基因的熒光定量PCR特異性引物TaNRT1.1-P4、TaNRT1.1-P5、TaNRT1.1-P6以及小麥內(nèi)參基因β-actin的特異性引物。分別以合成的中國春幼苗根、莖、葉cDNA為模板,應(yīng)用iQ5熒光定量擴(kuò)增儀(伯樂,美國)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括上、下游引物(10 pmol·μL-1)各0.4 μL、2×SYBR Premix Ex Taq II(TakaRa,大連)10 μL、cDNA模板2 μL、滅菌ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。每個(gè)樣品3次重復(fù)。采用2-△△CT方法分析TaNRT1.1基因在各組織中的表達(dá)情況。

另外,根據(jù)已克隆的TaNRT1.1基因序列,設(shè)計(jì)13對(duì)特異性引物(TaNRT1.1-P7～TaNRT1.1-P19)用于擴(kuò)增其同源基因DNA序列及啟動(dòng)子序列,具體引物見表1。其中,特異性引物TaNRT1.1-P10用于小麥TaNRT1.1基因的多態(tài)性篩選,所用小麥材料為1.1節(jié)提到的6個(gè)不同氮利用效率小麥品種。以合成的周麥27、許科168、鄭麥113苗期根cDNA為模板,用TaNRT1.1-1A基因的特異性引物TaNRT1.1-P4及小麥內(nèi)參基因β-actin引物(表1)用于分析TaNRT1.1-A不同等位變異在小麥根中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 TaNRT1.1基因的克隆結(jié)果

按照1.3節(jié)中的方法,獲得水稻OsNRT1.1B基因在小麥中的三個(gè)同源基因,分別命名為TaNRT1.1-1A(TraesCS1A02G210900.1)、TaNRT1.1-1B(TraesCS1B02G224900.1)和TaNRT1.1-1D(TraesCS1D02G214200.1),其DNA序列全長(zhǎng)分別為2 170、2 498和2 272 bp。序列分析發(fā)現(xiàn),這三個(gè)基因均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成(圖1),其編碼序列長(zhǎng)度均為 1 791 bp,可編碼596個(gè)氨基酸。以中國春cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將目的片段回收后,將其連接到pMD18-T克隆載體上,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,最終獲得小麥TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D的cDNA序列。

黑色方框代表 TaNRT1.1基因的外顯子序列;黑色方框之間的連線為內(nèi)含子序列。Black rectangular boxes represent the exons of TaNRT1.1gene;Lines between two black rectangular boxes represent the introns of TaNRT1.1gene.圖1 小麥 TaNRT1.1基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic graph of the structures of TaNRT1.1gene in wheat

隨后,根據(jù)矮抗58數(shù)據(jù)庫(未公布)和已克隆的TaNRT1.1三個(gè)同源基因,并結(jié)合中國春的測(cè)序結(jié)果,成功獲得長(zhǎng)度均為3 000 bp的三個(gè)同源基因的啟動(dòng)子序列,分別是lcl|chr1A：373 762 258～373 765 258、lcl|chr1B：403 537 134～403 540 134和lcl|chr1D：299 571 952～299 574 952。

2.2 小麥 TaNRT1.1基因編碼蛋白的生物信 息學(xué)

用SMART在線軟件預(yù)測(cè)表明,小麥TaNRT1.1基因編碼的蛋白包含PTR2(peptide transport family 2)家族的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別位于33～301 aa 和345～548 aa之間 (圖2A)。生物信息學(xué)分析表明,TaNRT1.1基因編碼的蛋白分子量為63.9 kD,理論等電點(diǎn)(pI)為7.55,為疏水性蛋白。用SOPMA軟件預(yù)測(cè)表明,蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由4種形式構(gòu)成(圖2B),其中α-螺旋占比49.66%、延伸鏈占比12.58%、β轉(zhuǎn)角占比3.69%、無規(guī)則卷曲占比34.06%。用SMART和TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè)表明,該蛋白有跨膜結(jié)構(gòu)區(qū),為膜蛋白,無信號(hào)肽(圖2C)。利用SWISS-MODEL進(jìn)一步進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果表明,TaNRT1.1基因編碼的蛋白含有豐富的α螺旋和無規(guī)則卷曲,與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖2D)。PSORT II Prediction軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,該蛋白主要定位在質(zhì)膜上。

A：結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);B：二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);C：跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);D：空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。A：Domain prediction;B：Secondary structure prediction;C：Transmembrane structure prediction;D：Spatial structure prediction.圖2 小麥TaNRT1.1蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.2 Bioinformatics analysis of TaNRT1.1 protein in wheat

2.3 小麥 TaNRT1.1基因啟動(dòng)子的順式作用元件

為進(jìn)一步研究小麥TaNRT1.1基因的調(diào)控機(jī)制,分別截取其起始密碼子上游2 000 bp的基因組序列,利用Plantcare在線軟件預(yù)測(cè)小麥TaNRT1.1基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn),小麥TaNRT1.1基因啟動(dòng)子除含有一些基本元件(如TATA-box、CAAT-box)外,還富含光響應(yīng)元件(如Box 4、GA-motif、GT1- motif等)、逆境響應(yīng)元件(如CGTCA-motif、ARE、TCA-element、ABRE、MBS等)以及與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的順式作用元件(如HD-Zip 1、RY-element、CAT-box、Circadian等)。

表2 小麥 TaNRT1.1基因啟動(dòng)子區(qū)域具有特殊功能的順式作用元件Table 2 Cis-acting elements with special function of the promoter sequence of TaNRT1.1gene in wheat

2.4 小麥 TaNRT1.1基因的表達(dá)模式

對(duì)中國春小麥不同組織材料進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),結(jié)果(圖3)表明,TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D三個(gè)同源基因在根、莖、葉等組織中均有表達(dá)。其中,TaNRT1.1-1A和TaNRT1.1-1B基因均在根中表達(dá)量最高,葉中表達(dá)量次之,莖中表達(dá)量最低;而TaNRT1.1-1D基因在小麥莖中表達(dá)量最高,葉中表達(dá)量次之,根中表達(dá)量最低。

2.5 小麥 TaNRT1.1基因等位變異的檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)宋 曉等[28]的研究結(jié)果,挑選6個(gè)氮利用效率差異明顯的小麥品種,利用13對(duì)特異性引物TaNRT1.1-P7～TaNRT1.1-P19對(duì)TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D三個(gè)基因DNA序列及啟動(dòng)子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序,發(fā)現(xiàn)在TaNRT1.1-1A基因啟動(dòng)子上游1 120 bp的位置有一個(gè)8 bp(TGCATGCA)的插入位點(diǎn)(圖4),測(cè)序結(jié)果證實(shí)了該位點(diǎn)的可靠性。而TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D基因DNA序列及啟動(dòng)子序列中均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。結(jié)合前期對(duì)TaNRT1.1基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)位于光響應(yīng)元件Box 4和GT1-motif附近。因此,按照Mcintosh等[29]對(duì)基因的命名方法,將TaNRT1.1-1A基因啟動(dòng)子上游 1 120 bp處按有無8 bp堿基插入分別命名為TaNRT1.1-1A-a和TaNRT1.1-1A-b。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TaNRT1.1-1A-a基因型主要存在于氮低效型小麥品種中,而TaNRT1.1-1A-b基因型主要存在于氮高效型小麥品種中(表3)。因此,推測(cè)TaNRT1.1基因可能與小麥氮利用效率相關(guān)。

圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5同。Different letters above columns mean significant difference(P<0.05)。The same in Fig.5圖3 小麥 TaNRT1.1三個(gè)同源基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of TaNRT1.1homoeologs in different tissues of wheat

圖4 TaNRT1.1基因的多態(tài)性分析Fig.4 Polymorphism analysis of TaNRT1.1gene

表3 TaNRT1.1基因等位變異對(duì)6個(gè)小麥品種氮利用效率的影響Table 3 Effect of TaNRT1.1allelic variations on nitrogen use efficiency of the six wheat varieties

2.6 TaNRT1.1-1A基因兩種等位變異的表達(dá)模式

分別以1個(gè)氮低效型代表性小麥品種周麥27(基因型為TaNRT1.1-1A-a)和2個(gè)氮高效型代表性小麥品種許科168、鄭麥113(基因型為TaNRT1.1-1A-b)苗期的根cDNA為模板,對(duì)TaNRT1.1基因進(jìn)行表達(dá)模式分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果(圖5)顯示,TaNRT1.1-1A基因在氮高效小麥品種苗期根中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在氮低效小麥品種中的相對(duì)表達(dá)量。推測(cè)TaNRT1.1基因可能正調(diào)控小麥氮利用效率。

圖5 許科168、鄭麥113和周麥27苗期根中TaNRT1.1基因等位變異的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of TaNRT1.1 alleles in the seedling root of Xuke 168,Zhengmai 113 and Zhoumai 27

3 討 論

在此基礎(chǔ)之上,本研究首先同源克隆了水稻OsNRT1.1B基因在小麥中的三個(gè)同源基因TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D,并通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這三個(gè)同源基因所編碼的蛋白均為疏水蛋白,含有豐富的α-螺旋和無規(guī)則卷曲,其亞細(xì)胞定位于質(zhì)膜上。此研究結(jié)果與郭志強(qiáng)等[26]的研究結(jié)果一致。另外,通過對(duì)小麥不同組織中三個(gè)同源基因TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果顯示,TaNRT1.1-1A和TaNRT1.1-1B基因在不同組織中表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式,即根中表達(dá)量最高,葉、莖中次之。TaNRT1.1-1D基因的表達(dá)模式則不同,莖中表達(dá)量最高,葉、根中較低。因此,推測(cè)TaNRT1.1-1A和TaNRT1.1-1B基因在植物根從土壤中吸收硝酸鹽過程中發(fā)揮了重要作用,而TaNRT1.1-1D基因在硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮了重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn),TaNRT1.1-1A基因啟動(dòng)子上游1 120 bp處存在新的8 bp插入位點(diǎn)。該8 bp的插入與TaNRT1.1基因的高表達(dá)、氮利用效率密切相關(guān),且其位于光響應(yīng)元件Box 4和GT1-motif附近,因此,可為研究TaNRT1.1基因啟動(dòng)子區(qū)域光反應(yīng)元件所發(fā)揮的作用提供參考。此外,由于本研究中用于篩選TaNRT1.1基因多態(tài)性的材料較少,未來仍需進(jìn)一步探究TaNRT1.1-1A基因啟動(dòng)子上游1 120 bp處8 bp的插入對(duì)小麥氮利用效率的影響。