耿海波 付世騫 師明川 張加贏 郭會(huì)燦 安麗平

關(guān)鍵詞 細(xì)菌；成礦作用；砂巖型鈾礦；芽孢；硫酸鹽還原菌

0 引言

鈾作為高效清潔的能源，是一種關(guān)系到國(guó)家安全的戰(zhàn)略資源，因此越來越被人們所重視。砂巖型鈾礦因?yàn)榫邆湟?guī)模大、地浸開采成本低、經(jīng)濟(jì)效益高、開采環(huán)保等特點(diǎn)，已成為所有鈾礦中占比最大的鈾礦類型，也是未來國(guó)內(nèi)鈾礦勘查的主攻方向[1]。過去對(duì)于成礦理論和找礦的研究工作更多側(cè)重于其中的物理因素和化學(xué)因素，人們普遍認(rèn)為鈾成礦作用主要由硫化物、氫氣、硫化氫或其他還原劑，通過物理和化學(xué)作用還原U（VI）所致[2]。1991年4月4日出版的Nature 雜志公布了美國(guó)學(xué)者Lovley et al.[3]有關(guān)微生物還原鈾的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，揭示某些細(xì)菌能夠?qū)（VI）還原為U（IV），掀起了研究鈾和微生物相互作用的熱潮，研究熱點(diǎn)集中于修復(fù)鈾污染水環(huán)境的鈾—微生物作用實(shí)驗(yàn)。

國(guó)內(nèi)科研團(tuán)隊(duì)對(duì)于砂巖型鈾礦的生物成礦研究主要集中在十紅灘鈾礦床，筆者曾在國(guó)內(nèi)首次對(duì)十紅灘鈾礦床中的微生物分布做過研究[4]，其后多位學(xué)者的研究表明，礦床中微生物種類分布具備生物地球化學(xué)分帶性，并影響了礦床的形成[5?7]。截至目前，國(guó)內(nèi)科研工作者已對(duì)鄂爾多斯盆地北部東勝鈾礦的生物成礦進(jìn)行了較多研究，已有的研究成果集中在鈾礦石中微化石推論[8]或脂肪酸生物標(biāo)志間接推斷研究[9]，缺乏活體生物參與成礦的直接證據(jù)。本文對(duì)東勝鈾礦床中賦存的細(xì)菌類群進(jìn)行分離鑒定，研究其分布規(guī)律以及和鈾之間的相互作用，力圖為成礦研究提供生物學(xué)證據(jù)，同時(shí)可為鈾污染水的微生物凈化提供技術(shù)參數(shù)。

1 成礦地質(zhì)背景

鄂爾多斯盆地東勝地區(qū)砂巖型鈾礦賦礦地層主要是中侏羅統(tǒng)直羅組河流相碎屑巖沉積，厚100～200 m，直羅組可分為上段與下段兩個(gè)巖性段[10]，其中上段以紫紅色泥巖、泥質(zhì)細(xì)砂巖為主，夾紫紅—黃褐色砂巖和灰綠色砂巖，砂體厚30～40 m，砂質(zhì)疏松。下段可分為兩個(gè)亞段，上亞段為灰綠色泥巖和灰綠色中粒細(xì)砂巖，富含有機(jī)質(zhì)，厚10～30 m；下亞段為灰色中砂巖，地層中富含有機(jī)質(zhì)、煤屑和植物殘骸，砂體厚30～60 m。鈾礦床主要存在于直羅組下段砂體。控礦地層是多期辮狀河砂體[11]。含砂礦體自北向南依次發(fā)育了氧化帶—氧化還原帶—還原帶的巖石地球化學(xué)分帶。氧化帶在地表為褐黃色，氧化還原前鋒線平面上總體呈東西向展布，形態(tài)為復(fù)雜的蛇曲狀；氧化還原過渡帶呈灰色、淺灰色，富含有機(jī)質(zhì)和結(jié)核狀黃鐵礦；還原帶呈灰色，富含有機(jī)質(zhì)，可見結(jié)晶狀黃鐵礦。鈾礦化產(chǎn)于層間氧化還原帶前鋒線附近，鈾礦體呈卷狀、板狀和透鏡狀[12?13]（圖1）。

2 材料與方法

2.1 巖石采樣與處理

本研究所用巖石樣品為采自東勝地區(qū)中侏羅系直羅組不同亞帶的鉆孔巖心樣，巖心樣直徑7～8 cm，長(zhǎng)10 cm，樣品的基本地球化學(xué)參數(shù)如表1所示。樣品采用無菌采樣裝置現(xiàn)場(chǎng)采樣后，放入無菌密封袋中保存避免污染，樣品取回后，在無菌室用紫外燈照射30 min后，剔除巖石表面2 cm厚覆蓋層，取巖心部分在無菌研缽中研磨至粉狀備用。

2.2 各類細(xì)菌的富集、分離和純化

參照參考文獻(xiàn)對(duì)各類細(xì)菌進(jìn)行富集、分離純化和計(jì)數(shù)[14?15]。

2.3 各類細(xì)菌的鑒定

按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）進(jìn)行鑒定。

2.4 不同硫酸鹽還原菌對(duì)鈾的還原作用測(cè)定

為了檢測(cè)東勝鈾礦床中分離得到的硫酸鹽還原菌對(duì)U（VI）的還原沉淀能力，設(shè)計(jì)如下兩組實(shí)驗(yàn)方案。

（1） 硫酸鹽還原菌組：所用實(shí)驗(yàn)液為硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基（STK 培養(yǎng)基，不添加顯色劑硫酸亞鐵銨）1 L，加入1 000 μg UO2（NO3）2·6H2O后121 ℃滅菌30 min。然后分別接入不同的硫酸鹽還原菌，置于無氧恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃靜置培養(yǎng)。

（2） 無菌對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)液中不接種硫酸鹽還原菌，其他參數(shù)同上。

培養(yǎng)后對(duì)兩實(shí)驗(yàn)組鈾的價(jià)態(tài)和分布情況分別進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 樣品中硫酸鹽還原菌芽孢的測(cè)定

每個(gè)巖石樣品分兩份，一份置90 ℃加熱1 min，以殺滅其中的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，另一份不做加熱處理，兩份樣品分別經(jīng)系列梯稀釋后，加入STK培養(yǎng)基于試管中28 ℃深層厭氧培養(yǎng)，每個(gè)梯度系列平行做5根試管。培養(yǎng)后觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象為陽性的試管數(shù)，其中陽性指試管中培養(yǎng)液產(chǎn)生黑色沉淀并伴有H2S產(chǎn)生。根據(jù)MPN計(jì)數(shù)法得出樣品中芽孢數(shù)量和硫酸鹽還原菌菌體總量。

2.6 鈾對(duì)硫酸鹽還原菌芽孢形成的影響

為模擬礦床中不同鈾濃度對(duì)菌體形態(tài)的影響，在配制的STK培養(yǎng)基中加入與鈾礦各巖石樣品中的鈾含量等量的UO2 （NO3）2·6H2O，121 ℃滅菌30 min后，定量接入營(yíng)養(yǎng)菌體，用無菌液體石蠟液封隔氧后置28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)后對(duì)芽孢比例進(jìn)行檢測(cè)[16]。

3 結(jié)果與分析

3.1 各類細(xì)菌分布規(guī)律

為考察東勝鈾礦床中細(xì)菌的分布規(guī)律，對(duì)不同亞帶巖石樣品中的各屬細(xì)菌進(jìn)行定性定量測(cè)定（表2）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，鈾礦各亞帶巖石中細(xì)菌的種類和數(shù)量分布均呈現(xiàn)明顯的地球化學(xué)差異性：氧化帶因氧氣含量豐富，細(xì)菌種類和數(shù)量較多，好氧的鐵細(xì)菌為其中的優(yōu)勢(shì)菌群，它們發(fā)育旺盛，增殖較快，在圍巖內(nèi)部創(chuàng)造了適合各類微生物生長(zhǎng)繁殖的微環(huán)境，但是氧化帶有機(jī)碳和硫含量較低，無法為硫酸鹽還原菌提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，影響了硫酸鹽還原菌的分布。弱氧化帶隨著氧氣濃度的下降和鈾含量的增加，細(xì)菌的種類和總量有所減少，其中鐵細(xì)菌仍是此區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌群，而硫酸鹽還原菌在此亞帶數(shù)量卻呈增多趨勢(shì)，顯示與鈾和硫含量的正相關(guān)性；其他細(xì)菌數(shù)量很少或未檢出，可能與巖石樣品所處的地球化學(xué)區(qū)域環(huán)境特征密切相關(guān)。礦石帶巖樣中主要的細(xì)菌類群為厭氧的硫酸鹽還原菌，這是因?yàn)閰^(qū)域含鈾量高，同時(shí)含氧量較低，不利于普通細(xì)菌的生長(zhǎng)，這也證實(shí)了硫酸鹽還原菌可以適應(yīng)富含高濃度鈾的環(huán)境，同時(shí)礦石帶有機(jī)碳和硫元素含量較高，能為硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)提供足夠營(yíng)養(yǎng)，是其可以廣泛分布的主要原因。還原帶氧氣含量的進(jìn)一步下降導(dǎo)致需氧微生物無法存活，因此在還原帶僅檢測(cè)到厭氧性硫酸鹽還原菌的存在，其數(shù)量比礦石帶稍有增加，成為還原帶最為活躍的微生物類型。從以上結(jié)果也可看出，微生物和其生存的生態(tài)環(huán)境之間相互影響，鈾含量、氧氣含量、有機(jī)碳和硫含量等因素共同決定了微生物類群的分布。從氧化帶到礦石帶的各亞帶樣品中均分離得到鐵細(xì)菌和含芽孢硫酸鹽還原菌，說明它們是東勝鈾礦巖石中的優(yōu)勢(shì)菌群，根據(jù)前人的研究結(jié)論，硫酸鹽還原菌為鈾礦形成中除了理化因素外的重要生物因素，而鐵細(xì)菌與硫酸鹽還原菌具有伴生關(guān)系[2]。

對(duì)東勝砂巖型鈾礦和十紅灘砂巖型鈾礦中細(xì)菌分布情況[5]橫向比較（表3）發(fā)現(xiàn)兩個(gè)鈾礦床各類細(xì)菌的種類與分布，尤其以硫酸鹽還原菌和鐵細(xì)菌的分布情況具有相似之處，即從氧化帶到礦石帶，硫酸鹽還原菌數(shù)量逐漸增加，而好氧性細(xì)菌類群種類和數(shù)量逐漸遞減，這些共性可在其他鈾礦研究工作中進(jìn)一步分析、驗(yàn)證和總結(jié)。

為了測(cè)定巖石樣品中各類硫酸鹽還原菌的分布情況，對(duì)不同亞帶巖石樣品用培養(yǎng)基在無氧環(huán)境下富集培養(yǎng)后，從產(chǎn)生黑色沉淀現(xiàn)象的樣品中分離純化得到98株典型菌株。它們?yōu)閰捬跣蜅U狀或弧狀菌，革蘭氏染色呈陰性，具備利用培養(yǎng)基中硫化物產(chǎn)生明顯的H2S氣體的特點(diǎn)。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版），對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行理化性能測(cè)定并鑒定至屬（表4）。

對(duì)分離到的硫酸鹽還原菌菌株及其分布進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，不同巖石樣品中存在不同種類的具備活性的硫酸鹽還原菌，分別屬于脫硫弧菌屬和脫硫腸狀菌屬，這是東勝鈾礦床中存在硫酸鹽還原菌最直接的生物學(xué)證據(jù)。此結(jié)果和Cai et al.[8]對(duì)東勝鈾礦中微化石形態(tài)研究后得出礦石中含有硫酸鹽還原菌的推論一致，也和姜磊等[9]對(duì)東勝鈾礦砂巖檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)存在豐富的脂肪酸，從另一角度推斷礦床中存在硫酸鹽還原菌的推斷相吻合。

分離到的硫酸鹽還原菌種類根據(jù)所處亞帶分布有所不同，其中普通脫硫弧菌只在氧化帶存在，脫硫脫硫弧菌在氧化帶和弱氧化帶有分布，而脫硫腸狀菌屬的Desulfotomaculum orientis 在各亞帶均有分布，三者分布具備一定的生物地球化學(xué)分帶性。從微生物學(xué)角度加以分析，脫硫腸狀菌在特殊環(huán)境下可以形成抗逆性極強(qiáng)的芽孢，有助于菌體適應(yīng)各種環(huán)境，為菌體能在礦床的廣泛存在提供了保障，其他兩種硫酸鹽還原菌因不具備芽孢結(jié)構(gòu)，在遇到不適合自身生長(zhǎng)的環(huán)境時(shí)，其適應(yīng)力明顯不足[17]。

3.2 硫酸鹽還原菌對(duì)鈾試劑的還原作用

已有的實(shí)驗(yàn)表明，硫酸鹽還原菌可能是影響鈾礦成礦的主要生物學(xué)因素[18?20]。為了檢測(cè)硫酸鹽還原菌在東勝鈾礦中的作用，在硫酸鹽還原菌培養(yǎng)系統(tǒng)中加入鈾試劑，經(jīng)培養(yǎng)后對(duì)還原鈾實(shí)驗(yàn)液離心，收集菌體細(xì)胞，檢測(cè)鈾在菌體細(xì)胞內(nèi)外的攜帶量，以研究硫酸鹽還原菌在鈾富集過程中的機(jī)理，同時(shí)測(cè)定鈾試劑的前后濃度變化，對(duì)比它們對(duì)于鈾試劑的還原作用強(qiáng)度（表5）。

微生物菌體具有固定各類金屬的能力。其固定機(jī)制主要有：1）將代謝物沉淀到細(xì)胞表面或者細(xì)胞內(nèi)及胞外聚合物內(nèi)；2）與吸附有關(guān)的被動(dòng)累積；3）與無機(jī)配體反應(yīng)形成沉淀；4）促進(jìn)不溶化合物沉淀于細(xì)胞外部；5）還原可溶性金屬形成無機(jī)礦物[21?23]。表5 數(shù)據(jù)表明菌體細(xì)胞中U（IV）攜帶量?jī)H為沉淀中U（IV）的10%左右，扣除純化學(xué)作用在鈾沉淀中的影響，基本可以排除硫酸鹽還原菌對(duì)鈾的胞內(nèi)外吸附作用，進(jìn)一步依據(jù)EJ 349.2—1988對(duì)沉淀中微量鈾進(jìn)行檢測(cè)，得知實(shí)驗(yàn)液沉淀中U（VI）含量隨著H2S濃度增加而遞增。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說明：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)作用過程中，硫酸鹽還原菌在增殖過程中將周圍的SO24 -還原為H2S，從中獲取其生長(zhǎng)繁殖和代謝所需要的能量[24]，產(chǎn)生的H2S為鈾礦的形成提供還原的地球化學(xué)環(huán)境，進(jìn)而將U（VI）還原為U（IV）并沉淀析出[25]。

這種菌和鈾之間的相互關(guān)系，不僅通過還原作用和溶解度來改變鈾的環(huán)境分布，而且保證了菌體能主動(dòng)改變環(huán)境因素以利于自身的生存，這種相互作用的結(jié)果最終改變了鈾的存在形式，成為生物成礦的動(dòng)力之一[26]。

對(duì)比表5中三組不同硫酸鹽還原菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，三種硫酸鹽還原菌最終檢測(cè)數(shù)量不同，其中Desulfotomaculum orientis的數(shù)量最多，同時(shí)產(chǎn)生的H2S的量最多，其對(duì)鈾的還原沉淀作用也最強(qiáng)。表4中Desulfotomaculum orientis 分布最廣泛，在礦石帶和還原帶仍大量分布，說明Desulfotomaculum orientis 是東勝鈾礦床成礦作用中的優(yōu)勢(shì)菌群，因此將其確定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的主要研究對(duì)象。

3.3 主要生物成礦因素的確定

東勝鈾礦床中發(fā)現(xiàn)的硫酸鹽還原菌具備一定分布規(guī)律，從氧化帶到還原帶菌的種類分布越來越少，礦石帶和還原帶僅有Desulfotomaculum orientis 存在，早期已研究的新疆十紅灘鈾礦各亞帶菌體分布也符合此規(guī)律[5]。此結(jié)果是從已確定位置的礦床中研究細(xì)菌分布得出的規(guī)律，但是此規(guī)律并不能作為生物成礦的充分必要條件，因?yàn)樵S多環(huán)境中都會(huì)有脫硫腸狀菌的混合或單獨(dú)存在，因此有必要從中找到更加準(zhǔn)確的證據(jù)。

3.3.1 間接證據(jù)

硫酸鹽還原菌參與砂巖型鈾礦成礦的間接證據(jù)是，與鈾礦物具有成因聯(lián)系的其他礦物所反映的能指示其參與成礦的依據(jù)[27]，如與鈾礦具有共生關(guān)系的黃鐵礦的δ34S。已有的研究表明，鄂爾多斯盆地東勝鈾礦床沙沙圪臺(tái)礦區(qū)氧化還原過渡帶部位黃鐵礦的δ34S介于-39.2‰～+15.8‰[28]，總體具有地層生物成因硫的特征，說明黃鐵礦的形成主要由硫酸鹽還原菌提供硫源，進(jìn)而間接表明與黃鐵礦共生的鈾礦也形成于硫酸鹽還原菌的作用。其他研究包括東勝砂巖型鈾礦石中發(fā)現(xiàn)可參與還原硫酸鹽的微生物化石[8]，東勝鈾礦床中發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌和硫氧化菌類脂[9]等，這些研究結(jié)果也從側(cè)面證明了硫酸鹽還原菌曾參與鈾礦的形成。

3.3.2 正向證據(jù)

參考王紅梅等[16]研究微生物作為金礦找礦依據(jù)的思路，以鈾礦各亞帶普遍存在的Desulfotomaculumorientis為研究對(duì)象，對(duì)它們?cè)诟鱽啂r層中的天然分布狀態(tài)進(jìn)行定性定量分析，以確定菌體是以營(yíng)養(yǎng)體存在還是以芽孢形式存在、及其營(yíng)養(yǎng)體和芽孢所占的比例（表6）。結(jié)果顯示，硫酸鹽還原菌的芽孢數(shù)目和樣品中鈾含量呈正相關(guān)性，隨著樣品中鈾含量的增加，芽孢所占比例越來越高，可推斷具有電離輻射屬性和化學(xué)毒性的鈾對(duì)Desulfotomaculum orientis 的形態(tài)具有明顯影響。然而，礦石帶Desulfotomaculum orientis依然有少部分以營(yíng)養(yǎng)體形式存在，可見其在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中不斷提高了自身適應(yīng)力，而且還能通過不斷還原鈾，主動(dòng)改變所賦存的環(huán)境中鈾的含量，以達(dá)到自我保護(hù)的效果。而抵抗力極強(qiáng)的芽孢可以幫助菌體在不良環(huán)境中存在，并通過自身代謝促進(jìn)礦床的形成，隨著還原帶鈾含量的降低，芽孢又可以萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，高濃度的鈾能促使細(xì)菌轉(zhuǎn)化成芽孢，這在微生物學(xué)上是一種常見現(xiàn)象。

3.3.3 反向證據(jù)

按2.6實(shí)驗(yàn)方法模擬與各巖石樣品中相同鈾濃度的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，加入同等起始濃度的Desulfotomaculumorientis 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)后觀察芽孢所占比例（表7）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，即使排除了背景因素差異干擾，僅改變實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的鈾濃度、其他采用相同的初始條件的實(shí)驗(yàn)情況下，環(huán)境中鈾濃度越高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中芽孢所占比例越大，鈾濃度影響了芽孢的形成率。同時(shí)對(duì)表6和表7數(shù)據(jù)進(jìn)行比較作圖，分析含巖石實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和含鈾試劑模擬實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的芽孢比例（圖2）。

含巖石實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的Desulfotomaculum orientis芽孢比例和含鈾試劑模擬實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)培養(yǎng)出的菌體芽孢比例擬合度較高，說明兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)合鈾礦巖石樣品中Desulfotomaculum orientis 形態(tài)分布的數(shù)據(jù)說明，鈾含量和菌體形態(tài)之間的關(guān)系可能是相互的，即巖石中鈾含量的不同可以影響菌體的存在狀態(tài)，而Desulfotomaculum orientis 也可以通過適應(yīng)環(huán)境，保證自身生存的同時(shí)，影響鈾礦的形成。模擬實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中脫硫腸狀菌狀態(tài)分布數(shù)據(jù)則從反向進(jìn)一步表明，環(huán)境中不同的鈾濃度確實(shí)可以影響Desulfotomaculum orientis 的存在狀態(tài)。由于Desulfotomaculum orientis 在礦床各亞帶普遍存在，因此通過檢測(cè)不同區(qū)域Desulfotomaculum orientis 的分布以及芽孢所占比例，可作為鈾礦分帶和定位的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

（1） 東勝砂巖型鈾礦床中細(xì)菌的分布呈現(xiàn)明顯的地球化學(xué)差異性：氧化帶菌體數(shù)量和種類均較多，該區(qū)域礦石中各類元素供給充裕，它們發(fā)育旺盛，增殖較快，在圍巖內(nèi)部創(chuàng)造了適合各類微生物生長(zhǎng)繁殖的微環(huán)境；弱氧化帶受圍巖中含鈾量增加等因素影響，細(xì)菌種類和總量開始減少；礦石帶菌體種類單一，主要的菌體種類為硫酸鹽還原菌和伴生的鐵細(xì)菌；還原帶環(huán)境中無氧氣，環(huán)境中僅有厭氧的硫酸鹽還原菌存在。細(xì)菌類群的分布與巖石樣品所處的地球化學(xué)區(qū)域環(huán)境相關(guān)，此分布規(guī)律與新疆十紅灘鈾礦床中細(xì)菌類群的分布規(guī)律類似。

（2） 硫酸鹽還原菌能利用環(huán)境中的硫產(chǎn)生H2S，形成的還原環(huán)境有利于將U（VI）還原為U（IV）并沉淀析出，是有利于鈾礦床形成的主要微生物因素，具有芽孢結(jié)構(gòu)的Desulfotomaculum orientis 相對(duì)于其他種屬的硫酸鹽還原菌適應(yīng)能力和還原能力更強(qiáng)，是礦床形成中的主力菌群。

（3） 天然狀態(tài)和模擬狀態(tài)的Desulfotomaculumorientis 均受高濃度鈾的影響，使其由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎?，芽孢形成的比例和鈾濃度正相關(guān)。由此可推論，含鈾量高的礦體，Desulfotomaculum orientis 大部分轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎咝问酱嬖?，因此可推測(cè)具備芽孢的Desulfotomaculum orientis 是成礦作用中的主要生物因素，其兩種生命形態(tài)的分布規(guī)律，對(duì)于生物找礦工作同樣具有指導(dǎo)意義。