宋 軍 苑慶欣 楊書博 周志新 孫東波

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北寒區(qū)牛病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省牛病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 大慶 163319)

胞內(nèi)寄生菌可通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、逃逸宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)等機(jī)制,在宿主細(xì)胞內(nèi)創(chuàng)造適合其生存的生態(tài)位,從而可在宿主細(xì)胞內(nèi)長時(shí)間生存。對人類以及動(dòng)物的健康有著巨大威脅的單核細(xì)胞增生李斯特菌、布氏桿菌、金黃色葡萄球菌等均為胞內(nèi)寄生菌[1]。目前臨床治療胞內(nèi)寄生菌引起的感染性疾病,面臨很多困難亟待解決。臨床批準(zhǔn)使用的抗生素,大部分不能穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜,從而無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)治療胞內(nèi)寄生菌。少數(shù)能夠穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的抗生素,無法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)停留、積累發(fā)揮抗菌作用。當(dāng)抗生素治療難以達(dá)到有效殺滅胞內(nèi)寄生菌時(shí),還會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)寄生菌產(chǎn)生耐藥,甚至引發(fā)慢性持續(xù)性感染或感染反復(fù)發(fā)作[2],對人類健康造成嚴(yán)重威脅。

噬菌體是一類能夠感染和裂解特定宿主細(xì)菌的病毒。在100多年的應(yīng)用過程中,噬菌體在國內(nèi)外均已被證明能夠用于各種細(xì)菌性感染疾病的治療,特別是對耐藥細(xì)菌同樣具有良好的治療效果[3]。通常認(rèn)為噬菌體無法穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜,很難進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮胞內(nèi)抗菌作用,但現(xiàn)在國外越來越多的研究證明,噬菌體可以直接與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相互作用[4],進(jìn)入細(xì)胞,發(fā)揮胞內(nèi)殺菌作用。因此,噬菌體有潛力應(yīng)用于治療胞內(nèi)寄生菌引起的細(xì)菌性疾病。

近年來,噬菌體治療胞內(nèi)寄生菌感染的相關(guān)研究表明,游離噬菌體對胞內(nèi)寄生菌的抗菌效果仍受到諸多限制。而載體介導(dǎo)噬菌體入胞可提高噬菌體入胞效率,防止噬菌體被宿主免疫系統(tǒng)清除,并保護(hù)噬菌體免受細(xì)胞內(nèi)環(huán)境影響。綜合以上分析可以看出,國外針對噬菌體抗胞內(nèi)寄生菌及載體介導(dǎo)噬菌體入胞的研究已非常豐富,而國內(nèi)噬菌體療法起步相對較晚,且胞內(nèi)寄生菌感染的臨床病例較少,導(dǎo)致噬菌體抗胞內(nèi)寄生菌的研究較之國外相對滯后。

因此,本研究將近年來國外關(guān)于載體介導(dǎo)噬菌體入胞及抗胞內(nèi)寄生菌研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié),詳細(xì)闡述不同介導(dǎo)噬菌體入胞的載體特性、入胞機(jī)制,以及如何提高入胞效率等方面的最新進(jìn)展,以期為國內(nèi)噬菌體抗胞內(nèi)寄生菌的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供依據(jù),并為更有效地利用載體投遞系統(tǒng)高效投遞噬菌體解決細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染的實(shí)際問題提供參考與理論支撐。

1 胞內(nèi)寄生菌

胞內(nèi)寄生菌可分兼性胞內(nèi)寄生菌和專性胞內(nèi)寄生菌。前者可以在宿主細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外生長繁殖,后者僅能在宿主細(xì)胞內(nèi)生長繁殖[1]。胞內(nèi)寄生菌可采用多種途徑通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜,從而寄生于吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)或非吞噬細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞/上皮細(xì)胞)內(nèi),使其成為自己的宿主細(xì)胞[5]。例如分枝桿菌等可利用巨噬細(xì)胞的天然吞噬能力,通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用入侵并駐留在巨噬細(xì)胞內(nèi)[6]。沙眼衣原體、金黃色葡萄球菌和志賀菌等通過特殊機(jī)制來誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排,從而使非吞噬細(xì)胞出現(xiàn)吞噬活性[7-9]。某些胞內(nèi)寄生菌如沙門菌,同時(shí)具有感染吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的能力[10]。胞內(nèi)寄生菌進(jìn)入非吞噬性細(xì)胞主要有2種機(jī)制：拉鏈模式和觸發(fā)模式。前者是細(xì)菌蛋白與宿主細(xì)胞黏附受體呈連續(xù)拉鏈狀結(jié)合,從而逐漸被宿主細(xì)胞吞噬,例如李斯特菌和耶爾森菌等[11-12],而后者則依賴于Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)和細(xì)菌效應(yīng)蛋白的分泌,例如沙門菌和志賀菌等[10,13]。這2種機(jī)制對胞內(nèi)寄生菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞都至關(guān)重要。

細(xì)菌被宿主細(xì)胞內(nèi)化后,定居在被稱為吞噬體或內(nèi)體的特殊內(nèi)隔室中。在吞噬細(xì)胞中,吞噬體與溶酶體融合時(shí),過低的pH和降解酶會(huì)破壞病原體[14]。然而,大多數(shù)胞內(nèi)寄生菌已經(jīng)進(jìn)化出阻止吞噬體與溶酶體融合或改變?nèi)苊阁w殺滅細(xì)菌環(huán)境的能力。一些胞內(nèi)寄生菌甚至能夠逃離吞噬溶酶體,在細(xì)胞質(zhì)中存活[15]。例如,結(jié)核分枝桿菌能夠阻止吞噬體與溶酶體融合[16],并能在細(xì)胞質(zhì)和溶酶體中存活[17],從而為其在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活創(chuàng)造一個(gè)合適的生態(tài)位;金黃色葡萄球菌則是能夠在pH較低的環(huán)境中生存,以至于其可在吞噬體與溶酶體融合后的環(huán)境中繼續(xù)生長繁殖[18]。胞內(nèi)寄生菌在細(xì)胞內(nèi)生長繁殖的機(jī)制不同,給當(dāng)前胞內(nèi)寄生菌感染的治療帶來很多困難與挑戰(zhàn)。另外臨床批準(zhǔn)使用的抗生素,大多無法穿過哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜,或細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度難以達(dá)到殺死細(xì)菌的濃度,導(dǎo)致治療胞內(nèi)寄生菌感染有效藥物的選擇十分有限,加之細(xì)菌耐藥性的不斷增強(qiáng),傳統(tǒng)的抗菌藥物很難對胞內(nèi)寄生菌產(chǎn)生作用。因此,尋找治療胞內(nèi)寄生菌引起感染的新藥物迫在眉睫。

2 游離噬菌體治療胞內(nèi)寄生菌

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌等微生物的病毒總稱。它們是地球上最富多樣性的生命體,廣泛存在于自然界中的水、土壤、空氣等環(huán)境中。地球生物圈中的噬菌體數(shù)量可達(dá)1031～1032個(gè)[19]。可以說,只要有細(xì)菌存在的地方,就一定會(huì)有噬菌體的存在。噬菌體對于維持地球生物圈中的微生物菌群及其生態(tài)系統(tǒng)的平衡有著重要的作用[20]。

噬菌體抗菌的天然特性,使其在對抗多重耐藥細(xì)菌感染方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。但由于細(xì)胞膜可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)菌不受胞外大部分效應(yīng)分子的影響,而噬菌體分子量較高(>10 Mu)[14],無法被動(dòng)擴(kuò)散到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),因此傳統(tǒng)研究認(rèn)為噬菌體無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,進(jìn)而發(fā)揮胞內(nèi)抗菌作用。

近年來有研究證明,噬菌體可以通過多種機(jī)制與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相互作用,從而被細(xì)胞內(nèi)化[21]。Nguyen等[22]在多種細(xì)胞中證明,T4噬菌體可從頂端膜快速轉(zhuǎn)運(yùn)至基底外側(cè)膜,如MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞)、腸T84細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞、A549細(xì)胞(肺上皮細(xì)胞)、Huh7細(xì)胞(肝細(xì)胞上皮細(xì)胞樣細(xì)胞)和hBMec細(xì)胞(腦內(nèi)皮細(xì)胞)。上述研究表明,使用噬菌體殺滅胞內(nèi)寄生菌具有可行性。與抗生素療法相比,噬菌體治療具有更多優(yōu)勢。首先,噬菌體具有高度特異性,治療細(xì)菌感染時(shí),不會(huì)對宿主體內(nèi)的正常微生物菌群造成損傷[23];其次,噬菌體會(huì)在感染部位特異性繁殖,具有持續(xù)殺菌的作用;噬菌體在失去宿主細(xì)菌之后,無法繼續(xù)復(fù)制,不會(huì)出現(xiàn)蓄積中毒的情況;目前的研究中尚未發(fā)現(xiàn)噬菌體對哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在致突變能力以及遺傳毒性等。

雖然噬菌體治療細(xì)菌性疾病有很多優(yōu)點(diǎn),許多研究試圖將游離噬菌體應(yīng)用于胞內(nèi)寄生菌的治療,但還有很多困難亟待解決。例如Guang-Han等[24]應(yīng)用噬菌體在體內(nèi)和體外治療類鼻疽伯克霍爾德菌感染中發(fā)現(xiàn)。在類鼻疽伯克霍爾德菌感染A549細(xì)胞系(肺上皮細(xì)胞)前加入噬菌體C34,類鼻疽伯克霍爾德菌感染的肺上皮細(xì)胞在體外的存活率增加了2倍。在類鼻疽伯克霍爾德菌感染肺上皮細(xì)胞后加入C34噬菌體時(shí),抗菌效果不明顯。并且小鼠在經(jīng)鼻感染類鼻疽伯克霍爾德菌2 h后,未經(jīng)治療的小鼠存活率為0,而治療后小鼠存活率提升至33%。突出了噬菌體的預(yù)防和治療潛力。上述研究表明,游離噬菌體可直接被細(xì)胞內(nèi)化,并靶向胞內(nèi)寄生菌,但卻無法證明胞內(nèi)寄生菌的數(shù)量會(huì)在治療后減少。目前限制游離噬菌體清除胞內(nèi)寄生菌的主要原因是入胞效率較低,并且無法在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中長期保持活性[25]。為使噬菌體能夠有效對抗胞內(nèi)寄生菌,需要載體投遞噬菌體來提高噬菌體的入胞效率,使其精準(zhǔn)到達(dá)細(xì)菌所在的細(xì)胞內(nèi)部位,并保持活性。

3 載體介導(dǎo)的噬菌體遞送

前期關(guān)于游離噬菌體清除胞內(nèi)寄生菌的研究并未取得理想結(jié)果,噬菌體療法曾被認(rèn)為不適合靶向治療胞內(nèi)寄生菌。為提高噬菌體的入胞效率、更加精準(zhǔn)的靶向胞內(nèi)寄生菌,研究者們采用不同載體包封噬菌體遞送入細(xì)胞內(nèi)的方式,提高噬菌體抗胞內(nèi)寄生菌感染的治療效果(圖1)。

圖1 用于介導(dǎo)噬菌體入胞的載體Fig.1 Carriers for mediating phage entry into the cell

3.1 非致病性細(xì)菌作為載體

上世紀(jì)60年代,有人提出噬菌體可以借助一種被稱為“特洛伊木馬”的方法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,從而清除胞內(nèi)寄生菌[26]。即在被噬菌體感染的胞內(nèi)寄生菌發(fā)生裂解前,附著在細(xì)菌表面或在細(xì)菌內(nèi)繁殖的噬菌體一同被哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化,從而使噬菌體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

基于該假設(shè),Broxmeyer等[27]提出使用非致病性且生長繁殖相對較快的恥垢分枝桿菌作為 TM4 噬菌體載體,靶向治療細(xì)胞內(nèi)鳥分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌。研究表明,TM4噬菌體瞬時(shí)感染的恥垢分枝桿菌能以時(shí)間和劑量依賴方式有效清除RAW 264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)鳥分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌。其后續(xù)研究表明,使用TM4噬菌體瞬時(shí)感染的恥垢分枝桿菌治療的小鼠與單獨(dú)使用游離噬菌體治療相比,小鼠脾臟中的鳥分枝桿菌數(shù)量顯著減少[28]。

上述研究表明,恥垢分枝桿菌有潛力作為載體介導(dǎo)噬菌體入胞,從而清除胞內(nèi)寄生菌,但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌在特殊情況下可引起軟組織感染[29],因此恥垢分枝桿菌等非致病性細(xì)菌可能存在的致病性會(huì)在臨床應(yīng)用中造成安全隱患,致使目前非致病性細(xì)菌作為載體僅停留在動(dòng)物試驗(yàn)階段。

3.2 無機(jī)納米微粒作為載體

不同種類的無機(jī)納米微?？蓡为?dú)應(yīng)用或與抗生素混合應(yīng)用治療細(xì)菌感染[30]。無機(jī)納米微粒可同時(shí)以氧化應(yīng)激誘導(dǎo)、釋放金屬離子以及非氧化機(jī)制等多種方式作用于病原體,因此病原體很難對無機(jī)納米微粒產(chǎn)生耐藥性[31]。并且無機(jī)納米微?？膳c特定組織靶向因子結(jié)合,使無機(jī)納米微粒表面功能化,從而使藥物與其結(jié)合后能夠靶向胞內(nèi)寄生菌[32]。近年來,基于上述無機(jī)納米微粒的特性,許多研究將噬菌體與各種無機(jī)納米微粒結(jié)合,從而提高噬菌體抗菌效率,并將噬菌體應(yīng)用范圍擴(kuò)展至抗胞內(nèi)寄生菌[33-37]。

噬菌體可通過其衣殼上的酰胺鍵來修飾磁性氧化鐵納米微粒(MNPs),被噬菌體修飾后的MNPs能利用噬菌體特異性,快速、靈敏地從環(huán)境或生物樣品中檢測和分離細(xì)菌。不僅如此,Li等[33]研究表明MNPs與噬菌體結(jié)合后還具有清除細(xì)菌生物被膜的能力。帶有氨基的MNPs比帶有羧基的MNPs更易與噬菌體結(jié)合,并且較小的MNPs更易與噬菌體結(jié)合,且結(jié)合后去除生物被膜效率更高[34]。不過目前并沒有研究證明,MNPs與噬菌體結(jié)合后可被哺乳細(xì)胞內(nèi)化,從而清除胞內(nèi)寄生菌。

銀納米微粒(AgNPs)現(xiàn)已成為治療一系列多重耐藥細(xì)菌的新選擇。AgNPs可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中釋放,從而清除胞內(nèi)寄生菌[35]。并且有研究證明,M13噬菌體能夠通過基于靜電相互作用的自組裝方法附著在AgNPs上[36],并且M13噬菌體與AgNPs復(fù)合物能夠以劑量依賴的方式有效地殺滅革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和枯草桿菌)和革蘭陰性菌(銅綠假單胞菌和大腸桿菌)。噬菌體與AgNPs偶聯(lián)后可能會(huì)促進(jìn)噬菌體被細(xì)胞內(nèi)化,并協(xié)同清除胞內(nèi)寄生菌。

Fulgione等[37]將納米級(jí)仿生羥基磷灰石(HA)晶體作為噬菌體載體用于清除哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的沙門菌。在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(HepG2)中測定噬菌體SR φ1與HA復(fù)合物清除胞內(nèi)寄生菌效率,并與單獨(dú)使用噬菌體SR φ1或HA形成相互對照。結(jié)果顯示,經(jīng)噬菌體SR φ1與HA復(fù)合物處理24 h后,其能夠成功內(nèi)化到HepG2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),但HepG2細(xì)胞無法單獨(dú)內(nèi)化噬菌體SR φ1。并且經(jīng)噬菌體SR φ1與HA復(fù)合物處理后,感染沙門氏菌的雞肉樣品細(xì)菌載量減少3 log CFU/g。研究結(jié)果表明,使用噬菌體SR φ1與HA復(fù)合物的治療效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用SR φ1噬菌體或HA,并且噬菌體與HA復(fù)合物在低pH條件下,仍可穩(wěn)定儲(chǔ)存。

綜上所述,AgNPs、納米級(jí)HA晶體等無機(jī)納米微粒有潛力作為載體介導(dǎo)噬菌體入胞,清除胞內(nèi)寄生菌,但無機(jī)納米微粒的應(yīng)用目前還存在著諸多限制。例如金屬納米微粒應(yīng)用前,需對其與噬菌體的復(fù)合物進(jìn)行毒性評(píng)估,來解決應(yīng)用其治療胞內(nèi)寄生菌的相關(guān)安全問題。不僅如此,目前大多無機(jī)納米微粒與噬菌體結(jié)合后難以保證噬菌體長期儲(chǔ)存的穩(wěn)定性,并且無機(jī)納米微粒入胞機(jī)制研究尚不明確,入胞效率亟需提高。

3.3 脂質(zhì)體作為載體

脂質(zhì)體一般是由磷脂和膽固醇構(gòu)成的雙分子層閉合囊泡,其具有良好的生物相容性,能夠封裝各種類型的藥物,并保護(hù)其封裝的藥物不被降解或清除,這使得脂質(zhì)體成為研究最多,且最成熟的傳遞藥物的納米載體[38]。1995年,負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素的聚乙二醇化脂質(zhì)體(Doxil)經(jīng)FDA批準(zhǔn),成為第一個(gè)上市的納米藥物。Doxil可以延長阿霉素在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,明顯降低阿霉素對心臟的毒性,提高患者的生存率[39]。此后,FDA批準(zhǔn)了多個(gè)脂質(zhì)體藥物的臨床研究。我國也批準(zhǔn)了多種脂質(zhì)體藥物制劑的生產(chǎn),比如注射用紫杉醇脂質(zhì)體、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體、注射用兩性霉素B脂質(zhì)體等[40]。并且已有研究表明,阿米卡星脂質(zhì)體吸入懸浮液可用于治療非結(jié)核分枝桿菌引起的肺部感染。脂質(zhì)體作為載體介導(dǎo)噬菌體入胞時(shí),可通過膜融合將噬菌體投遞入胞,從而提高噬菌體的入胞效率和殺菌效率[41]。目前關(guān)于脂質(zhì)體作為噬菌體載體的研究主要集中在使噬菌體獲得更好的入胞效率[42-45],防止噬菌體被宿主免疫系統(tǒng)清除以及使噬菌體免受較低pH影響[43,46-47],提高噬菌體的殺菌效率[48-50]等方面。

Colom等[42]使用陽離子脂質(zhì)體包封噬菌體雞尾酒(UAB_Phi20、UAB_Phi78和UAB_Phi87),通過口服的方式治療肉雞腸道沙門菌感染。研究結(jié)果表明,與游離噬菌體相比,封裝于陽離子脂質(zhì)體內(nèi)的噬菌體在酸性環(huán)境中降解速率明顯降低,并且在腸道存留時(shí)間更長。該研究中,脂質(zhì)體包封噬菌體和游離噬菌體對沙門菌定植的預(yù)防作用幾乎一致,但使用游離噬菌體治療后,沙門菌感染幾乎都會(huì)在72 h內(nèi)復(fù)發(fā),而使用脂質(zhì)體包封噬菌體治療后,其保護(hù)作用可持續(xù)7 d以上。Otero等[43]發(fā)現(xiàn),口服脂質(zhì)體包封的噬菌體有向機(jī)體不同器官擴(kuò)散的能力。并且在后續(xù)構(gòu)建的Caco-2細(xì)胞、HT29腸細(xì)胞與Raji-B淋巴細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型中,脂質(zhì)體以聚集體形式粘附在細(xì)胞表面,嵌入細(xì)胞膜,甚至內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)[42]。

Nieth等[48]使用共聚焦熒光顯微鏡計(jì)數(shù)THP-1巨噬細(xì)胞攝取的游離大腸桿菌λeyfp噬菌體與脂質(zhì)體包封的大腸桿菌λeyfp噬菌體數(shù)量。每個(gè)THP-1細(xì)胞中脂質(zhì)體包封的噬菌體數(shù)量顯著高于游離噬菌體。Lapenkova等[49]也發(fā)現(xiàn)RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)化脂質(zhì)體包封的D29噬菌體速率比游離噬菌體提高了6～8倍,同時(shí)脂質(zhì)體包封的D29噬菌體對人外周血單個(gè)核細(xì)胞形成的結(jié)核性肉芽腫模型抗菌效果更強(qiáng)。Singla等[46]證明脂質(zhì)體噬菌體有進(jìn)入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的能力,并且對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)肺炎克雷伯菌的殺菌效率為94.6%。此外,游離噬菌體會(huì)在與中和抗體接觸后3 h內(nèi)被中和,而使用脂質(zhì)體包封噬菌體可以有效保護(hù)噬菌體免受中和抗體影響。Singla等[50]的后續(xù)研究證明,脂質(zhì)體包封的噬菌體在腹腔內(nèi)注射后的生物分布和生物滯留與游離噬菌體相比顯著提高。因此,脂質(zhì)體包封的噬菌體具有更高的生物利用度,并且在腹腔滯留時(shí)間更長,這使得應(yīng)用脂質(zhì)體包封的噬菌體預(yù)防和治療肺炎克雷伯菌引起的呼吸道感染可能會(huì)更具優(yōu)勢[47]。Chhibber等[51]的研究同樣證明局部應(yīng)用脂質(zhì)體包封的葡萄球菌噬菌體(MR-5和MR-10)可治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的皮膚和軟組織感染。上述研究證明,脂質(zhì)體包封的噬菌體與游離噬菌體相比,在感染部位的滯留時(shí)間更長,具有更高的生物利用度,殺滅細(xì)菌的速度更快,具有更好的治療效果。

雖然脂質(zhì)體包封噬菌體的治療效果已得到諸多證明,但有研究表明,有尾噬菌體會(huì)與脂質(zhì)體雙分子層產(chǎn)生強(qiáng)烈相互作用,導(dǎo)致其包封效率極低[44]。Cinquerrui等[44]在殺死脂質(zhì)體外所有噬菌體后,對脂質(zhì)體內(nèi)的噬菌體進(jìn)行了量化,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)噬菌體并不是包封在脂質(zhì)體水核內(nèi),而是吸附在表面。這一發(fā)現(xiàn)與Nieth等[48]采用傳統(tǒng)薄膜水合方法封裝噬菌體時(shí)低溫透射電鏡以及熒光成像結(jié)果一致。吸附在脂質(zhì)體表面的噬菌體并不會(huì)受益于脂質(zhì)體的保護(hù)作用,但那些在體內(nèi)惡劣環(huán)境中存活并轉(zhuǎn)運(yùn)到感染部位的噬菌體仍可能與脂質(zhì)體一同被細(xì)胞內(nèi)化,從而靶向胞內(nèi)寄生菌。

上述體內(nèi)外研究表明,脂質(zhì)體作為噬菌體載體具有明確的入胞機(jī)制,能夠有效提高噬菌體的入胞效率,從而靶向清除胞內(nèi)寄生菌,并可保護(hù)噬菌體免受機(jī)體內(nèi)環(huán)境影響,防止噬菌體被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除,具有良好的應(yīng)用前景。但想要獲得更好的臨床治療效果,仍需進(jìn)一步提高脂質(zhì)體對噬菌體的包封效率以及儲(chǔ)存穩(wěn)定性,從而更有利于噬菌體脂質(zhì)體清除(殺滅)胞內(nèi)寄生菌。

3.4 聚合物作為載體

目前多數(shù)關(guān)于使用聚合物微粒包封噬菌體的研究,都是為避免噬菌體制劑在口服后受胃中蛋白水解環(huán)境或胃酸影響而失活。同時(shí),實(shí)現(xiàn)噬菌體緩慢釋放,增加噬菌體在感染部位的停留時(shí)間,達(dá)到提高噬菌體治療效果的目的。盡管使用聚合物(如海藻酸鹽、殼聚糖、果膠、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、丙烯酸樹脂等)包封噬菌體用于殺滅專性胞內(nèi)寄生菌的相關(guān)研究較少,但其應(yīng)用于殺滅兼性胞內(nèi)寄生菌(腸球菌和金黃色葡萄球菌)的研究非常多,并且效果較好[25]。由于海藻酸鹽基微粒及聚乳酸-羥基乙酸共聚物已被用于細(xì)胞內(nèi)藥物傳遞,因此本文后續(xù)重點(diǎn)介紹了這兩種聚合物作為載體介導(dǎo)噬菌體入胞的研究進(jìn)展。

3.4.1聚乳酸-羥基乙酸共聚物

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的生物可降解聚合物,由于其良好的生物相容性、可調(diào)節(jié)的降解特性和長期的臨床應(yīng)用,目前已作為傳遞載體廣泛應(yīng)用于小分子藥物和生物制劑(如肽、蛋白質(zhì)、DNA和RNA)等藥物。截至目前,已有數(shù)十種以PLGA為基礎(chǔ)的長效藥物獲得FDA批準(zhǔn)上市。如2018年上市的皮下利培酮長效注射劑(PerserisTM)[52],2020年上市的醋酸亮丙瑞林混懸液(Fensolvi?)[53]等。

Agarwal等[54]通過吸附法將銅綠假單胞菌噬菌體加入PLGA微粒中,并凍干成粉劑。該噬菌體粉劑在室溫下儲(chǔ)存14 d后,滴度下降約為0.5個(gè)數(shù)量級(jí)。此方法使用的PLGA微粒,可以使噬菌體在前5 min爆發(fā)釋放約15%,并且剩余噬菌體可持續(xù)釋放。使用干粉噴粉器將摻有乳糖的噬菌體PLGA微粒輸送給小鼠后,發(fā)現(xiàn)這些微粒分散于小鼠肺部各個(gè)位置,并可成功治療小鼠由銅綠假單胞菌引起的肺炎。

Jamaledin等[55]發(fā)現(xiàn)PLGA微粒包封攜帶表達(dá)卵清蛋白(OVA)抗原決定簇的工程噬菌體,能夠誘導(dǎo)機(jī)體先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。并且PLGA納米微粒(≤1 μm)可進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞),以及長時(shí)間向細(xì)胞內(nèi)輸送其包封的藥物[56]。同時(shí),包封噬菌體的PLGA微粒大小決定著噬菌體被巨噬細(xì)胞內(nèi)化程度[55]。較大的PLGA微粒(直徑8.0 μm)包封的噬菌體被巨噬細(xì)胞內(nèi)化程度低于較小的PLGA微粒(直徑1 μm)包封的噬菌體;并且PLGA多孔微粒包封的噬菌體被巨噬細(xì)胞的內(nèi)化程度低于PLGA無孔微粒。

綜上所述,使用大小合適的PLGA納米微粒包封噬菌體,可將噬菌體遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),從而靶向胞內(nèi)寄生菌。但目前噬菌體在被PLGA納米微粒包封后,存活時(shí)間仍受到限制,因此應(yīng)用該方法治療胞內(nèi)寄生菌,仍需提高噬菌體在PLGA聚合物內(nèi)長期儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。

3.4.2海藻酸鹽基微粒

海藻酸鹽是一種聚陰離子聚合物,是用于包裝噬菌體,使其可口服給藥最常用的聚合物[57]。海藻酸鹽基微?？杀Ｗo(hù)其包封的噬菌體免受酶降解,并且海藻酸鹽的膨脹與收縮具有pH依賴性,其在低pH環(huán)境(胃)內(nèi)呈收縮狀態(tài),但在高pH環(huán)境(腸)中會(huì)出現(xiàn)膨脹或進(jìn)一步溶解的現(xiàn)象[58]。該特性使其作為對pH敏感噬菌體入胞的載體具有一定優(yōu)勢。不僅如此,使用殼聚糖[59]、果膠[60]、乳清蛋白[61]和丙烯酸樹脂[62]等包被海藻酸鹽或與海藻酸鹽混合使用,可提高海藻酸鹽的酸穩(wěn)定性和/或調(diào)節(jié)腸道內(nèi)海藻酸鹽基微粒的膨脹現(xiàn)象,進(jìn)而延長海藻酸鹽包封噬菌體的活性。

Wall等[63]研究表明,使用海藻酸鹽基微粒包封噬菌體可有效減少沙門菌在豬扁桃體、回腸和盲腸中的定植。Ma等[64]測定海藻酸鹽/乳清蛋白包封的噬菌體在雛雞體內(nèi)時(shí)間分布,表明包封后的噬菌體在體內(nèi)停留的時(shí)間更長。Colom等[65]使用海藻酸鹽基微粒包封的噬菌體雞尾酒(UAB_Phi20、UAB_Phi78和UAB_Phi87)對肉雞進(jìn)行口服給藥,得到與Ma等相似的結(jié)果。該研究進(jìn)一步表明,每日使用包封后的噬菌體治療,可有效控制沙門菌感染。并且包封后的噬菌體與游離噬菌體相比,保護(hù)作用可持續(xù)更長時(shí)間,這與脂質(zhì)體包封噬菌體的研究結(jié)果相符合。Vinner等[62]研究證明,海藻酸鹽包封的大腸桿菌噬菌體K1F能夠被哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化,并清除寄生于細(xì)胞內(nèi)的大腸桿菌[66],從而有效保護(hù)人膀胱上皮細(xì)胞(ATCC?HTB-4TM)免受大腸桿菌株EV36-RFP的侵襲。

上述結(jié)果表明噬菌體可在海藻酸鹽微粒中長期保持活性,并且海藻酸鹽包封的噬菌體在體內(nèi)能夠成功治療細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染。這是由于海藻酸鹽微粒釋放的噬菌體能靶向目標(biāo)細(xì)胞,無論噬菌體是在細(xì)胞外釋放,還是被細(xì)胞內(nèi)化后釋放,都可能清除胞內(nèi)寄生菌。但將海藻酸鹽基微粒應(yīng)用于臨床,還需明確海藻酸鹽微粒包封噬菌體后的入胞機(jī)制,以及提高其入胞效率,從而提高噬菌體對胞內(nèi)寄生菌的殺菌效率。

4 挑戰(zhàn)與展望

目前許多研究已證明,噬菌體具有替代或補(bǔ)充抗生素成為新型抗菌藥物的潛力,特別是針對耐藥細(xì)菌感染和胞內(nèi)寄生菌感染,但將噬菌體應(yīng)用于臨床仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

噬菌體療法難以大范圍應(yīng)用于臨床的主要原因是噬菌體只有在細(xì)菌達(dá)到一定密度時(shí)才開始增殖,致使噬菌體療法使用過早或噬菌體劑量不合適,都可能導(dǎo)致噬菌體在開始增殖之前被機(jī)體清除掉[67]。目前對噬菌體的藥代動(dòng)力學(xué)特性仍缺乏了解,包括給藥后噬菌體穩(wěn)定性、哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)噬菌體和細(xì)菌之間的相互作用,以及噬菌體對機(jī)體免疫應(yīng)答的影響[68-70]。因此,仍需更多基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證噬菌體療法的療效,并評(píng)估噬菌體的理想劑量、給藥頻率以及噬菌體治療的持續(xù)時(shí)間。

一些用于治療的噬菌體產(chǎn)品已在一些東歐國家上市,并越來越多地應(yīng)用于感染性疾病的治療,但目前還未有載體介導(dǎo)噬菌體入胞用于清除胞內(nèi)寄生菌的臨床試驗(yàn)。噬菌體療法與傳統(tǒng)抗生素療法存在的差異使其在應(yīng)用于臨床前需進(jìn)行臨床隨機(jī)試驗(yàn)來確認(rèn)其療效,這導(dǎo)致噬菌體療法難以大規(guī)模應(yīng)用于臨床,目前僅限于對個(gè)別患者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。

由于噬菌體具有高度特異性,為最大限度地發(fā)揮噬菌體療法的治療潛力,最好是挑選多價(jià)噬菌體制作噬菌體雞尾酒,使其具有廣譜抗菌作用。但制備含有多種噬菌體且滴度穩(wěn)定的噬菌體制劑,需解決諸多相關(guān)的技術(shù)挑戰(zhàn)。例如,噬菌體制劑面對生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力是否具有魯棒性等。最近完成的噬菌體治療人類細(xì)菌感染的跨國臨床研究計(jì)劃中[71],單個(gè)噬菌體表現(xiàn)出優(yōu)異儲(chǔ)存穩(wěn)定性,但該研究中噬菌體雞尾酒PP1131(由12個(gè)天然裂解性假單胞菌噬菌體組成)的總效價(jià)在制備后15 d內(nèi)卻下降了3個(gè)數(shù)量級(jí)。因此,擴(kuò)大噬菌體制劑宿主譜更可行的方法是鑒定天然多價(jià)噬菌體或具有寬宿主譜的基因工程噬菌體,從而最大限度地減少雞尾酒配方所需的噬菌體種類。

胞內(nèi)寄生菌引起的感染性疾病,難以通過常規(guī)方法治療,且治療失敗風(fēng)險(xiǎn)極大。雖然一些噬菌體已被證明具有穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜、靶向胞內(nèi)寄生菌并發(fā)揮其裂解活性的能力,但上述研究表明,無機(jī)納米顆粒、脂質(zhì)體、PLGA微粒等載體介導(dǎo)噬菌體投遞入胞,可使噬菌體在機(jī)體內(nèi)環(huán)境保持活性,提高噬菌體入胞效率,更好地靶向胞內(nèi)寄生菌。上述載體中,脂質(zhì)體作為載體,具有明確的入胞機(jī)制,可有效提高噬菌體入胞效率,并防止噬菌體被宿主免疫系統(tǒng)清除和免受細(xì)胞內(nèi)環(huán)境影響,這使得脂質(zhì)體也成為研究最廣泛且最成熟的介導(dǎo)噬菌體入胞的載體。目前載體介導(dǎo)噬菌體入胞的相關(guān)研究主要集中于研究噬菌體、胞內(nèi)寄生菌以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞之間的相互作用,以及明確各種載體的入胞機(jī)制,提高載體包封噬菌體的效率及包封后的入胞效率,從而開發(fā)適用于介導(dǎo)噬菌體入胞的載體的試驗(yàn)/技術(shù)平臺(tái)。這些新的試驗(yàn)/技術(shù)平臺(tái),對載體介導(dǎo)噬菌體入胞、控制或治療胞內(nèi)寄生菌感染至關(guān)重要。

綜上可以看出,應(yīng)用載體介導(dǎo)噬菌體入胞,清除胞內(nèi)寄生菌的治療方法前景十分廣闊。但國內(nèi)開展噬菌體治療的起步時(shí)間較之國外相對較晚,針對胞內(nèi)寄生菌感染的相關(guān)臨床病例較少,導(dǎo)致國內(nèi)噬菌體在胞內(nèi)寄生菌研究方面相對滯后。隨著胞內(nèi)寄生菌感染的病例逐漸增多,未來國內(nèi)關(guān)于噬菌體抗胞內(nèi)寄生菌的治療基礎(chǔ)和臨床研究同樣會(huì)逐漸增加。相信載體介導(dǎo)噬菌體入胞,在未來可能會(huì)成為理想的控制、治療胞內(nèi)寄生菌感染的療法,在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。