劉 英,程敏菊,魏鵬輝

1.開灤總醫(yī)院心內(nèi)科,唐山 063000;2.邢臺市人民醫(yī)院心臟內(nèi)科,邢臺 054000;3.華北醫(yī)療集團峰峰總醫(yī)院心內(nèi)科,邯鄲 056000

冠心病(coronary heart disease, CHD)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病,也稱缺血性心臟病[1]。冠心病主要由心臟自身供血不足或冠狀動脈粥樣硬化引起的血管管內(nèi)狹窄,其極易形成斑塊或阻塞血管,引發(fā)心肌細胞缺血、缺氧、死亡等[2-3]。川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)是由川芎中分離出的有效成分之一,臨床上常用于治療哮喘、高血壓、血栓等疾病[4-5]。本研究旨在通過建立CHD大鼠模型,探討TMP對CHD大鼠心肌損傷的影響及其可能的作用機制,為TMP藥物開發(fā)及冠心病臨床治療提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標儀(SpectraMax M5, 美國Molecular Devices公司)。

1.2 試藥

1.3 動物

65只7周齡SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量210～230 g。動物來源于河南省實驗動物中心,生產(chǎn)許可證號為SCXK(豫)2017-0001。所有實驗大鼠購回后先在動物室內(nèi)適應性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)所有飼養(yǎng)設備均經(jīng)過高壓、高溫滅菌,飼養(yǎng)環(huán)境室內(nèi)溫度調(diào)節(jié)范圍為22 ℃～24 ℃,濕度調(diào)節(jié)范圍為45%～55%,每隔8 h進行1次換氣,保持空氣潔凈,環(huán)境光暗周期為光照12 h、黑暗12 h,適應期間給予普通飼養(yǎng)且自由飲水,每周更換墊料并消毒3次。

2 方法

2.1 CHD大鼠模型的建立

適應性飼養(yǎng)1周后,隨機選取50只大鼠給予高脂飲食(配方各成分質(zhì)量分數(shù):基礎飼料70%,豬油10%,蔗糖10%,膽固醇1.5%,奶粉3.5%,纖維素5%)飼養(yǎng)8周,并在8周后,每天上午同一時段腹腔注射30 μg·kg-1垂體后葉素,連續(xù)3 d,建立CHD大鼠模型[6]。末次給藥后,采集大鼠尾靜脈血液,用全自動生化檢測儀測定大鼠各項血脂水平,若大鼠TC、TG水平呈倍數(shù)增加,且LDL-C水平明顯上升,則視為建模成功[7]。

2.2 分組與給藥

2.3 樣本檢測

2.3.1樣本采集 各組大鼠給藥4周后,禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,開腹,采集大鼠腹主動脈血液。血液靜置4 h,以3 000 r·min-1、離心半徑為12 cm高速離心機離心15 min,分離血清,液氮凍存。采血結束后,冰上剝離大鼠心臟組織,生理鹽水沖洗后,切取一部分組織,按1∶9的比例加入預冷的生理鹽水,充分研磨后置于高速離心機離心15 min,取上清液制備10 g·L-1組織勻漿樣品。再剪取左側(cè)冠狀面中部的心肌組織,用預冷的生理鹽水多次沖洗,再用4 g·mL-1多聚甲醛液固定24 h,備用,其余組織裝入無菌凍存管內(nèi),-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2炎癥因子檢測 取出分離好的血清和ELISA試劑盒,試劑盒恢復至室溫后開始檢測,按照TNF-α、IL-1β和IL-6試劑盒說明書操作,加待測樣品20 μL于測定孔和空白孔、雙蒸水20 μL于對照孔、酶工作液20 μL于對照孔和測定孔、酶稀釋液20 μL于空白孔、底物應用液200 μL于各孔,覆膜37 ℃孵育20 min,重復2次。加入終止液50 μL,終止反應。根據(jù)對照品梯度質(zhì)量濃度結果建立標準曲線,計算樣本質(zhì)量濃度。

2.3.3心損標記因子檢測 將分離好的血清和ELISA試劑盒從冰箱內(nèi)取出,將試劑盒放置室內(nèi)30 min,恢復至室溫后開始檢測,按照試劑盒說明方法測定血清中Mb、CK和CK-MB的含量。先將板孔分為空白孔、樣品孔和標準孔,加入稀釋好的待檢樣品10 μL、稀釋液40 μL,封膜37 ℃孵育30 min,棄液清洗,加入酶標液50 μL,封膜37 ℃孵育30 min,棄液清洗,加入顯色工作液A與工作液B,至呈現(xiàn)顏色梯度時加入50 μL終止液終止反應。用酶標儀在450 nm處測各孔A值,根據(jù)對照品質(zhì)量濃度曲線計算樣品質(zhì)量濃度。

2.3.4氧化應激因子檢測 取制備好的組織勻漿樣品,按照MDA、GSH-Px和SOD試劑盒說明書操作,加入0.1 mL裂解液制備上清液。取適量對照品加入蒸餾水分別稀釋至1、2、5、10、20、50 μmol·L-1制備檢測工作液用于制作標準曲線。再取0.1 mL裂解液加入空白EP管作為對照,其他管內(nèi)分別加入不同質(zhì)量濃度的對照品,添加待測樣品0.1 mL、檢測工作液0.2 mL。待工作液與樣品充分混合后,置于水浴鍋60 ℃ 15 min,水浴結束后冷卻至室溫,以12 000 r·min-1離心10 min,離心半徑12 cm。取上清液200 μL,加入板孔中,于酶標儀532 nm處檢測其吸光度值,根據(jù)標準曲線計算樣品質(zhì)量濃度。

2.3.5HE染色觀察 取出經(jīng)甲醛固定24 h的心肌組織,流水沖洗去除固定液,不同梯度乙醇溶液進行脫蠟脫水,浸入軟蠟、硬蠟各10 min,包埋完成后放入-20 ℃的冰箱內(nèi)20 min,取出,恢復至室溫,切片厚度為4 μm,置于37 ℃烤箱過夜,60 ℃烤箱內(nèi)60 min,切片脫蠟脫水,蘇木精染色液染色2 min,鹽酸乙醇分化5 s,流水返藍10 min,伊紅溶液染色1 min,蒸餾水清洗3次,中性樹脂封片。陰涼處晾干,將心肌組織切片置于光學顯微鏡下觀察并拍片。

2.3.6AMPK、Nrf-2和HO-1 mRNA表達 取備用心肌組織加入裂解液1 mL,研磨30 s,用TRIzol沉淀法從心肌組織中分離出總RNA,取1 μL RNA樣品測定吸光值和質(zhì)量濃度進行質(zhì)量分數(shù)檢測。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,配制PCR反應體系為Tap酶0.4 μL,2×Rrel-time PCR Master Mix 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 5.6 μL。引物序列為AMPK:上游(5′-GTGGAGT-CCTGAACGGCTAG-3′),下游(5′-GTGCAGGCTTAACGAATTCG-3′);Nrf-2:上游(5′-GCGTAACCTTTCAGGCGTCT-3′),下游(5′-CTTCCGAAGT-CCAGATCGAT-3′);HO-1:上游(5′-AACAGATGTTTCAACAGCAC-3′),下游(5′-GGGTTGATGGCACTGTTGAG-3′);GAPDH:上游(5′-TTGCCTAGAACTGACGGAGA-3′),下游(5′-GAAATACGGTGATTCCATGG-3′)。PCR擴增條件為:95 ℃ 10 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,進行40個循環(huán),繪制熔解曲線,以ΔCt值和2-△△CT進行數(shù)據(jù)分析,計算待測樣品目的基因相對定量。

2.3.7AMPK、Nrf-2和HO-1蛋白表達 取備用心肌組織與預冷的PBS緩沖液混勻,離心提取總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。取蛋白樣品于EP管中,加入5×loding buffer于100 ℃水浴鍋5 min,冷卻后進行蛋白凝膠電泳,恒壓80 V電泳30 min,120 V電泳120 min,至溴酚藍剛跑出即停。轉(zhuǎn)至PVDF膜,在室溫內(nèi)于牛奶封閉液60 min,TBST洗膜加入1∶2 000稀釋一抗,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜5 min×3次,加入1∶5 000稀釋二抗,孵育2 h,TBST洗膜5 min×3次。配制ECL顯色劑,加入ECL顯色劑充分浸泡,暗室曝光顯影。進行凝膠圖像分析,對目的條帶光密度值進行分析。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 炎癥因子比較

與對照組比較,模型組TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高(P<0.05)。與模型組比,3組大鼠3項數(shù)值降低(P<0.05)。與TMP低劑量組比,TMP高劑量組和西藥組大鼠3項數(shù)值降低(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項數(shù)值與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

3.2 心損標記因子比較

與對照組比較,模型組Mb、CK和CK-MB水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠3項數(shù)值降低(P<0.05)。與TMP低劑量組比較,TMP高劑量組和西藥組大鼠3項數(shù)值降低(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項數(shù)值與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心損標記因子水平比較

3.3 氧化應激因子比較

與對照組比較,模型組大鼠血清MDA水平升高,GSH-Px和SOD水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05)。與TMP低劑量組比較,TMP高劑量組和西藥組大鼠MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項數(shù)值與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠氧化應激因子水平比較

3.4 心肌組織HE染色比較

對照組大鼠心肌細胞排列整齊,細胞邊界清晰,染色均勻。心肌纖維結構完整,未見炎性細胞浸潤,存在少量間質(zhì)。模型組大鼠心肌細胞形態(tài)異常,細胞邊界模糊,染色不均。心肌纖維排列散亂無序,間質(zhì)出現(xiàn)水腫變性的現(xiàn)象,且存在大量炎性細胞浸潤。TMP低劑量、高劑量組和西藥組大鼠心肌細胞形態(tài)異?，F(xiàn)象得到改善,染色均勻,界限清晰,細胞水腫變性現(xiàn)象減少,心肌纖維排列整齊,結構完整,炎性細胞浸潤現(xiàn)象顯著減少。見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.TMP低劑量組;D.TMP高劑量組;E.西藥組。

3.5 AMPK、Nrf-2和HO-1 mRNA比較

與對照組比較,模型組Nrf-2和HO-1 mRNA表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠Nrf-2和HO-1 mRNA表達水平升高(P<0.05)。與TMP低劑量組比較,TMP高劑量組和西藥組大鼠Nrf-2和HO-1 mRNA表達水平升高(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項數(shù)值與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠AMPK、Nrf-2、HO-1 mRNA水平比較

3.6 AMPK、Nrf-2和HO-1蛋白比較

與對照組比較,模型組p-AMPK、Nrf-2和HO-1蛋白表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3組大鼠3項數(shù)值升高(P<0.05)。與TMP低劑量組比較,TMP高劑量組和西藥組大鼠3項數(shù)值升高(P<0.05)。TMP高劑量組大鼠3項數(shù)值與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5、圖2。

表5 各組大鼠AMPK、Nrf-2、HO-1蛋白水平比較

注:A.對照組;B.模型組;C.TMP低劑量組;D.TMP高劑量組;E.西藥組。

4 討論

TMP是一種提取自川芎的生物堿單體,現(xiàn)代藥理研究表明,TMP具有廣泛的藥理活性,如抗炎、抗氧化、降血脂、改善血流流變學以及抑制血小板聚集等作用[10-12]。高脂飲食聯(lián)合后腔注射垂體后葉素法是近年研究心血管疾病的經(jīng)典誘導物質(zhì),因其操作簡單、病理進程與人類心肌缺血疾病類似,被廣泛應用于心血管疾病研究以及相應藥物開發(fā)[13]。故本研究用高脂飲食聯(lián)合后腔注射垂體后葉素法建立CHD大鼠模型,從分子機制上探討TMP對大鼠心肌損傷的改善作用,探究其可能的作用機制。結果顯示,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、Mb、CK、CK-MB和MDA水平升高,GSH-Px和SOD水平降低,提示模型組大鼠心損嚴重且伴有炎癥和氧化應激反應,在給予TMP和西藥的干預下均表現(xiàn)出TNF-α、IL-1β、IL-6、Mb、CK、CK-MB和MDA水平降低,GSH-Px和SOD升高,炎癥因子水平降低且抗氧化因子水平升高,心肌損傷標記物水平也隨之降低,提示TMP和西藥均在一定程度上緩解心肌損傷;此外,心肌組織HE染色結果也表現(xiàn)出形態(tài)異?，F(xiàn)象得到改善,細胞水腫變性現(xiàn)象減少,炎性細胞浸潤現(xiàn)象顯著減少。

AMPK是一種在真核生物細胞中廣泛表達且高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[14],對炎癥和氧化應激具有重要調(diào)節(jié)作用,可提高AMPK活性[15]、降低ROS水平、增加SOD生成[16],增強機體抗氧化能力[17]。研究表明,AMPK/Nrf 2/HO-1信號通路不僅是機體氧化應激反應的重要調(diào)節(jié)通路之一,還與炎性反應相關[18],激活Nrf 2表達可協(xié)調(diào)炎癥細胞募集,調(diào)控抗炎基因表達[19],在氧化還原反應和抗炎反應之間提供一個接口,發(fā)揮抗氧化損傷和抗炎反應等作用[20]。在本研究中,TMP各劑量組和西藥組AMPK、Nrf-2和HO-1 mRNA和蛋白表達水平較模型組大鼠均顯著升高,結合大鼠血清中炎性因子和抗氧化因子水平變化,TMP可激活AMPK/Nrf 2/HO-1信號通路,對CHD大鼠心肌損傷有積極影響。

綜上所述,TMP能夠調(diào)整血清中炎性因子和抗氧化因子水平,改善大鼠心肌損傷,其可能是通過調(diào)節(jié)AMPK/Nrf 2/HO-1信號通路發(fā)揮抗炎抗氧化作用的,可為臨床治療ALD提供實驗依據(jù)。