趙娜　常劍波　陶江平　孫行

摘要：利用野外和人工繁殖中華鱘（Acipenser sinensis）均有的產(chǎn)卵洄游入海特性，通過在長江口水域捕獲滯留的中華鱘幼魚并區(qū)分人工繁殖放流個體和野外個體，可以評估其人工繁殖放流個體占比情況?；诿系聽栠z傳模式，在應(yīng)用前期開發(fā)中華鱘特異性四倍體微衛(wèi)星標(biāo)記的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了基于四倍體微衛(wèi)星位點遺傳模式的親子鑒定方法，并用全同胞家系、半同胞家系和非親緣關(guān)系群體樣本驗證方法的有效性，將此方法用于1999年度中華鱘人工繁殖效果評估案例中，計算人工繁殖個體在長江口中華鱘幼鱘群體中的比例。結(jié)果顯示，3個全同胞家系個體間的平均遺傳距離分別為0.43、0.44和0.44，半同胞家系的遺傳距離居中（0.57），長江口中華鱘幼鱘群體間的平均遺傳距離為0.74。人工繁殖效果評估顯示，在2000年度長江口幼魚群體中，人工繁殖個體的比例較低（0～3.8%）。研究表明，當(dāng)年度中華鱘補(bǔ)充群體主要來源于自然繁殖，需要繼續(xù)加大對中華鱘野生群體的保護(hù)力度，增加人工繁殖群體的放流規(guī)模。

關(guān)鍵詞： 中華鱘；親子鑒定；人工繁殖；自然群體；微衛(wèi)星DNA

中圖分類號：Q503? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2023）05-0092-08

中華鱘屬于大型溯河產(chǎn)卵洄游魚類，其生活史復(fù)雜（Wu，1963；Ke & Tian，1988；Chang & Cao，1999）；對長江群體而言，其生活史大多在中國黃海和東海大陸架海域度過（Wu，1963；Zhang，1988）。每年春夏季，即將成熟的繁殖群體進(jìn)入長江口并溯河而上，在長江度過14～17個月，繁殖后返回大海（Zhang，1988；危起偉，2003；Zhuang et al，2009）。秋季在葛洲壩壩下江段自然繁殖的中華鱘受精卵，在產(chǎn)卵場孵化后隨水流向長江下游漂移（莊平，1999；Zhuang et al，2002）；幼鱘一般于次年4月中旬到達(dá)或接近長江口滸浦江段，5月中下旬開始出現(xiàn)在長江口（危起偉，2003）。

1981年實現(xiàn)長江截流的葛洲壩一期工程阻斷了中華鱘繁殖洄游通道，隨后天然種群數(shù)量急劇減少，1983年長江中華鱘人工繁殖放流工作開展。危起偉（2003）采用微型線碼標(biāo)志（Coded Wire Tag，CWT）和外掛銀制標(biāo)志牌的方法研究幼鱘遷移路線，發(fā)現(xiàn)人工放流的中華鱘2月齡幼鱘具有與自然種群相似的洄游特性，最早在第二年3月到達(dá)長江口。由于野外和人工繁殖中華鱘幼鱘有這種相似的歸海洄游特性，在長江口捕獲的滯留幼鱘中，包含了野外和人工繁殖放流個體，因此為評價人工繁殖放流個體占比提供了途徑。前期已有學(xué)者分別應(yīng)用熒光染色、微衛(wèi)星和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合以及CWT方法進(jìn)行人工繁殖放流效果評估（常劍波，1999；Zhu et al，2002；危起偉，2003）。水工程生態(tài)研究所實驗室通過多年研究，積累了大量自行開發(fā)的中華鱘特異性微衛(wèi)星DNA標(biāo)記（Zhu et al，2005），并對其多倍體模式進(jìn)行了深入分析（Zhao et al，2015）。本研究擬采用四倍體遺傳模式的中華鱘特異性微衛(wèi)星標(biāo)記，構(gòu)建其在親子關(guān)系判別中的統(tǒng)計分析方法，并應(yīng)用本方法鑒定和區(qū)分長江口幼鱘自然繁殖放流個體，評估當(dāng)年度長江口中華鱘人工繁殖放流個體占比。

1? ?材料和方法

1.1? ?材料選取

1.1.1? ?人工繁殖家系樣本? ?本研究中的樣本來自水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所樣本庫。為檢驗本研究統(tǒng)計方法的準(zhǔn)確性，將2001年長江水產(chǎn)研究所通過人工催產(chǎn)方法獲得的3個人工繁殖家系作為檢驗樣本，其中A和B是同父異母的半同胞家系（表1）。研究中分別用Af、Bf和Cf代表3個家系的母本，ABm代表A、B家系的同一父本，Cm為C家系父本。家系子代個體分別用A1～A27，B1～B26和C1～C43編號。親本取鰭條或肌肉樣本保存在無水乙醇中。子代樣本用70%乙醇溶液浸泡，置于4℃冰箱中備用。

1.1.2? ?人工繁殖和放流親本? ?1999年度中華鱘人工繁殖放流工作由葛洲壩中華鱘研究所和長江水產(chǎn)研究所共同承擔(dān)。當(dāng)年一對親本1999-YL-103（♂）×1999-YR-402（♀）配對繁殖成功；1999年12月28日，中華鱘研究所成功放流這對親本繁殖的子代30 000尾。

1.1.3? ?長江口幼鱘群體樣本? ?2000年5-7月，在長江口崇明島東旺沙和團(tuán)結(jié)沙地區(qū)，通過插網(wǎng)方式和收集漁民誤捕共采集到幼鱘90尾，以Juv表示幼鱘個體。每尾幼鱘剪取2～4 cm2的尾鰭或胸鰭作為樣本，浸泡于無水乙醇中保存，活體重新放回長江口，已死亡的個體用乙醇浸泡后帶回實驗室保存。樣本編號為Juv01～Juv90。

1.2? ?微衛(wèi)星引物來源

水工程生態(tài)研究所實驗室自行開發(fā)的中華鱘微衛(wèi)星特異性引物As-073、As-074和As-102擴(kuò)增圖譜清晰、穩(wěn)定，并具有較強(qiáng)的個體識別能力（Zhao et al，2005；2015）。微衛(wèi)星位點特征（Zhu et al，2005）見表2。

1.3? ?PCR方法

使用DNeasy 組織試劑盒 （Qiagen，Valencia，CA，USA） 提取DNA樣本。PCR 10 μL反應(yīng)體系包括正反向引物各1 μM，dNTP 0.2 mM，0.4 U Taq DNA聚合酶和10～15 ng模板DNA。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，45個循環(huán)，包括94℃變性40 s，56℃或58℃退火40 s，72℃延伸50 s；72℃最后延伸10 min。以H2O為模板設(shè)置PCR陰性對照。采樣陰性對照和PCR陰性對照，擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠（19：1），于200 V電壓下電泳3.5 h，溴化乙錠染色20 min，用Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)（SynGene，英國）掃描記錄。通過GeneTool凝膠分析軟件（SynGene）比對pBR322 DNA/Msp Ⅰ Markers并確定片段大小。根據(jù)微衛(wèi)星片段長度進(jìn)行基因分型。

1.4? ?數(shù)據(jù)分析

研究中應(yīng)用的微衛(wèi)星位點均在中華鱘上呈現(xiàn)四倍體孟德爾遺傳模式（Zhao & Chang，2006；Zhao et al，2015），即每個親本在1個位點上攜帶4個等位基因，形成配子時，都會有任意2個等位基因隨機(jī)組合并遺傳給子代（圖1）。因此，可以通過計算長江口子代個體與葛洲壩放流親本之間的遺傳距離來判斷是否存在親子關(guān)系，從而評估人工繁殖放流個體占比。

首先，明確所有研究個體的基因型。如在1個微衛(wèi)星位點檢測到6個等位基因，分別是220 bp（等位基因1）、224 bp（等位基因2）、228 bp（等位基因3）、232 bp（等位基因4）、236 bp（等位基因5）、240 bp（等位基因6）長度的片段，可以用片段長度（220/224/232/240）表示1個個體的基因型，也可以用基因編號（1/2/4/6）表示，本研究采用基因編號型。如同二倍體中的純合子，四倍體中也有攜帶相同等位基因的情況出現(xiàn)，稱之為“劑量”，可以通過測序圖譜的峰值或者電泳凝膠的亮度判斷（如圖2中個體4和個體5）。在這種情況下，用（1/1/2/3）表示基因型。如果有無效等位基因的存在，可能會出現(xiàn)（1/2/3）情況。

第二步，根據(jù)Lynch（1990）公式計算個體之間的遺傳距離：

Dxy = 1- [2NxyNx+Ny]? ?①

式中：Dxy表示個體x和個體y之間的遺傳距離；Nxy表示個體x和y在一個微衛(wèi)星位點上共有的等位基因數(shù)目；Nx和Ny分別表示個體x、y在這個位點上所擁有的所有等位基因數(shù)目。本研究中使用的3個微衛(wèi)星位點是四倍體位點，因此N應(yīng)該是4。在雙親基因型完全相同的情況下，子代與親本的遺傳距離可能是0（D = 1- [2×44+4] ）。在沒有無效等位基因和雙親不共享任一等位基因的情況下，子代與親本的遺傳距離應(yīng)該是0.5（D = 1- [2×24+4]）。但也存在1個無效等位基因的情況下，N會是3（更多無效等位基因的情況不考慮）。因此，若子代與成體存在親子關(guān)系，則至少會共有1個（有無效等位基因存在）或2個（正常情況）等位基因，其遺傳距離可能會是0.714 （D = 1- [2×13+4]）或者0.429 （D = 1- [2×23+4]）。所以，只有當(dāng)子代個體同繁殖父本、母本之間距離都在這個范圍內(nèi)時，才可以判定其是真實子代。

為檢驗方法的準(zhǔn)確性，首先用引物As-073對3個家系樣本進(jìn)行驗證；另外，分析全同胞、半同胞和無親緣關(guān)系3種情況下個體之間的遺傳距離；最后，分析長江口幼鱘和葛洲壩放流親本之間的遺傳距離，判斷是否存在親子關(guān)系，評估人工繁殖的子代在長江口幼鱘群體中的占比。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?已知親緣關(guān)系的家系子代與親本的遺傳距離

在As-073位點上3個已知親緣關(guān)系的家系中個體之間的遺傳距離見表3。家系A(chǔ)中，絕大多數(shù)子代個體與親本的遺傳距離是0.5，由于父本和母本的基因型分別為2/3/11/11 和2/5/6/8，共享一個等位基因2，因此有部分子代與親本的遺傳距離是0.25。在家系B中，同樣是雙親（2/3/11/11 ×1/2/10/12）共享等位基因2，因此也有部分子代與親本的遺傳距離表現(xiàn)為0.25。在家系C中，雙親的基因型分別為2/3/5/9 和4/4/7/8，不共享任何等位基因，子代個體從雙親中遺傳任意2個等位基因的組合；在這些組合中，沒有等位基因相同的可能性，因此所有子代都一致性地表現(xiàn)出與親本的遺傳距離為0.5；子代C16和C41個體DNA樣品提取不成功，因此沒有獲得遺傳學(xué)數(shù)據(jù)；除5個個體（C9、C12、C20、C36和C42）與C家系雙親遺傳距離為0.5外，同時與A家系親本之間的遺傳距離也為0.5，這是因為家系A(chǔ)雙親的基因型為2/3/11/11和2/5/6/8，家系C雙親的基因型為2/3/5/9和4/4/7/8，2個家系的雙親之間共有等位基因2、3、5、8；以家系C9子代為例，具有基因型2/3/4/8，那么其與Af、ABm、Cm和Cf任一親本都共有2個等位基因，因此遺傳距離均為0.5。

在As-073位點上，3個家系的遺傳圖譜沒有揭示無效等位基因的存在。因此，如果疑似親本是真實的，子代與疑似雙親之間的遺傳距離都應(yīng)在0～0.5，單是與一方親本的遺傳距離不在這個范圍內(nèi)都將被排除。照此標(biāo)準(zhǔn)判斷，A家系的27個子代都準(zhǔn)確地定位于雙親Af×ABm中，準(zhǔn)確率為100%；B家系的26個子代也全部歸屬于雙親Bf×ABm中；C家系43個子代中的38個個體判斷為親本Cm×Cf 的后代，準(zhǔn)確率為88.4%。對于其余5個個體（C9、C12、C20、C36、C42），若要正確判斷是雙親Cm×Cf 的后代，還是雙親Af×ABm的后代，需要使用更多的微衛(wèi)星位點。

2.2? ?不同親緣關(guān)系的個體間遺傳距離

全同胞家系、半同胞家系以及無親緣關(guān)系的個體間遺傳距離分布見圖3。其中，A、B、C為3個全同胞家系，其內(nèi)部同胞個體間平均距離分別為0.43、0.44、0.44，平均值為0.437；A和B是同父異母的半同胞家系，個體間平均距離為0.57；A和C家系個體間平均距離為0.73，B和C家系間平均距離為0.83；長江口隨機(jī)采樣的中華鱘幼鱘個體間平均距離為0.74。

2.3? ?長江口幼鱘群體人工繁殖放流個體占比

2000年長江口采集的90尾幼鱘中，只有52尾在As-073、As-074和As-102全部3個位點得到清晰并可準(zhǔn)確計帶的指紋圖譜，因此只對這些幼鱘的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。2000年長江口捕獲的幼鱘個體與1999年參與人工繁殖放流親本之間的遺傳距離見表4。1999年成功參與人工繁殖的一對親鱘用♀、♂表示。♀在As-073和As-074位點上都只擴(kuò)增出3個亮度相同的條帶，因此存在1個無效等位基因；在隨后的距離分析中，疑似子代與♀、♂之間遺傳距離在0～0.714都應(yīng)該判斷為其子代個體。

單個位點的分析結(jié)果顯示，在As-073位點上，有13個個體與♀、♂遺傳距離在0～0.714，疑似子代比例為25%；As-074位點上，62%的個體為疑似子代；As-102位點上，疑似子代的比例最小，僅21%。

2個位點的聯(lián)合使用結(jié)果顯示，As-073/As-074組合排他能力最弱，判斷8個個體為疑似子代，比例為15.4%；As-073/As-102組合的排他能力最強(qiáng)，判斷2個為疑似子代，比例為3.8%；As-074/As-102組合的排他能力居中，判斷疑似子代為6個，比例為11.5%。

3個位點聯(lián)合使用后，只有Juv40個體與♀、♂遺傳距離滿足判別條件，因此在52個長江口幼鱘中，只有1尾被判斷為人工繁殖放流的子代個體，僅為1.9%。隨著更多微衛(wèi)星位點的使用，Juv 40個體與♀、♂之間的親子關(guān)系也可能會被排除，因此2000年捕獲的長江口幼鱘群體屬人工繁殖放流的個體僅占0～1.9%。

3? ? 討論

3.1? ?微衛(wèi)星標(biāo)記用于親子分析的技術(shù)缺陷

微衛(wèi)星標(biāo)記由于高度多態(tài)性，在親子鑒定中有很強(qiáng)的個體識別能力 （Hansen et al，2001;Wilson & Ferguson，2002;Baumsteiger et al，2008）；但標(biāo)記本身也存在技術(shù)缺陷 （Van Oosterhout et al，2004），如無效等位基因、連鎖不平衡、突變或者計帶錯誤等原因，都會造成子代基因型與真實親本不相符，從而降低親子鑒定的準(zhǔn)確性 （Wilson & Ferguson，2002; Neff et al，2000a; 2000b; Gold et al，2011）。無效等位基因的存在可以導(dǎo)致哈迪-溫伯格平衡偏離，因此可以通過群體研究檢測出無效等位基因存在與否。在親子分析中，位點物理連鎖或者連鎖不平衡所造成的結(jié)果不同 （Waples，2006; Waples & Do，2010）。在使用存在連鎖不平衡的2個位點時，由于位點之間存在的非隨機(jī)聯(lián)合，減少了有效的變化水平，因此降低了標(biāo)記的排除能力和親子鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而，在實際研究中，由于應(yīng)用的標(biāo)記位點較少，多數(shù)研究者都假設(shè)這些位點不存在物理連鎖或連鎖不平衡；另外，由于對基因突變機(jī)制的認(rèn)識不足，識別突變問題最好的途徑是比較親本和子代的遺傳圖譜 （Neff et al，2000a; 2000b）。

3.2? ?實際應(yīng)用中微衛(wèi)星標(biāo)記的選擇

本研究中，位點As-102具有最高的個體識別能力（排除能力強(qiáng)），As-073居中，As-074的識別能力最小。親子鑒定的準(zhǔn)確性依賴于使用的統(tǒng)計方法，同時也受到標(biāo)記本身的影響。使用的多態(tài)性位點數(shù)目越多，鑒定結(jié)果越接近真實情況。但在實際應(yīng)用中，考慮實驗成本和實驗時間等因素（Jone & Ardren，2003），使用高效標(biāo)記位點可以達(dá)到事半功倍的效果。如使用排他能力最強(qiáng)的As-073/As-102組合，排除了52個子代中的50個個體；使用排他能力最弱的As-073/As-074組合，只能排除44個個體。因此，檢驗微衛(wèi)星位點的個體識別能力也是親子鑒定實踐中的重要一環(huán)。

3.3? ?平均遺傳距離揭示的親緣關(guān)系

四倍體生物微衛(wèi)星位點遺傳模式復(fù)雜 （Jones & Ardren，2003;Jones et al，2010），特別是當(dāng)雙親之間共享等位基因或者存在無效等位基因時，同胞個體之間的遺傳距離變化很大。通過計算兩兩個體之間的平均遺傳距離，可以粗略揭示其親緣關(guān)系。本次研究中，家系A(chǔ)、B、C盡管樣本量有差異，但3個全同胞家系的平均遺傳距離很接近（0.43、0.44、0.44）；A和C家系的親本共享4個等位基因，因此個體之間的平均遺傳距離要小于不共享任一等位基因的B和C家系（0.73<0.83）。A和B家系屬于半同胞家系，因此遺傳距離居中（0.57），這也從側(cè)面驗證了本研究數(shù)據(jù)處理方法的可行性；此分析方法可用于魚類人工增殖放流效果評價、魚類個體間親緣關(guān)系判別、集群魚類的分布與擴(kuò)散模式分析以及魚類養(yǎng)殖中的遺傳學(xué)管理等 （Berejikian et al，2001; Hansen et al，2001; Blouin，2003; Suski et al，2003; Hessenauer et al，2012; Hessenauer et al，2014）。

3.4? ?當(dāng)年度長江口人工繁殖放流個體占比

危起偉（2003）采用CWT和外掛銀制標(biāo)志牌的方法對人工放流的部分幼鱘進(jìn)行標(biāo)記放流和回捕試驗，發(fā)現(xiàn)人工放流對長江口幼鱘的補(bǔ)充作用不明顯，連續(xù)4年（1998-2002）各標(biāo)志放流約2萬尾對長江口幼鱘群體的貢獻(xiàn)率為0～0.45%；常劍波（1999）根據(jù)熒光標(biāo)記放流，估算1996-1999年全長8～10 cm人工放流個體占長江口幼鱘的數(shù)量分別為1.71%、1.89% 和3.03%；Zhu等（2002）應(yīng)用中華鱘微衛(wèi)星數(shù)據(jù)按照二倍體顯性標(biāo)記（只記錄圖譜條帶有無，不考慮劑量）的分析方法評價人工繁殖放流效果，發(fā)現(xiàn)1999年度放流的中華鱘人工繁殖個體在長江口幼鱘群體中占5%～10%，2000年度人工放流個體占13.3%。本研究結(jié)果評估1999年度中華鱘人工繁殖放流個體對長江口中華鱘幼魚群體的貢獻(xiàn)率為0～1.9%。以上結(jié)果均表明，各研究年度內(nèi)中華鱘補(bǔ)充群體主要來源于自然繁殖，珍稀特有物種的恢復(fù)十分艱難，需要繼續(xù)加大對中華鱘野生群體的保護(hù)力度，增加人工繁殖群體的放流規(guī)模。

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（責(zé)任編輯? ?萬月華）

Parentage Identification and Case Analysis of Chinese Sturgeon

（Acipenser sinensis） Populations Based on Microsatellite Markers

ZHAO Na1， CHANG Jian‐bo2， TAO Jiang‐ping1， SUN Hang1

（1. Key Laboratory of Ecological Impacts of Hydraulic-Projects and Restoration of Aquatic Ecosystem

of Ministry of Water Resources， Institute of Hydroecology， Ministry of Water Resources and

Chinese Academy of Sciences， Wuhan? ?430079， P.R. China;

2. State Key Laboratory of Water Resources and Hydropower Engineering Science，

Wuhan University，Wuhan? ?430072， P.R. China）

Abstract：Artificially propagated juvenile Chinese sturgeons have the same migration pattern of arriving at the estuary of the Yangtze River. This provides a way to evaluate the effect of artificial breeding and release of Chinese sturgeon by distinguishing between artificially bred and wild individuals collected in the estuary of Yangtze River. Based on Mendelian inheritance and previously developed tetraploid microsatellite markers for Chinese sturgeon， a paternity test method using a tetraploid microsatellite locus inheritance model was constructed and verified with specimens of full-sibling families， half-sibling families and unrelated populations. This method was then applied to determine the percentage of released artificial individuals among the wild Chinese sturgeons in 90 samples collected in the Yangtze River estuary from May to July of 2000. The results were used to evaluate the effectiveness of the artificial bred Chinese sturgeon released on December 28， 1999. The average genetic distance of the three full-sib families calculated by the paternity testing was 0.43， 0.44 and 0.44. The genetic distance of the half-sib family was 0.57. The distance among the juveniles collected in the estuary was 0.74 and the proportion of artificially propagated individuals among juveniles collected in 2000 was in the range of 0-3.8%. Most of the juveniles in the estuary were therefore from natural reproduction. It is necessary to continue to strengthen the protection of the wild population of Chinese sturgeon and increase the scale of the release of artificial breeding population.

Key words：Acipenser sinensis; paternity testing; artificial breeding; natural population; microsatellite DNA

收稿日期：2020-06-08? ? ? 修回日期：2023-06-12

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目（2015CB150701）。

作者簡介：趙娜，1978年，女，博士，研究員，主要從事分子生態(tài)學(xué)研究。E-mail：zhaona@mail.ihe.ac.cn