陳 博,汪玲果,藺鵬楨

膠質(zhì)瘤是最常見的人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤之一,約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的65%[1]。近年來(lái),世界范圍內(nèi)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)急劇上升的趨勢(shì)[2]。目前,手術(shù)依舊是最主要的治療方法,其他治療方法有放療、化療和免疫治療[3-4]。但目前即使手術(shù)結(jié)合術(shù)后放療、化療,預(yù)后效果仍較差、復(fù)發(fā)率高[5-6]。因此,需要尋找新的潛在靶點(diǎn)和治療手段來(lái)治療膠質(zhì)瘤。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDKL2)位于染色體4q21,根據(jù)結(jié)構(gòu)域的氨基酸分析,其結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域具有一定的相似性,被歸類于cdc2相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶亞家族的成員[7]。CDKL2被認(rèn)為與大腦的行為和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[8]。研究發(fā)現(xiàn),CDKL2與某些腫瘤疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性,例如前列腺癌、乳腺癌、肝癌以及膠質(zhì)瘤[9-11]。此外,CDKL2表達(dá)降低與膠質(zhì)瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)[12]。通過(guò)DNA甲基化分析結(jié)果表明,膠質(zhì)瘤呈現(xiàn)異常CDKL2甲基化水平[11]。DNA甲基化是表觀遺傳修飾方法之一,可將甲基加在DNA分子中。DNA甲基化可以在不改變DNA序列的情況下改變DNA片段的活性。通常情況下,位于基因起始子位置的DNA甲基化會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄。然而,CDKL2甲基化水平與膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)以及臨床作用的相關(guān)性仍待闡明。因此,本研究通過(guò)檢測(cè)膠質(zhì)瘤和正常組織中CDKL2的甲基化水平,探討臨床膠質(zhì)瘤組織中CDKL2的甲基化水平及其和腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)系,評(píng)估甲基化抑制劑對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用,并探討其潛在的臨床意義。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞A172、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251系購(gòu)自美國(guó)模式菌種庫(kù)(ATCC)。

選取2015年—2018年陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科進(jìn)行膠質(zhì)瘤手術(shù)病人的切除組織,其中瘤組織為癌癥病人的腫瘤組織,癌旁組織為距離腫瘤區(qū)域1～3 cm的組織,正常組織為距離腫瘤區(qū)域>5 cm的區(qū)域,所有病人均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

QIAamp DNA FFPE組織試劑盒購(gòu)自Qiagen公司(美國(guó)),甲基化敏感性限制酶Hin6I購(gòu)自Fermentas公司(美國(guó)),SYBR Green qPCR master mix購(gòu)自Bio-rad公司(美國(guó)),PrimeScriptTMRT試劑盒購(gòu)自Takara公司(中國(guó)),蛋白酶抑制劑cocktail購(gòu)自Roche Applied Science公司(美國(guó)),二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自CWBIO公司(中國(guó)),CDKL2抗體和β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司(美國(guó)),蛋白免疫印跡法(Western Blot)化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自PierceBioscience公司(美國(guó))。

1.2 DNA提取 嚴(yán)格按照說(shuō)明書使用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒提取組織樣本中的DNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶K消化和苯酚/氯仿提取從冷凍組織中分離DNA。DNA濃度通過(guò)NanoDrop-2000c進(jìn)行測(cè)量。所有DNA樣品于-20 ℃保存使用。

1.3 甲基化分析 采用改良后的甲基化敏感性限制酶方法消化DNA。首先,使用40 U甲基化敏感性限制酶(MSRE)Hin6I在50 L反應(yīng)體積中消化500 ng DNA 72 h,反應(yīng)溫度為37 ℃。未消化的對(duì)照組樣品以相同的方式處理,加入不含DNase的水代替酶。為了確保酶可以被完全消化,同時(shí)消化未甲基化的對(duì)照和甲基化的樣品。孵育完成后,在65 ℃將酶失活20 min。失活后,在Bio-Rad CFX96TM實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行定量PCR。每個(gè)反應(yīng)體系體積為20 μL,其中包括SYBR Green qPCR master mix、0.5 μmol/L正向引物和反向引物和模板。通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性。在每次PCR中均使用未甲基化的對(duì)照,甲基化的對(duì)照和空白對(duì)照。使用公式100%×2△Cq(undigested-digested)計(jì)算特定基因的甲基化水平。未甲基化對(duì)照組的甲基化水平必須接近零,而甲基化組對(duì)照必須接近1,以確保100%的消化效率。CDKL2-MSRE正向引物為GCTCGGCCAATCAGAAGAAG,反向引物為CCACCTCCCAGCTCGTAA。

1.4 基因表達(dá)分析 使用PrimeScriptTMRT試劑盒,對(duì)mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用Bio-Rad CFX96TM進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)系統(tǒng)來(lái)測(cè)量CDKL2的表達(dá)水平。CDKL2的相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)內(nèi)參基因(ACTB)進(jìn)行分析,并使用相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法(2-△Cq)進(jìn)行計(jì)算。CDKL2-qPCR正向引物為GATTTGCTGAGAGGTTTT,反向引物為CTATTTTGTTGTGGCTTG;ACTB-qPCR正向引物為CAGAGCCTCGCCTTTGCC,反向引物為CATGCCGGAGCCGTTGTC。

1.5 蛋白提取及表達(dá)分析 將細(xì)胞在裂解液中裂解,裂解液含137 mmol/L的NaCl、2 mmol/L的乙二胺四乙酸、1%Triton X,10%甘油、1 mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)以及蛋白酶抑制劑混合物。使用BCA試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量,然后通十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白裂解物,并使用恒定電流將蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。使用Tris緩沖鹽水(TBS)、5%脫脂牛奶和0.1%的Tween-20進(jìn)行封閉。封閉1 h后將膜和CDKL2抗體4 ℃孵育過(guò)夜,β-actin抗體作為對(duì)照。使用TBS清洗PVDF膜后,于室溫下孵育二抗1 h。使用化學(xué)發(fā)光液將印記可視化后于暗室曝光。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)DNA甲基化抑制劑處理(實(shí)驗(yàn)組)和磷酸緩沖鹽溶液(PBS)處理(對(duì)照組)的U87細(xì)胞系以每孔200個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中。2周后,將細(xì)胞用75%乙醇固定30 min。然后用0.5%結(jié)晶紫溶液將菌落染色并計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.7 免疫組化 將腫瘤組織固定在福爾馬林中,包埋于石蠟中并切成4 μm厚切片。將切片脫蠟后,用3%雙氧水處理10 min,并且與CDKL2抗體(1∶100稀釋度)在4 ℃下孵育1 h,然后再與過(guò)氧化物酶孵育1 h。用TBS沖洗后,將切片與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)孵育5 min。在水中洗滌后使用蘇木精復(fù)染。

1.8 體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn) 選取4周大的雄性Balb/c裸鼠10只,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組5只。裸鼠購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(陜)2020-002。將4×106的未經(jīng)DNA甲基化抑制劑處理或經(jīng)甲基化抑制劑處理的U251細(xì)胞系注射至裸鼠皮下,從接種后的第7天開始,每隔7 d測(cè)量1次腫瘤體積。腫瘤體積的計(jì)算公式為:V=L×W2/2,其中V代表體積(mm3),L代表最大直徑(mm),W代表最小直徑(mm)。在第22天處死小鼠,并測(cè)量腫瘤重量。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤中CDKL2的甲基化水平 采用MSRE-qPCR分別檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(A172、U87和U251)和正常腦膠質(zhì)細(xì)胞中的CDKL2甲基化水平,結(jié)果表明,相較于正常腦膠質(zhì)細(xì)胞[甲基化水平為(1.20±0.08)%],CDKL2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中甲基化水平為(76.0±3.3)%,在U87中甲基化水平為(85.0±3.9)%,在U251中甲基化水平為(83.0±3.7)%,均呈現(xiàn)高甲基化水平。為了進(jìn)一步驗(yàn)證膠質(zhì)瘤中CDKL2的甲基化水平,本研究檢測(cè)了178個(gè)膠質(zhì)瘤組織樣本,169個(gè)癌旁正常組織樣本和30個(gè)正常腦組織樣本中的CDKL2甲基化水平,結(jié)果顯示,相較于癌旁正常組織和正常腦組織,膠質(zhì)瘤組織中CDKL2甲基化水平明顯升高(P<0.000 1),詳見圖1。為了探究CDKL2甲基化水平的臨床診斷價(jià)值,本研究使用受試者工作特征曲線(ROC)分析評(píng)估了CDKL2作為膠質(zhì)瘤潛在的生物標(biāo)志物的水平。如圖2、圖3所示,CDKL2甲基化可區(qū)分膠質(zhì)瘤和癌旁正常組織,且可以區(qū)分癌旁正常組織和正常腦組織,ROC曲線下面積(AUC)值分別為0.854(P<0.001)和0.797(P<0.001)。CDKL2甲基化水平在區(qū)分膠質(zhì)瘤與癌旁正常組織的敏感度為0.721,特異度為0.782。

圖1 MSRE-qPCR檢測(cè)

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁正常組織中CDKL2甲基化水平ROC圖

圖3 癌旁正常組織和正常腦組織中CDKL2甲基化水平ROC圖

2.2 CDKL2的高甲基化水平和表達(dá)水平之間的關(guān)系 本研究分別檢測(cè)了30個(gè)膠質(zhì)瘤組織樣本和30個(gè)正常組織樣本中CDKL2的表達(dá)水平。如圖4所示,相較于正常組織,CDKL2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平較低(P<0.000 1)。結(jié)合圖2、圖3的甲基化水平結(jié)果,本研究對(duì)于膠質(zhì)瘤樣本中CDKL2的甲基化水平和mRNA水平進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,CDKL2的甲基化水平和mRNA水平呈負(fù)相關(guān)(見圖5)。采用Western Blot法進(jìn)一步驗(yàn)證CDKL2在正常組織中和膠質(zhì)瘤組織中的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤相較正常組織,CDKL2蛋白表達(dá)水平較低(見圖6)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明,膠質(zhì)瘤中CDKL2的表達(dá)水平較低(見圖7)。

圖4 qPCR檢測(cè)CDKL2在膠質(zhì)瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平

圖5 CDKL2的甲基化水平和表達(dá)水平之間的關(guān)系

圖6 Western Blot法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織和正常組織中CDKL2蛋白表達(dá)水平條帶圖

圖7 免疫組化分析正常組織和膠質(zhì)瘤組織中CDKL2的表達(dá)水平

2.3 CDKL2甲基化與臨床病理特征之間的相關(guān)性 入選膠質(zhì)瘤病人的臨床資料見表1。進(jìn)一步分析表明,病理分級(jí)與CDKL2甲基化相關(guān),膠質(zhì)瘤Ⅳ級(jí)病人的腫瘤中CDKL2甲基化水平更高(P<0.01,見圖8A)。在不同生存期病人的腫瘤中CDKL2甲基化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖8B)。低表達(dá)CDKL2的腫瘤組織中CDKL2甲基化水平更高(P<0.05,見圖8C、圖8D)。

表1 膠質(zhì)瘤病人的臨床資料(n=137)

圖8 CDKL2甲基化、膠質(zhì)瘤病人臨床病理特征、mRNA和蛋白表達(dá)水平的關(guān)系(A為不同分期腫瘤中CDKL12甲基化水平;B為不同生存年限病人腫瘤中CDKL12甲基化水平;C為不同CDKL12 mRNA表達(dá)水平腫瘤中甲基化水平;D為不同CDKL12蛋白表達(dá)水平腫瘤中甲基化水平)

2.4 CDKL2甲基化水平調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng) 為了研究CDKL2甲基化水平如何調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),本研究使用了DNA甲基化抑制劑5-aza-2′-deoxycytidine對(duì)CDKL2甲基化進(jìn)行抑制。qPCR結(jié)果表明,相較于對(duì)照組(甲基化水平為81%),DNA甲基化抑制劑可以較好地抑制CDKL2的甲基化(39.20±3.62)%,并且DNA甲基化抑制劑可以提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CDKL2的mRNA水平[甲基化組mRNA表達(dá)水平是對(duì)照組的(1.52±1.62)倍]和蛋白表達(dá)水平(見圖9)。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相較于對(duì)照組,抑制劑組抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力(見圖10)。

圖9 qPCR檢測(cè)對(duì)照組和抑制劑組U87細(xì)胞CDKL2蛋白表達(dá)條帶圖

圖10 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組和抑制劑組U87細(xì)胞生長(zhǎng)能力

2.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CDKL2甲基化和膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的關(guān)系 為了進(jìn)一步驗(yàn)證CDKL2高甲基化可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),本研究將U87細(xì)胞接種在裸鼠皮下,建立移植瘤模型,抑制劑組注射5-aza-2′-deoxycytidine,對(duì)照組注射PBS(見圖11)。腫瘤體積的變化顯示,相較于對(duì)照組,抑制劑組的小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度相對(duì)緩慢(見圖12)。3周后處死小鼠,將小鼠腫瘤組織取出并測(cè)量體積,結(jié)果表明,相較于對(duì)照組,抑制劑組腫瘤體積更小(P<0.01),見圖13。MSRE-qPCR檢測(cè)對(duì)照組和抑制劑組小鼠膠質(zhì)瘤中CDKL2的甲基化水平,結(jié)果表明,相較于對(duì)照組甲基化水平的(61.80±2.37)%,抑制劑組小鼠的膠質(zhì)瘤中CDKL2的甲基化水平降低為(37.80±1.35)%。免疫組化染色結(jié)果表明,抑制劑組膠質(zhì)瘤組織中CDKL2的表達(dá)水平低于對(duì)照組(見圖14)。提示抑制CDKL2的甲基化可抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。

圖11 對(duì)照組和抑制劑組的體內(nèi)移植瘤模型

圖12 3周后對(duì)照組和抑制劑組的腫瘤大小

與抑制劑組比較,＊ P<0.05;# P<0.01。圖13 對(duì)照組和抑制劑組在接種腫瘤細(xì)胞1周后、2周后、3周后的移植瘤體積

圖14 免疫組化染色檢測(cè)對(duì)照組和抑制劑組小鼠膠質(zhì)瘤組織CDKL2表達(dá)水平

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一,其特征是發(fā)病率高和存活率低[13]。近年來(lái),腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率逐年升高,并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[2]。因此,研究影響膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的潛在分子機(jī)制,尋找新的生物標(biāo)志物十分關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明,膠質(zhì)瘤中CDKL2呈高甲基化狀態(tài),抑制CDKL2甲基化可明顯抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。

DNA甲基化是重要的表觀修飾之一,DNA甲基化狀態(tài)的異?？赡軙?huì)抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄,并且通常與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展存在一定關(guān)聯(lián)[14]。有研究報(bào)道,CDKL2的異常DNA甲基化狀態(tài)可能與膠質(zhì)瘤呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。但是,由于樣本量有限,該研究沒(méi)有對(duì)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行深入的研究以及尋找臨床數(shù)據(jù)和CDKL2甲基化的關(guān)聯(lián)[11]。本研究對(duì)不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和大量膠質(zhì)瘤樣本組織的CDKL2甲基化水平進(jìn)行研究,結(jié)果表明,膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織中的CDKL2的甲基化水平高于正常細(xì)胞及組織,mRNA和蛋白表達(dá)水平低于正常細(xì)胞及組織。因此,CDKL2基因特異性的高甲基化可能通過(guò)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中發(fā)揮一定的作用。DNA甲基化在癌變過(guò)程中易于檢測(cè),因此可以作為重要的潛在生物標(biāo)志物之一[15-17]。已經(jīng)有多項(xiàng)研究結(jié)果表明,DNA甲基化可以作為腫瘤診斷生物標(biāo)志物[18-19]。本研究結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤中CDKL2的甲基化水平高,ROC分析表明CDKL2的甲基化水平作為生物標(biāo)志物具有較高的特異度和敏感度。此外,5-aza-2′-deoxycytidine作為一種DNA甲基化抑制劑,被廣泛應(yīng)用于癌癥的治療中[20-21]。本研究結(jié)果表明,5-aza-2′-deoxycytidine可以有效抑制CDKL2的甲基化水平從而解除CDKL2高甲基化的轉(zhuǎn)錄沉默,使CDKL2表達(dá)水平增高,在體外和體內(nèi)水平抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述,膠質(zhì)瘤中CDKL2呈高甲基化、低表達(dá)狀態(tài),使用甲基化抑制劑可以抑制CDKL2甲基化從而抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng),不僅為臨床中腦膠質(zhì)瘤的診斷提供了一種檢測(cè)標(biāo)志物,還可能為腦膠質(zhì)瘤的治療提供一些思路。