劉 蓉,張 偉,陳雪潔,肖朝江,沈 磊,田新雁,姜 北

(1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 大理 671000;2.大理大學(xué) 藥學(xué)院,云南 大理 671000; 3.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671000)

0 引 言

慢性非細(xì)菌性前列腺炎(Chronic Non-bacterial Prostatitis,CNP)是前列腺炎綜合征中最常見的類型,被認(rèn)為是50歲以下男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病中的常見病、多發(fā)病[1],主要表現(xiàn)為下腹部、會(huì)陰部疼痛或盆腔不適,常常伴隨著尿頻、尿急、尿痛、尿路阻塞、性功能障礙、抑郁等癥狀[2-3].目前臨床上供選擇的藥物有非甾體類抗炎藥、α-腎上腺素能受體阻斷劑、抗生素類等;如并發(fā)有焦慮、抑郁等心理問題的CNP患者,可選擇服用抗焦慮或抗抑郁藥物[4-5].由于西藥在前列腺炎的治療上主要以緩解癥狀為目的,缺乏特異性,遠(yuǎn)期療效并不理想,而中藥的多成分多靶點(diǎn)可在前列腺炎的保護(hù)與治療上發(fā)揮著重要作用,因此日益受到重視[6].

分心木(Diaphragma Juglandis Fructus,簡(jiǎn)稱DJF)又名胡桃隔,為胡桃科胡桃屬植物核桃(JuglansregiaL.)果實(shí)內(nèi)的木質(zhì)中隔,是核桃產(chǎn)品加工過程中主要的副產(chǎn)物.云南大理為我國(guó)核桃主要產(chǎn)地,所屬漾濞縣因盛產(chǎn)著名的漾濞泡核桃而被譽(yù)為“中國(guó)核桃之鄉(xiāng)”,每年分心木產(chǎn)量巨大,但開發(fā)應(yīng)用十分有限,已不同程度地制約了核桃產(chǎn)業(yè)與社會(huì)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展.根據(jù)傳統(tǒng)藥用記載,分心木具有固腎澀精的功效,主治遺精、滑精、遺尿、尿血、淋病、帶下等多種泌尿生殖系統(tǒng)疾病[7-8].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,分心木中分離得到的部分化合物表現(xiàn)出顯著的抗炎效果[9-10],且本課題組前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)分心木水提取物具有較好的抗炎活性.基于分心木固腎澀精的傳統(tǒng)藥用記載和現(xiàn)代抗炎作用研究,本課題擬用現(xiàn)代藥理學(xué)方法對(duì)分心木治療CNP大鼠的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究,為進(jìn)一步開發(fā)利用分心木藥材資源創(chuàng)造條件.

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株及動(dòng)物

巨噬細(xì)胞株RAW264.7,武漢普諾賽生命科技有限公司;SD大鼠,SPF級(jí),雄性,體質(zhì)量180～220 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCKY(湘)2019-0004.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合3R原則,且經(jīng)大理大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過.

1.2 樣品及主要試劑

1.3 儀器

Varioskan LUX功能酶標(biāo)儀,美國(guó)賽默飛世爾科技公司;CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,美國(guó)BIO-RAD公司;N60核酸蛋白測(cè)定儀,美國(guó)IMPLEN公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;Tissuelyser-L多樣品組織研磨儀,上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;HC-301R高速冷凍離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;0408-2型臺(tái)式低速離心機(jī),上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司;MCO-18AIC CO2孵育箱,日本三洋電器公司;大鼠獨(dú)立通氣籠,蘇州市蘇杭科技器材有限公司.

2 方法

2.1 分心木供試樣品的制備

取干燥的分心木樣品,粉碎,加入適量蒸餾水(1∶6,w/v),100 ℃ 回流提取3次,趁熱過濾,合并濾液,濃縮凍干,得分心木水提取物(DJF-W).部分分心木水提取物以D101型大孔樹脂柱層析進(jìn)行粗分劃段,依次用0、50%、100%甲醇-水洗脫,每次洗脫至樣品不再增加,分別得D101大孔樹脂水洗脫部位(D101-1)、50%甲醇洗脫部位(D101-2)、100%甲醇洗脫部位(D101-3)樣品.

2.2 分心木總黃酮、總多酚和總多糖的含量測(cè)定

總黃酮和總多糖含量測(cè)定參照中國(guó)藥典2020版中的方法進(jìn)行[11],總黃酮以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,通過亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色進(jìn)行測(cè)定;總多糖以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,通過硫酸-蒽酮法進(jìn)行測(cè)定.總多酚含量測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行[12],以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用福林酚試劑法進(jìn)行測(cè)定.

2.3 LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型的建立

巨噬細(xì)胞RAW264.7混懸于含10%胎牛血清、1%鏈霉素和青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板內(nèi),放入培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 后,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗一遍,加入 100 μL 含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,正常組和模型組加入等體積的正常培養(yǎng)基,每組8個(gè)復(fù)孔.孵育 30 min 后,正常組(非LPS誘導(dǎo)組)加入 100 μL 正常培養(yǎng)基,模型組和實(shí)驗(yàn)組加入 100 μL 含LPS(1 μg/mL)的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育 24 h 后,收集上清液測(cè)定一氧化氮(NO)含量.NO含量測(cè)定參照一氧化氮試劑盒說明書進(jìn)行.

2.4 慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型的建立

參照文獻(xiàn)[13-14]的方法建立CNP大鼠模型.30只雄性SD大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 d,隨機(jī)分組,每組6只.具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量:0.4 mL/100 g),麻醉,備皮,于下腹正中切口,棉簽輕輕挑起膀胱,暴露附于膀胱頸外側(cè)的前列腺,模型組和實(shí)驗(yàn)組于前列腺雙側(cè)腹葉各注入 100 μL 的1%角叉菜膠生理鹽水溶液,假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水.隨后,逐層縫合腹壁肌肉皮膚,消毒,放回鼠籠,自由飲食.術(shù)后第 4 d,假手術(shù)組和模型組灌胃蒸餾水,陽性藥組灌胃前列康混懸液,分心木組灌胃分心木水提物,連續(xù)給藥 10 d.末次給藥后 1 h,稱量體重,麻醉,腹主動(dòng)脈取血,室溫靜置 30 min,3 500 r/min 離心 15 min,取上清液于 -20 ℃ 保存?zhèn)溆?同時(shí)剖取前列腺組織,在生理鹽水中剝離多余的脂肪和組織,吸干水分,稱重后,選取一部分組織做病理切片,另取一部分組織用組織研磨儀制成10%的組織勻漿,10 000 r/min 離心 10 min,取上清液于 -20 ℃ 保存?zhèn)溆?

2.5 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1) 前列腺指數(shù)(PI):PI=前列腺濕重(g)/體重(g)×100%.

2) 前列腺組織病理切片:按照常規(guī)病理切片制作、染色步驟,將一部分前列腺組織在4%多聚甲醛固定液中固定至少 24 h,脫水,石蠟包埋,制片,H&E染色,鏡下觀察其病理組織學(xué)變化.

3) 按照試劑盒說明書步驟,采用Elisa法測(cè)定CNP大鼠血清中PSA、TNF-α、PGE2的含量;采用比色法測(cè)定前列腺組織中MDA的含量.

速生桉樹春、夏、秋三季都可以進(jìn)行種植，但在春季雨后進(jìn)行的種植成活率最高。因此，造林技術(shù)中選擇春季雨后種植應(yīng)更受到重視，在氣溫、土壤、空氣都滿足速生桉樹生長(zhǎng)的最適宜條件下的種植能夠滿足速生桉樹的生長(zhǎng)效益，也能夠提高其經(jīng)濟(jì)效益。

4) RT-PCR法測(cè)定前列腺組織中COX-2和Nrf2的mRNA表達(dá)水平,以GAPDH為內(nèi)控基因,用2-ΔΔCt方法計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)量.引物序列如表1,由生工生物公司合成.

2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用mean±SD表示,SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素方差分析(One-Way ANOVE),比較組間差異,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 結(jié)果與分析

3.1 分心木水提物及各部位樣品總黃酮、總多酚和總多糖的含量測(cè)定

對(duì)分心木水提物及大孔樹脂各洗脫部位中的總黃酮、總多酚和總多糖進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果如表2所示,各部位成分含量差異顯著,其中大孔樹脂50%甲醇洗脫部位總黃酮、總多酚和總多糖含量均為最高,較分心木水提物各成分含量均有顯著的提高.

表2 分心木水提物及各部位幾種類型成分含量

3.2 分心木水提物及各部位對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥反應(yīng)的影響

分心木水提物及各部位對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放的NO含量分析結(jié)果如表3所示,與正常組比較,LPS刺激之后,模型組的NO含量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,分心木水提物及各部位均能不同程度地降低NO的含量,但是僅分心木水提物差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).

表3 分心木水提物及各部位對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO的影響

3.3 分心木水提物對(duì)CNP大鼠PI和PSA的影響

分心木水提物對(duì)CNP大鼠PI和PSA的影響結(jié)果如表4所示.與假手術(shù)組相比,模型組PI(P<0.05)和血清中PSA的水平(P<0.01)均顯著升高.與模型組比較,分心木水提物高、低劑量組均未能顯著降低CNP大鼠的PI水平;但是分心木水提物高劑量組(1 g/kg)能顯著降低CNP大鼠血清中PSA的水平(P<0.01).

表4 分心木水提物對(duì)CNP大鼠PI和PSA的影響

3.4 分心木水提物對(duì)CNP大鼠前列腺組織的病理學(xué)影響

分心木水提物對(duì)大鼠前列腺組織病理學(xué)影響如圖1所示.光學(xué)顯微鏡下觀察,假手術(shù)組大鼠前列腺組織腺泡形狀規(guī)則,呈單層立方或者柱狀排列,基底膜完整,未見明顯水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn).模型組大鼠前列腺組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),前列腺明顯水腫、間質(zhì)疏松,腺泡形狀不規(guī)則,腺體上皮褶皺增加,部分基底膜被破壞.與模型組比較,分心木水提物高(1 g/kg)、低(0.5 g/kg)劑量組,均能不同程度地降低大鼠前列腺組織水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),減輕組織的炎癥反應(yīng),但療效均較前列康組略差.

(a)假手術(shù)組 (b)模型組 (c)前列康組

(d)分心木水提物高劑量組(1 g/kg) (e)分心木水提物低劑量組(0.5 g/kg)圖1 大鼠前列腺組織病理切片(×200,標(biāo)尺:100 μm)Fig.1 Pathological section of rat prostate (×200,ruler:100 μm)

3.5 分心木水提物對(duì)CNP大鼠血清學(xué)指標(biāo)(TNF-α、PGE2)的影響

對(duì)CNP大鼠血清中TNF-α、PGE2的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表5所示.與假手術(shù)組比較,模型組大鼠中TNF-α、PGE2水平均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,前列康組、分心木水提物0.5、1 g/kg 組均能顯著降低CNP大鼠血清中TNF-α、PGE2的水平(P<0.01).

3.6 分心木水提物對(duì)CNP大鼠組織中MDA、Nrf2、COX-2的影響

對(duì)CNP大鼠前列腺組織中MDA的含量以及Nrf2、COX-2的基因表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表6.與假手術(shù)組比較,模型組大鼠前列腺組織中MDA和COX-2的水平均顯著上升(P<0.01),Nrf2的基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,前列康組、分心木水提物 0.5 g/kg 組能顯著降低組織中MDA的含量以及COX-2的基因表達(dá)水平(P<0.01),分心木水提物 1 g/kg 組能一定程度都升高Nrf2基因的表達(dá)水平,盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05).

表5 分心木水提物對(duì)CNP大鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響

(a) Nrf2 mRNA的擴(kuò)增曲線 (b) COX-2 mRNA的擴(kuò)增曲線 (c) GAPDH mRNA的擴(kuò)增曲線

(d) Nrf2熔解曲線 (e) COX-2熔解曲線 (f) GAPDH熔解曲線圖2 CNP大鼠前列腺組織中Nrf2、COX-2和GAPDH mRNA的擴(kuò)增曲線及熔解曲線Fig.2 Amplification curve and melting curve of Nrf2,COX-2 and GAPDH mRNA in prostate tissue of CNP rats

表6 分心木水提物對(duì)CNP大鼠組織中MDA、Nrf2、COX-2的影響其中mRNA n=3)

續(xù)表6

4 討 論

分心木水提物通過D101型大孔樹脂柱層析進(jìn)行粗分劃段后,對(duì)幾類成分進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果顯示,分心木水提物及各部位之間所含的成分類別以及含量存在明顯差異.通過LPS誘導(dǎo)建立巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型,檢測(cè)分心木水提物及各部位的抗炎活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,只有分心木水提物能夠顯著性降低NO的含量,說明水提物抗炎效果優(yōu)于其他三個(gè)洗脫部位.然而,由于50%甲醇部位總黃酮、總多酚和總多糖含量最高,但并未顯示最好的降低NO活性,因此,分心木抗炎活性應(yīng)該還與所含有的其他類型成分有密切關(guān)系,其治療作用應(yīng)是多成分協(xié)同作用的結(jié)果,這些結(jié)果也在一定程度上驗(yàn)證了民間分心木泡水服用的合理性.為此后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),僅選擇分心木水提物作為研究對(duì)象.

本研究以PI和PSA兩個(gè)指標(biāo)的升高作為CNP模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)[13-14].前列腺炎會(huì)引起前列腺的組織水腫,PI升高.PSA是由前列腺腺泡及導(dǎo)管分泌的一種絲氨酸蛋白酶,直接分泌到前列腺導(dǎo)管內(nèi),正常情況下前列腺與周圍有屏障隔離,所以僅有微量的PSA進(jìn)入血液循環(huán),但當(dāng)前列腺出現(xiàn)炎癥或增生等病變時(shí),就會(huì)引起PSA在血液中不同程度的升高,血清PSA水平與炎癥的嚴(yán)重程度、前列腺體積密切相關(guān)[15].根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,分心木水提物能顯著降低CNP大鼠血清中PSA的水平,表明分心木水提物對(duì)CNP大鼠的炎癥有一定的緩解作用.

慢性前列腺炎的發(fā)病機(jī)制主要涉及病原體感染、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞因子與機(jī)體自身免疫等因素[16-17].CNP的發(fā)生發(fā)展涉及到多種炎癥因子,TNF-α是機(jī)體受到損傷時(shí)由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子,可加速多種炎癥因子的聚集和釋放,并且能促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放前列腺素、白三烯等炎癥介質(zhì)加重局部炎癥[18-19].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CNP模型組大鼠血清中TNF-α水平明顯升高,當(dāng)用不同劑量的分心木提取物進(jìn)行治療干預(yù)后,血清中的TNF-α水平降低,表明其具有抑制炎癥因子釋放的作用.

花生四烯酸代謝途徑是重要的炎癥通路,炎癥發(fā)生時(shí),COX-2的表達(dá)升高,導(dǎo)致PGE2的合成增加,引起局部疼痛和血管擴(kuò)張,促進(jìn)炎性反應(yīng)[20-21].同時(shí),PGE2的上升能夠誘導(dǎo)線粒體的損傷,促進(jìn)氧自由基對(duì)上皮細(xì)胞造成損傷[22-23].實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CNP模型組大鼠血清中PGE2水平和組織中COX-2的基因表達(dá)水平明顯升高,當(dāng)用不同劑量的分心木水提物進(jìn)行干預(yù)后,血清中的PGE2含量和組織中COX-2的基因表達(dá)水平降低,說明其抗炎作用可能與COX-2/PGE2通路有關(guān).

氧化應(yīng)激也是CNP發(fā)展的重要機(jī)制,氧化應(yīng)激反應(yīng)是繼發(fā)于炎癥反應(yīng)之后的前列腺組織損傷[24],氧自由基過度產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化,而MDA為膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物[13].Nrf2作為細(xì)胞對(duì)抗內(nèi)外源性物質(zhì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子,能特異性的結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(ARE)序列,調(diào)控ARE依賴的下游基因,Nrf2/ARE作為最重要的抗氧化信號(hào)通路之一參與機(jī)體的自我保護(hù)[25-26].實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CNP模型組大鼠前列腺組織中Nrf2的基因表達(dá)水平明顯降低,MDA的含量明顯升高,當(dāng)給分心木水提物進(jìn)行干預(yù)之后,能增加Nrf2的基因表達(dá)水平,減少前列腺組織中MDA的含量,表明分心木水提物對(duì)CNP的治療作用可能與激活Nrf2介導(dǎo)的ARE通路有關(guān).

5 結(jié) 論

分心木可能以多成分協(xié)同作用的方式、通過抑制炎癥因子的釋放和抗氧化對(duì)CNP大鼠起到治療作用,其機(jī)制應(yīng)該與COX-2/PGE2及Nrf2兩條信號(hào)通路有關(guān).本研究結(jié)果也驗(yàn)證了分心木在民間用于泌尿生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的合理性,為分心木后續(xù)在泌尿生殖系統(tǒng)保健方面的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).