張陽東，宋秀軍，高 崢，牛冬梅，呂 進，楚瑞雪

（1.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心研究部，北京 100088；2.火箭軍96606 部隊醫(yī)院，河南洛陽 471003；3.解放軍總醫(yī)院京中醫(yī)療區(qū)禮士路門診部，北京 100820）

0 引言

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的高密度、高保守的DNA 序列多態(tài)性，是導(dǎo)致人群個體間遺傳差異的主要原因。特定基因SNP 的檢測分析在疾病的診斷特別是出生缺陷疾病的防控、藥物種類和劑量的指導(dǎo)等方面有著非常重要的作用。SNP的常見檢測方法包括直接測序法、基因芯片法、PCR-限制性片段長度多態(tài)性法、熒光標記的單堿基延伸法和核酸質(zhì)譜法等。其中核酸質(zhì)譜法是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)，根據(jù)解吸的核酸分子的質(zhì)量和在真空腔中的飛行時間差異，通過計算分子量進而獲得分析物的基因型信息。在pmol 水平可鑒別僅1 個堿基差別的不同DNA 片段是核酸質(zhì)譜儀進行SNP 分型的基礎(chǔ)。核酸質(zhì)譜技術(shù)具有高靈敏度、高通量和高精確度等優(yōu)勢，是國際業(yè)界公認的SNP 分型的黃金標準[1]。為了闡述核酸質(zhì)譜儀的SNP 基因分型技術(shù)在疾病的分子診斷和機制研究中的優(yōu)勢，使該技術(shù)在臨床檢驗中逐漸普及，本文對核酸質(zhì)譜儀的構(gòu)造、技術(shù)原理和檢測程序進行介紹，并對核酸質(zhì)譜儀檢測SNP 在出生缺陷疾病篩查診斷和個性化醫(yī)療等領(lǐng)域中的應(yīng)用進行闡述。

1 核酸質(zhì)譜儀的組成、工作原理和檢測流程

1.1 核酸質(zhì)譜儀的組成

核酸質(zhì)譜儀主要由進樣系統(tǒng)、基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）、飛行時間質(zhì)量分析器（time of flight mass analyzer，TOF）、檢測接收器和配套分析軟件5個部分組成。設(shè)備進樣系統(tǒng)提供標準的96 和384 制式芯片，可滿足不同檢測量的需求。一張芯片可同時分析多個檢測項目并可分多次使用，方便檢測內(nèi)容的靈活定制或修改，減少拼湊樣本的限制，大大提高了檢測效率。該設(shè)備的全封閉設(shè)計可避免人為操作誤差及潛在的交叉污染風(fēng)險。

1.2 核酸質(zhì)譜儀的工作原理

MALDI 應(yīng)用激光照射核酸分子與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)吸收激光能量并傳遞給核酸分子，從而使基質(zhì)和核酸分子間發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生完整的電離化核酸分子。TOF 使離子化的核酸分子在電場作用下加速飛過真空管腔，根據(jù)樣品分子的電荷及分子量不同以及到達檢測接收器的時間差異，智能分析SNP 的基因型。

1.3 核酸質(zhì)譜儀檢測SNP 的流程

1.3.1 樣品的準備

準備核酸質(zhì)譜儀可直接檢測的稀有樣本和降解樣品，以及可兼容全血、唾液、口腔黏膜、干血斑、活檢組織、石蠟包埋組織、血漿等各類樣本。

1.3.2 擴增和延伸反應(yīng)的引物設(shè)計

由于核酸質(zhì)譜儀的SNP 分型是一種在PCR 基礎(chǔ)上進行單堿基延伸的技術(shù)，因此相關(guān)的引物設(shè)計必須遵循PCR 引物設(shè)計原則。引物應(yīng)盡量避免自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)及5 個以上嘌呤或嘧啶核苷酸的連續(xù)序列。由于同一體系可進行多達幾十重反應(yīng)，引物間需避免互補，防止出現(xiàn)非特異性擴增延伸而干擾檢測結(jié)果。

1.3.3 PCR 擴增、純化及單堿基延伸反應(yīng)

在核酸擴增階段，通過多重PCR 擴增多達含40個待檢SNP 的目標片段。PCR 結(jié)束后加入蝦堿性磷酸酶進行純化，去除反應(yīng)液中的脫氧核苷酸。隨后在反應(yīng)液中加入針對SNP 位點的特異性單堿基延伸引物及經(jīng)修飾的雙脫氧核苷酸進行單堿基延伸反應(yīng)，使等位基因的延伸產(chǎn)物僅表現(xiàn)為末端一個堿基的差異。

1.3.4 核酸質(zhì)譜儀的分型檢測

將完成延伸的反應(yīng)液與樹脂混合進行離子交換，去除吸附于DNA 片段上的離子，再經(jīng)脫鹽后將反應(yīng)液點在靶板基質(zhì)上形成共結(jié)晶。基質(zhì)可增強核酸分子對激光的吸收，保護核酸分子的穩(wěn)定性。核酸質(zhì)譜儀根據(jù)不同質(zhì)量的單堿基的飛行時間差異自動分析確定對應(yīng)的堿基類型。整個檢測流程和數(shù)據(jù)分析簡單，檢測周期短。另外，由于核酸質(zhì)譜技術(shù)采用物理方法學(xué)，檢測過程只需簡單的PCR 及延伸試劑，無需熒光探針和熒光類試劑，因此試劑成本低。

2 核酸質(zhì)譜儀在出生缺陷防控中的臨床應(yīng)用

出生缺陷是指由遺傳等因素導(dǎo)致的嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常。出生缺陷嚴重影響兒童的健康和出生人口素質(zhì)，因此對遺傳缺陷疾病開展篩查工作具有重要意義。我國已通過孕前、孕期及出生后的篩查建立了出生缺陷三級預(yù)防體系，做到早診斷、早干預(yù)、多層面預(yù)防出生缺陷的發(fā)生[2]。通過對母體循環(huán)中胎兒DNA 的SNP 進行分型，即可獲得胎兒的遺傳信息，除了可測定胎兒染色體畸變、循環(huán)核酸[3]及DNA 半合子22q11.2 缺失外[4]，核酸質(zhì)譜儀更多應(yīng)用于需進行多基因多位點檢測的遺傳性耳聾、地中海貧血和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥等疾病的產(chǎn)前無創(chuàng)診斷[3]。

2.1 核酸質(zhì)譜儀在遺傳性耳聾篩查診斷中的臨床應(yīng)用

耳聾是最常見的遺傳性疾病之一。我國每年出生的約90 萬例遺傳缺陷的新生兒中約三分之一為聽力障礙[5]。國內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[6-7]，我國的遺傳性耳聾大多數(shù)為單基因遺傳病，主要與GJB2、GJB3、12SrRNA 及SLC26A4 基因有關(guān)。其中GJB2 基因突變是通過影響縫隙連接蛋白的合成而導(dǎo)致內(nèi)耳鉀離子循環(huán)和轉(zhuǎn)運異常使聽力損失。GJB3 基因突變可影響縫隙連接蛋白的合成導(dǎo)致高頻聽力下降。12SrRNA 基因是一個與氨基糖甙類抗生素致聾相關(guān)的基因。氨基糖苷類抗生素進入攜帶有該突變基因的人體后，通過損傷內(nèi)耳毛細胞導(dǎo)致永久性聽力損失[8]，患者需終身禁用氨基糖苷類抗生素。SLC26A4 基因位點突變主要引起內(nèi)耳淋巴液的流動異常，使內(nèi)耳毛細胞受損和聽神經(jīng)萎縮而導(dǎo)致聽力下降[9]。由于大部分遺傳性耳聾為常染色體隱性遺傳，隱性耳聾基因攜帶者的聽力正常，因此為聽力正常的育齡夫婦進行常見耳聾基因檢測十分必要。

2013 年深圳華大基因科技有限公司的曾云等[10]依據(jù)我國大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究結(jié)果，應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀構(gòu)建了GJB2、GJB3、12SrRNA 和SLC26A44個遺傳性耳聾基因共20 個SNP 的分型檢測方法，該檢測方法具有位點多、覆蓋率高、快速、準確、高通量、低成本等特點，適于大規(guī)模篩查，為先天性耳聾和藥物性耳聾的及早干預(yù)和用藥警示提供了分子生物學(xué)依據(jù)。核酸質(zhì)譜儀的應(yīng)用使得檢測費用的大幅度降低也為2014 年我國政府開展新生兒耳聾基因的免費篩查提供了經(jīng)濟支撐，具有重要的社會價值。

2.2 核酸質(zhì)譜儀在遺傳性代謝疾病診斷中的臨床應(yīng)用

地中海貧血是珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致珠蛋白鏈合成障礙、比例失衡引起紅細胞損傷、溶血從而導(dǎo)致紅細胞新陳代謝異常的常染色體隱性遺傳疾病。目前已知β 珠蛋白基因致病的點突變就超過200個[11]。地中海貧血在臨床表現(xiàn)上具有非常顯著的異質(zhì)性，建立快速高通量的珠蛋白常見基因突變位點的檢測方法對溶血性貧血的診斷及防止出現(xiàn)重型地中海貧血患兒顯得尤為重要。應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀對β 珠蛋白基因的10 個常見SNP 位點進行檢測，既可克服β地中海貧血診斷實驗中傳統(tǒng)的血紅蛋白A（HbA）定量的靈敏度不高、特異性不強的缺點，也可克服PCR結(jié)合反向點雜交法操作煩瑣、通量低、費用昂貴的不足[12]。臨床實踐證明，應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀對SNP 位點進行分型是新生兒β 地中海貧血大樣本篩查和診斷的有效方法。

G6PD 缺乏癥因G6PD 基因突變使紅細胞磷酸戊糖途徑中還原型輔酶Ⅱ和還原型谷胱甘肽生成減少，導(dǎo)致紅細胞膜穩(wěn)定性和抵抗氧化損傷能力下降而引起溶血性貧血。該病重在早期診斷預(yù)防，患者應(yīng)避免攝入可能誘發(fā)該病的食物及藥物[13]。在已報道的G6PD 的近200 個基因突變型中，約85%表現(xiàn)為單個堿基的多態(tài)性[14]。我國人群中G6PD 最常見的基因點突變有10 多種，其中以1376G>T、1388G>A和95A>G 突變頻率最高[15]。根據(jù)我國的流行病學(xué)研究，包括專家共識及診治指南等，陶子馨[16]選取了我國人群常見的16 種G6PD 缺乏癥致病突變位點，應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀對SNP 進行了基因分型，檢測出的位點情況符合我國的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果與測序檢測一致，且可用于排除G6PD 酶活性檢測的假陽性。

應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀開展遺傳缺陷相關(guān)基因SNP的高通量檢測可彌補傳統(tǒng)檢測方法的局限性，通過基因攜帶者經(jīng)遺傳咨詢可尋找潛在的患者。目前我國通過對地中海貧血[12，17]、G6PD 缺乏癥[18]的多基因多位點SNP 檢測，使嚴重出生缺陷得到了有效控制。

3 核酸質(zhì)譜儀在個性化醫(yī)療中的臨床應(yīng)用

近年來，臨床用藥已由經(jīng)驗用藥和循證用藥階段逐漸發(fā)展為個性化用藥階段。藥物基因組信息是當(dāng)前個性化精準醫(yī)療的一個重要部分。藥物基因組學(xué)是通過對藥物代謝酶、受體和轉(zhuǎn)運蛋白等基因的研究，闡明不同基因型個體的藥物藥效和毒性，確定藥物作用靶點，指導(dǎo)不同基因型個體的臨床用藥。不同個體的藥物遺傳多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的基礎(chǔ)。藥物基因組學(xué)的臨床實施可以規(guī)避有毒副作用的藥物，實現(xiàn)個性化醫(yī)療，提高治療的功效、安全性和成本效益。藥物經(jīng)血液循環(huán)主要在肝臟代謝，細胞色素酶P450（CYP450）是人體肝臟中最主要的藥物代謝酶系統(tǒng)，其多態(tài)性與藥物的代謝速率和清除率直接相關(guān)[19]。CYP450 含多個亞族，其中CYP2C9 和CYP2C19是遺傳多態(tài)性中與我國人群藥物代謝最緊密相關(guān)的2 種酶[20]。核酸質(zhì)譜儀的臨床應(yīng)用很好地解決了藥物基因組學(xué)同時檢測多個變異位點的需求[21-23]，特別是在心血管疾病、腫瘤靶向治療、病原體分型及耐藥檢測等精準用藥的開展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

3.1 核酸質(zhì)譜儀在心血管疾病精準用藥中的臨床應(yīng)用

心血管疾病主要包括高血壓、心絞痛、心律失常、心肌梗死等，是死亡率最高的疾病。心血管疾病大多為慢性病，藥物治療一般較為復(fù)雜。研究結(jié)果[24-26]顯示，臨床上治療心血管疾病常規(guī)使用的藥物因體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運及作用靶點相關(guān)基因的遺傳變異和表達水平變化，通過影響藥物的體內(nèi)濃度和敏感性而導(dǎo)致藥物反應(yīng)個體差異。華法林是預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病最常用的口服抗凝藥，其安全治療窗狹窄，抗凝不適度時易引起出血、栓塞甚至死亡等嚴重并發(fā)癥。華法林代謝酶基因如肝臟中細胞色素P450 2C9的SNP 對華法林的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生重要影響。應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀同時對華法林代謝酶的多個SNP 進行基因分型對指導(dǎo)華法林初始劑量的選擇、降低抗凝出血的風(fēng)險具有重要的指導(dǎo)意義[27]。

國內(nèi)劉朝暉等[28]應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀對心血管相關(guān)藥物氯吡格雷、華法林、硝酸甘油和他汀類等相關(guān)的11 個基因17 個SNP 進行了檢測，同時對該方法的準確度、特異性、測定下限、精密度和抗干擾水平進行了評價。研究結(jié)果顯示，核酸質(zhì)譜儀檢測SNP 性能穩(wěn)定，檢測下限可達0.4 ng DNA。該設(shè)備對基因組和PCR 各中間產(chǎn)物（擴增產(chǎn)物、消化產(chǎn)物和延伸產(chǎn)物）氣溶膠有很強的抗干擾能力，且芯片不同基質(zhì)間無交叉污染，可以保證檢測結(jié)果的準確可靠。

目前，國內(nèi)核酸質(zhì)譜儀廠家已研制開發(fā)涵蓋20多個心血管相關(guān)藥物基因共數(shù)十個SNP 位點的檢測試劑盒，通過藥物相關(guān)基因多態(tài)性分析指導(dǎo)臨床個體化用藥，大大地提高了心血管藥物使用的安全性、有效性和經(jīng)濟性。

3.2 核酸質(zhì)譜儀在腫瘤靶向治療中的臨床應(yīng)用

腫瘤是目前嚴重威脅人類健康的一類疾病。通過SNP 的基因分型，不僅可以對健康、亞健康人群進行腫瘤風(fēng)險評估[29-30]，開展腫瘤的早期篩查[31-32]，還可以為腫瘤治療方案的選擇以及預(yù)后預(yù)測提供重要依據(jù)[33]。基于遺傳信息對腫瘤患者進行個體化治療已得到臨床的廣泛關(guān)注[34]。肺癌在我國惡性腫瘤的發(fā)病率中居首位，防治任務(wù)艱巨[35]。研究結(jié)果顯示，肺癌的發(fā)病、靶向治療以及轉(zhuǎn)移等都與基因的變異相關(guān)[36]。在非小細胞肺癌的臨床治療中，常通過對EGFR和ALK 基因的突變位點進行檢測來選擇靶向治療的酪氨酸激酶抑制劑[37-38]。目前針對結(jié)直腸癌的靶向治療藥物主要為抗表皮生長因子受體單抗（西妥昔單抗和帕尼單抗），其療效與KRAS、NRAS 和BRAF 基因型密切相關(guān)。通過對這3 個基因16 個突變位點的檢測，可為結(jié)直腸癌患者的個體化治療選擇合適的靶向治療方案[39]。目前，基于核酸質(zhì)譜技術(shù)已研發(fā)上市針對不同腫瘤的風(fēng)險評估、用藥指導(dǎo)、耐藥監(jiān)控、良惡性鑒別、療效評估的試劑盒。

田紅霞等[40]根據(jù)中國人群肺癌的發(fā)病機理、放化療、靶向耐藥以及轉(zhuǎn)移等相關(guān)的靶基因或傳導(dǎo)通路基因，應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀構(gòu)建了可同時檢測EGFR、ALK 和KRAS 等13 個肺癌相關(guān)基因共99 個SNP位點的方法。該方法以96 或384 孔板多重反應(yīng)分析為基礎(chǔ)，在12 孔同步檢測13 個基因的99 個SNP位點，實現(xiàn)了“單個小樣本多基因的檢測”，使小樣本最大化使用、獲得最大信息量。通過對肺癌細胞系和肺癌組織樣本的檢測并與進口試劑盒及直接測序法的對比驗證，顯示該方法靈敏度高、特異性好，適合中國肺癌人群。由于自主研發(fā)的高通量檢測試劑盒大大降低了患者的臨床檢測費用，因此核酸質(zhì)譜儀具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

3.3 核酸質(zhì)譜儀在病原體分型及耐藥檢測中的臨床應(yīng)用

核酸質(zhì)譜儀的另一重要應(yīng)用領(lǐng)域是通過檢測病原體管家基因的SNP 進行多位點序列分型，根據(jù)基因分型結(jié)果對病原體進行鑒定并提供病原體的用藥信息。我國是全球結(jié)核第三高發(fā)國家，每年有超過10 萬例的新發(fā)耐多藥患者。結(jié)核桿菌鏡檢陽性率低，培養(yǎng)困難[41]。雖然眾多學(xué)者應(yīng)用核酸質(zhì)譜儀的篩選結(jié)果顯示中國漢族人群的sp110 基因、MMP9 基因及IL 基因等的多個SNP 與結(jié)核的易感性相關(guān)[42-44]，但核酸質(zhì)譜儀在結(jié)核病個性化治療中的主要應(yīng)用還是通過構(gòu)建對感染的結(jié)核分枝桿菌的rpoB、katG、gyrA 和rrs 等基因的50 余個耐藥相關(guān)位點進行檢測，高通量快速完成結(jié)核分枝桿菌的鑒定與利福平、異煙肼、氟喹諾酮類及二線注射類抗結(jié)核藥物的多重耐藥分析，將其作為臨床鑒定結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗結(jié)果的有效補充，為結(jié)核病的診斷和用藥提供準確信息[45-47]。

乙肝患者經(jīng)長期口服核苷（酸）類抗病毒藥物治療后體內(nèi)的乙肝病毒可發(fā)生基因變異而導(dǎo)致耐藥。開展針對不同核苷（酸）類藥物病毒耐藥檢測對于調(diào)整治療方案、指導(dǎo)遠期治療具有重要意義。目前，我國核苷（酸）類抗病毒藥物主要有阿德福韋酯、替比夫定、拉米夫定和恩替卡韋4 種，每一種藥物的耐藥菌株的突變位點不同。利用核酸質(zhì)譜儀建立的乙肝病毒耐藥基因突變檢測體系，可同時檢測多達37 個耐藥突變SNP 位點，其檢測靈敏度和檢出率均高于線性探針分析法和多溫度單鏈構(gòu)象多態(tài)性法，可為乙肝患者個性化臨床治療方案的制訂及調(diào)整提供重要依據(jù)[48-49]。

4 結(jié)語

核酸質(zhì)譜儀在出生缺陷防控和個性化精準醫(yī)療中發(fā)揮了重要作用?；诟咄?、快速、準確的優(yōu)勢，核酸質(zhì)譜儀也被廣泛應(yīng)用于疾病的機制研究，篩選與糖尿病[50-51]、冠心病[52-53]等常見疾病相關(guān)的危險因素。在病原學(xué)診斷領(lǐng)域，核酸質(zhì)譜儀克服了傳統(tǒng)的病原體分離培養(yǎng)周期長和生化鑒別困難等缺點，為感染性疾病的數(shù)十種病原體的高效鑒別診斷[54-55]提供了新方法。

為了在臨床檢測中普及核酸質(zhì)譜技術(shù)，醫(yī)療管理部門需加大投入和政策支持，指導(dǎo)研發(fā)機構(gòu)提高設(shè)備的國產(chǎn)化水平，特別是核心部件的國產(chǎn)化，降低實驗室購買設(shè)備的成本；加大多種疾病診斷試劑盒的研發(fā)力度，國內(nèi)通用型核酸質(zhì)譜儀在臨床應(yīng)用的獲批和試劑盒的不斷研發(fā)生產(chǎn)，將使該設(shè)備在精準醫(yī)療、遺傳疾病篩查、疾病預(yù)后判斷、公共健康等臨床分子診斷領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景，開啟核酸質(zhì)譜儀在臨床應(yīng)用的新紀元。