舒逸凡，宋克超，徐潔，吳小軍，曾曉雄

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（南京 210095）；2. 南京思農(nóng)生物有機(jī)肥研究院有限公司（南京 211899）；3. 陜西秦峰農(nóng)業(yè)股份有限公司（商洛 711499）

黑木耳（Auricularia auricula）屬真菌類擔(dān)子菌綱，是一種富含碳水化合物和蛋白質(zhì)的可食用真菌，主要分布在中國(guó)、韓國(guó)、日本、泰國(guó)等地區(qū)[1]。黑木耳具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并兼?zhèn)涠喾N藥理功能，其中黑木耳多糖（Auricularia auriculapolysaccharides，AAP）是黑木耳中最主要的活性物質(zhì)。近年來(lái)有許多文獻(xiàn)報(bào)道稱黑木耳多糖具備免疫調(diào)節(jié)[2]、抗氧化[3]、降血糖[4]、抗腫瘤[5]及抗凝血[6]等生物活性。因此，黑木耳具備較高的開發(fā)功能食品的潛力。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是一種源于茯磚茶的曲霉科真菌[7]，作為一種潛在的益生菌，冠突散囊菌可利用多種碳源，尤其能分泌多種胞外酶，如纖維素酶、蛋白酶和多酚氧化酶等，因此也經(jīng)常被用于谷物和豆類的加工[8-9]。有研究表明在提取多糖的過程中使用真菌發(fā)酵能使發(fā)酵后的多糖結(jié)構(gòu)多樣化，提高其生物活性[10-11]，同時(shí)能夠提升相關(guān)功能性食品品質(zhì)，改善產(chǎn)品風(fēng)味、色澤等感官品質(zhì)，增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值[12]。

對(duì)于黑木耳的利用大多停留在粗加工階段，對(duì)于以黑木耳為原料的深加工產(chǎn)品的開發(fā)還處于初級(jí)階段[13]。酸奶是一種益生菌發(fā)酵食品，其中的益生菌能夠代謝黑木耳多糖，形成更小分子的多糖或修飾其結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生新的活性功能，增強(qiáng)產(chǎn)品的藥理作用，提高活性物質(zhì)的生物利用度[14]。此外，真菌多糖能夠促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，并且減弱消化液對(duì)乳酸菌的影響，有利于乳酸菌在宿主體內(nèi)發(fā)揮作用[15]。因此將黑木耳、冠突散囊菌及乳酸菌發(fā)酵結(jié)合，能使黑木耳深加工產(chǎn)品具備美味、營(yíng)養(yǎng)、功能多樣化等特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳（陜西秦峰農(nóng)業(yè)股份有限公司）；巴氏殺菌奶、白砂糖（市售）；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌（西安蘭杉生物科技有限公司）；冠突散囊菌（MK346334，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院）[16]；PDB瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基（上海盛思生化科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

AY120電子天平（日本島津公司）；LRH-150系列電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）；HH-S24S 數(shù)顯恒溫水浴鍋；LDZX-50KBS滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；PEN3型電子鼻（德國(guó)AIRSENSE）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冠突散囊菌的培養(yǎng)

將保存的冠突散囊菌（MK346334）接種于PDB瓊脂培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)7 d，待金黃色菌絲長(zhǎng)滿平板培養(yǎng)基后，用接種環(huán)刮取平板上的孢子于無(wú)菌水中，使孢子液濃度為1×107CFU/mL，制得孢子懸浮液，備用[17]。

1.3.2 黑木耳發(fā)酵多糖的制備

黑木耳發(fā)酵多糖的制備參照已報(bào)道的黑木耳多糖提取方法[18]。黑木耳經(jīng)洗凈后烘干，用高速粉碎機(jī)粉碎成粉末，將黑木耳粉末按照1︰100（g/mL）料液比加入去離子水，在90 ℃水浴條件下浸提3 h，過濾得到黑木耳水提液，經(jīng)120 ℃滅菌20 min后接種冠突散囊菌（5%冠突散囊菌孢子液），于28 ℃恒溫?fù)u床中以120 r/min培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后以5 000 r/min離心10 min，上清液真空濃縮至合適體積，加4倍體積乙醇沉淀，沉淀復(fù)溶、透析，濃縮、凍干即為黑木耳發(fā)酵多糖。

1.3.3 黑木耳多糖的電子鼻分析

稱取1 g多糖樣品于20 mL頂空瓶中，將密封好的頂空瓶置于50 ℃水浴鍋中平衡30 min，插入電子鼻探頭測(cè)定多糖樣品香氣。電子鼻參數(shù)：沖洗時(shí)間60 s，調(diào)零時(shí)間10 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，檢測(cè)時(shí)間120 s，內(nèi)部流量300 mL/min，進(jìn)樣流量300 mL/min。

1.3.4 黑木耳發(fā)酵多糖酸奶的制作

原料乳→調(diào)配（加入1%發(fā)酵多糖和6%白砂糖）→殺菌（62~65 ℃滅菌30 min）→冷卻至40 ℃后接種（加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的活化菌種）→密封保溫發(fā)酵（42 ℃發(fā)酵8 h）→后熟（轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱保存12 h）

1.3.5 酸奶乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

取1 g后熟12 h的酸奶樣品，加入9 mL無(wú)菌生理鹽水混合均勻制得10-1的樣品均勻稀釋液，依次進(jìn)行類比稀釋，制備10倍系列稀釋樣品勻液，分別選取0.1 mL 10-5，10-6和10-7這3個(gè)梯度的稀釋液在MRS固體培養(yǎng)基上涂布，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，做3次平行測(cè)定[19]。

1.3.6 酸奶持水力測(cè)定

準(zhǔn)確稱定空離心管的質(zhì)量并記為m0，將后熟的酸奶置于離心管中，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量記為m1，以3 500 r/min離心10 min，離心后靜置10 min，除去上清液后準(zhǔn)確稱量其質(zhì)量并記為m2。持水力按照式（1）計(jì)算[20]。

表1 電子鼻各傳感器對(duì)應(yīng)敏感物質(zhì)

1.3.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以多糖添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）、發(fā)酵時(shí)間（6，8，10，12和14 h）和白砂糖添加量（2%，4%，6%，8%和10%）為自變量設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.8 正交試驗(yàn)優(yōu)化黑木耳發(fā)酵多糖酸奶工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別以不同的多糖添加量、發(fā)酵時(shí)間以及白砂糖添加量為考察因素，進(jìn)行感官評(píng)定評(píng)分，采用三因素三水平正交試驗(yàn)確定酸奶工藝的最優(yōu)比，正交因素水平見表2。

表2 黑木耳發(fā)酵多糖酸奶優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.9 感官評(píng)分

優(yōu)選10位審評(píng)人，參照酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（表3），從色澤、組織狀態(tài)、氣味與口感風(fēng)味方面對(duì)黑木耳發(fā)酵多糖酸奶進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分滿分為100分。

表3 黑木耳發(fā)酵多糖酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，數(shù)據(jù)差異顯著性采用SPSS（statistical package for social sciences）進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳發(fā)酵多糖的制備及其香氣成分探究

圖1顯示冠突散囊菌對(duì)黑木耳提取液的發(fā)酵過程。結(jié)果表明，在發(fā)酵第2天開始出現(xiàn)白色的冠突散囊菌球狀菌絲體，在發(fā)酵第5天菌絲體直徑可達(dá)5~6 mm，在發(fā)酵第7天發(fā)酵液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，可能存在菌絲體的自溶，因此在第6天終止發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后離心，上清液經(jīng)濃縮、醇沉等步驟得到黑木耳發(fā)酵多糖。

圖1 冠突散囊菌發(fā)酵黑木耳提取液過程

電子鼻從50 s之后傳感器響應(yīng)值趨于穩(wěn)定，因此選擇50 s時(shí)的電子鼻響應(yīng)值進(jìn)行分析。圖2（A）為發(fā)酵前后多糖樣品的主成分分析（PCA）分析結(jié)果，PCA1和PCA2的貢獻(xiàn)率分別為74.44%和14.72%，解釋度為89.16%，說明PCA分析具有可行性。PCA分析結(jié)果表明發(fā)酵前樣品和發(fā)酵后樣品香氣特征具有顯著性差異（P=0.013），因而通過冠突散囊菌發(fā)酵顯著改善黑木耳多糖的香氣。結(jié)合電子鼻雷達(dá)圖（圖2B）結(jié)果可知，發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分差異主要體現(xiàn)在傳感器W2W、W1W、W1S、W5C、W3C和W1C，經(jīng)發(fā)酵后的黑木耳多糖芳香族化合物、有機(jī)硫化物、無(wú)機(jī)硫化合物、萜烯類化合物和碳?xì)浠衔锵銡獬煞衷黾?，芳香烴類化合物、氨類化合物和短鏈烷烴芳香化合物香氣成分減少，而在其余傳感器響應(yīng)值基本匯于一點(diǎn)，說明它們對(duì)應(yīng)香氣特征物質(zhì)較為相似。含硫化合物和烴類化合物作為食用菌常見的揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)食用菌的風(fēng)味形成有很大影響，兩者與其他風(fēng)味物質(zhì)互補(bǔ)調(diào)和，呈現(xiàn)食用菌的特殊香氣[21]，而這2類化合物香氣成分含量在發(fā)酵后上升，說明冠突散囊菌發(fā)酵能改善黑木耳多糖的香氣成分。

圖2 多糖樣品電子鼻主成分分析（A）和雷達(dá)圖（B）

2.2 黑木耳發(fā)酵多糖添加量對(duì)酸奶乳酸菌活菌數(shù)的影響

乳酸菌能夠調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群，保持微生物平衡，提高食物的消化率和生物價(jià)，降低血清膽固醇和體內(nèi)毒素，抑制腸道腐敗菌的生長(zhǎng)和腐敗物質(zhì)的產(chǎn)生[22-23]。黑木耳發(fā)酵多糖添加量對(duì)酸奶乳酸菌活菌數(shù)的影響如圖3（A）所示。結(jié)果表明在酸奶發(fā)酵過程中添加黑木耳發(fā)酵多糖能促進(jìn)乳酸菌的增殖，添加量達(dá)到1.0%時(shí)，酸奶的活菌數(shù)最高。添加量繼續(xù)增大，乳酸菌活菌數(shù)趨于平穩(wěn)或呈下降趨勢(shì)，可能原因是過量的多糖導(dǎo)致發(fā)酵過程中體系的水分活度下降，影響乳酸菌的生長(zhǎng)[24]。

圖3 黑木耳發(fā)酵多糖對(duì)酸奶乳酸菌活菌數(shù)（A）和持水量（B）的影響

2.3 黑木耳發(fā)酵多糖添加量對(duì)發(fā)酵酸奶持水力的影響

酸奶的持水力會(huì)影響酸奶的組織狀態(tài)、穩(wěn)定性及口感。測(cè)定的酸奶持水力結(jié)果如圖3（B）所示。多糖添加量達(dá)到0.5%時(shí)，酸奶的持水力達(dá)到最大，說明適當(dāng)?shù)暮谀径l(fā)酵多糖能在發(fā)酵過程中與酪蛋白分子相互作用，強(qiáng)化蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以容納水分和小分子物質(zhì)，減少乳清的析出，從而增加酸奶的持水力，改善發(fā)酵乳的品質(zhì)[25]。添加量大于1.0%時(shí)，酸奶的持水力開始顯著下降，說明過量的黑木耳發(fā)酵多糖會(huì)降低酸奶的持水力，可能是高濃度的多糖會(huì)破壞發(fā)酵乳凝膠的微觀結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致水分流出和乳清的析出[26]。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 黑木耳發(fā)酵多糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響

按照不同添加劑量添加黑木耳發(fā)酵多糖后，通過感官評(píng)定評(píng)價(jià)黑木耳發(fā)酵多糖對(duì)酸奶品質(zhì)的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著黑木耳發(fā)酵多糖添加量的增大，酸奶的顏色逐漸加深，黑木耳發(fā)酵多糖添加量達(dá)到2.0%時(shí)，酸奶組織狀態(tài)明顯下降，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，可能是牛奶中的蛋白與多糖在發(fā)酵過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，通過共價(jià)鍵連接在一起，形成共價(jià)絡(luò)合物，從而觀測(cè)到兩相，即高濃度高分子絡(luò)合物為一相，另一相是水[27]。根據(jù)圖4（B）感官評(píng)分結(jié)果顯示，黑木耳發(fā)酵多糖添加量0~1.0%時(shí)，隨著添加量增大，酸奶的感官評(píng)分呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，添加量大于1.0%后，隨著添加量繼續(xù)增大，感官評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中添加量1.0%時(shí)，酸奶色澤均勻、組織狀態(tài)細(xì)膩，發(fā)酵乳風(fēng)味濃郁，伴隨黑木耳發(fā)酵多糖的獨(dú)特風(fēng)味，口感良好，酸甜度適中。

圖4 黑木耳發(fā)酵多糖添加量對(duì)酸奶的感官影響

2.4.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶的感官評(píng)分的影響結(jié)果如圖5（A）所示。發(fā)酵時(shí)間為8和10 h時(shí)，感官評(píng)分最高。發(fā)酵時(shí)間短會(huì)造成發(fā)酵乳風(fēng)味不夠濃郁，而發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使酸奶過酸。

2.4.3 白砂糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響

白砂糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響結(jié)果如圖5（B）所示。白砂糖添加量6.0%時(shí)，酸奶酸甜適中，感官評(píng)分最高，白砂糖添加量過低或過高會(huì)導(dǎo)致酸奶風(fēng)味過酸或過甜。

圖5 發(fā)酵時(shí)間（A）和白砂糖添加量（B）對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

黑木耳發(fā)酵多糖酸奶正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。根據(jù)極差R大小可知影響黑木耳發(fā)酵多糖酸奶的因素重要性順序：A＞C＞B，即影響最大的因素為黑木耳發(fā)酵多糖添加量，其次是白砂糖添加量，最后是發(fā)酵時(shí)間。由均值大小可知酸奶的最佳的工藝為黑木耳發(fā)酵多糖添加量1.0%，發(fā)酵時(shí)間9 h，白砂糖添加量8%。

表4 黑木耳發(fā)酵多糖酸奶正交試驗(yàn)表

3 結(jié)論

試驗(yàn)以黑木耳為原料，經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵制備黑木耳發(fā)酵多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)得到的黑木耳多糖香氣特征成分更加豐富；以乳酸菌活菌數(shù)、持水力、感官評(píng)分等指標(biāo)，探討黑木耳發(fā)酵多糖對(duì)乳酸菌酸奶的發(fā)酵及其品質(zhì)的影響，結(jié)果表明添加適量的黑木耳發(fā)酵多糖能促進(jìn)乳酸菌的增殖，提高酸奶的持水力，增加酸奶的穩(wěn)定性，并且改善酸奶的風(fēng)味、口感、色澤及組織狀態(tài)；基于酸奶的乳酸菌活菌數(shù)、持水力及感官品質(zhì)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定黑木耳發(fā)酵多糖酸奶的最佳工藝：黑木耳發(fā)酵多糖添加量1.0%，發(fā)酵時(shí)間9 h，白砂糖添加量8%。新型黑木耳產(chǎn)品的研發(fā)有助于提升黑木耳的深加工水平，提高黑木耳的附加價(jià)值，有助于我國(guó)黑木耳產(chǎn)業(yè)步入轉(zhuǎn)型發(fā)展的新時(shí)期。