武艷飛，楊衛(wèi)平，邵莉

湖州市第一人民醫(yī)院口腔科，浙江湖州 313000

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）約占口腔惡性腫瘤的90%。在過(guò)去的20 年中，OSCC 的治療手段有所進(jìn)展，但OSCC 患者的5年生存率仍不足55%[1]。轉(zhuǎn)錄因子SNAI1 為轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail 家族成員之一，目前普遍認(rèn)為，SNAI1可通過(guò)調(diào)控下游靶基因上皮鈣黏素（E-cadherin）等的表達(dá)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT），促進(jìn)腫瘤的遷移與侵襲。相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，SNAI1 在黑色素瘤、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、口腔鱗癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)[2-8]。但SNAI1 在OSCC 中的研究較少，本研究通過(guò)沉默轉(zhuǎn)錄因子SNAI1 觀(guān)察其在OSCC Tca8113 細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)OSCC Tca8113 細(xì)胞生物活性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113（貨號(hào)：BFN60700396）購(gòu)買(mǎi)于BFB 生命科學(xué)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：10567014）、胎牛血清（fetal boyine serum，F(xiàn)BS）（貨號(hào)：SH30080.03）、0.25%胰酶消化液（貨號(hào)：SH30042.01）均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Invitrogen，美國(guó)，貨號(hào)：11668027）；MTT 檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：23250、4890-025-K）；SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Kit（Perfect Real Time）（TAKARA公司，日本，貨號(hào)：RR820A、RR047AA）；膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-fluoresceinisothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD 公司，美國(guó)，貨號(hào)：556547）；GAPDH 兔多抗（Bioworld 公司，美國(guó)）；兔抗SNAI1、兔抗胱天蛋白酶3（caspase-3)、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9（Abcam，美國(guó)，貨號(hào)：ab216347、ab13748、ab92536、ab228402）；兔抗Bax、兔抗c-Myc、兔抗Bcl-2、兔抗cyclin D1（R&DSYSTEMS，美國(guó)，貨號(hào)：MAB846、MAB3696、MAB8272、MAB4314）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（Santa Cruz 公司，美國(guó)，貨號(hào)：sc2004）；SNAI1 shRNA（sh-SNAI1）及其陰性對(duì)照（sh-control）（上海生工生物公司）。

流式細(xì)胞儀（BD 公司，美國(guó)）；酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀（雷勃Multiskan MK-3，芬蘭）；CO2培養(yǎng)箱（SHEL-LAB 公司，美國(guó)）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（ABI 公司，美國(guó)）；倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) Tca8113 細(xì)胞復(fù)蘇后，將其置于10% FBS DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為 3 組：Tca8113 細(xì)胞組、sh-control 組、sh-SNAI1 組，其中sh-control 組、sh-SNAI1 組分別用 sh-control、sh-SNAI1 轉(zhuǎn)染Tca8113 細(xì)胞，而Tca8113 細(xì)胞組不作任何處理，轉(zhuǎn)染48h 后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 MTT 法檢測(cè)Tca8113 細(xì)胞增殖 Tca8113 細(xì)胞調(diào)整為1×105個(gè)/ml，將其接種于96 孔板（100μl/孔），48h 后，添加MTT 溶液10μl，4h 后，每孔添加二甲基亞砜150μl，充分混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)492nm波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值×100%。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tca8113 細(xì)胞凋亡 各組Tca8113 細(xì)胞培養(yǎng)24h 后，依據(jù)Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法，先加入5μl Annexin V-FITC，再加入5μl PI，室溫條件下避光反應(yīng)20min，使用流式細(xì)胞儀觀(guān)察各組Tca8113 細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Tca8113 細(xì)胞侵襲能力首先在小室內(nèi)加入100μl 稀釋好的Matrigel 基質(zhì)膠放置超凈臺(tái)紫外線(xiàn)消毒殺菌過(guò)夜，在小室上部加入200μl 無(wú)血清培養(yǎng)基，下室中加入600μl 含10% FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液，48h 后棄去24 孔板下室中的培養(yǎng)基，加入無(wú)水乙醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，結(jié)晶紫染色，輕輕擦掉未侵入基質(zhì)膠中的Tca8113 細(xì)胞，顯微鏡下觀(guān)察并記錄侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值。

1.3.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估Tca8113 細(xì)胞遷移能力Tca8113 細(xì)胞以l×106cell/ml 的濃度接種于6 孔板，使用10μl 槍頭進(jìn)行劃線(xiàn)，分別在0h 和24h 觀(guān)察拍照記錄同一位置的劃痕寬度，并依據(jù)公式[劃痕愈合率=（0h 劃痕寬度-24h 劃痕寬度）／0h 劃痕寬度×100%]計(jì)算劃痕愈合率。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) SNAI1 mRNA 表達(dá)水平 利用Trizol 一步法進(jìn)行RNA 提??；取1μl RNA 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用SYBR Green 試劑盒評(píng)價(jià)SNAI1 mRNA表達(dá)水平。循環(huán)條件如下：94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 20s 和72℃ 40s，35 個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5min。引物序列：SNAI1 正向引物5'-TTCTTCTGCGCTA CTGCTGCG-3'，反向引物5'-GGGCAGGTATGGAG AGGAAGA-3'；GAPDH 正向引物5'-GCACCGTCAA GGCTGAGAAC-3'，反向引物5'-TGGTGAAGACGC CAGTGGA-3'。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)SNAI1、c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平 按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后48h，收取各組細(xì)胞，分別加入蛋白裂解液進(jìn)行總蛋白提取。用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)其蛋白濃度，于99℃進(jìn)行蛋白變性，并進(jìn)行10% SDS 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封膜1h，分別添加兔抗SNAI1（1∶500）、c-Myc（1∶1000）、cyclin D1（1∶200）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶1000）、caspase-3（1∶500）、MMP-2（1∶200）、MMP-9（1∶200）4℃下過(guò)夜孵育，次日添加兔二抗（1∶5000）孵育膜1h，再使用ECL 底物進(jìn)行顯色，Image J 軟件進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布及方差齊性的采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Tca8113 細(xì)胞中SNAI1 mRNA 表達(dá)水平

sh-control組和Tca8113細(xì)胞組中SNAI1 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.07±0.14）vs.（1.06±0.13），P＞0.05]；但與sh-control 組相比，sh-SNAI1 組中SNAI1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低[（1.07±0.14）vs.（0.51±0.08），P＜0.05]。

2.2 沉默SNAI1 對(duì)細(xì)胞存活率的影響

sh-control 組與Tca8113 細(xì)胞組的細(xì)胞存活率和c-Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但與sh-control 組相比，sh-SNAI1 組的細(xì)胞存活率和c-Myc、cyclin D1 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組增殖相關(guān)蛋白條帶圖

表1 沉默SNAI1 對(duì)Tca8113 細(xì)胞增殖的影響（）

表1 沉默SNAI1 對(duì)Tca8113 細(xì)胞增殖的影響（）

注：與sh-control 組比較，*P＜0.05

2.3 沉默SNAI1 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

sh-control 組和Tca8113 細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡率和Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；sh-SNAI1 組的細(xì)胞凋亡率和Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)顯著高于sh-control組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著低于sh-control組，見(jiàn)圖2、表2。

表2 沉默SNAI1 對(duì)Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響（）

表2 沉默SNAI1 對(duì)Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響（）

注：與sh-control 組比較，*P＜0.05

圖2 各組凋亡相關(guān)蛋白條帶圖

2.4 沉默SNAI1 對(duì)Tca8113 細(xì)胞遷移能力的影響

sh-control 組和Tca8113 細(xì)胞組的劃痕愈合率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（26.38±2.53）%vs.（25.66±2.37）%，P＞0.05]；與sh-control 組比較，sh-SNAI1 組的劃痕愈合率顯著降低[（26.38±2.53）%vs.（10.36±1.53）%，P＜0.05]，見(jiàn)圖3。

圖3 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力（×100）

2.5 沉默SNAI1 對(duì)Tca8113 細(xì)胞侵襲能力的影響

sh-control 組和Tca8113 細(xì)胞組的侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（165.77±12.16）個(gè)vs.（164.89±12.55）個(gè)，P＞0.05]；與 sh-control組比較，sh-SNAI1 組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少[（165.77±12.16）個(gè)vs.（80.13±11.37）個(gè)，P＜0.05]，見(jiàn)圖4。

圖4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

2.6 沉默SNAI1 對(duì)Tca8113 細(xì)胞SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

sh-control 組和Tca8113 細(xì)胞組的SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與sh-control 組比較，sh-SNAI1 組的SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表3。

圖5 各組SNAI1 蛋白及侵襲遷移相關(guān)蛋白條帶圖

表3 沉默SNAI1 對(duì)SNAI1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響（）

表3 沉默SNAI1 對(duì)SNAI1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響（）

注：與sh-control 組比較，*P＜0.05

3 討論

OSCC 是常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管治療手段取得較大進(jìn)展，但OSCC 患者的存活率仍低于50%[9-10]。OSCC 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全明確。

SNAI1 作為關(guān)鍵的EMT 調(diào)節(jié)因子，在侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，主要與SNAI1 抑制E-cadherin表達(dá)而介導(dǎo)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)[11]。在骨肉瘤細(xì)胞研究中，miR-153 通過(guò)靶向抑制SNAI1控制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、遷移和EMT[12]。在乳腺癌MCF7 細(xì)胞中，沉默SNAI1 可影響EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)，減弱腫瘤的擴(kuò)散、遷移和侵襲能力[13]。此外，值得注意的是，在OSCC 細(xì)胞系SCC-9 和HSC-4 的細(xì)胞研究中，核粒梭菌可通過(guò)上調(diào)SNAI1 表達(dá)，促進(jìn)OSCC 細(xì)胞中EMT 轉(zhuǎn)化[14]。另外，Yang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)SNAI1 在OSCC 組織中高表達(dá)，且與T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和分化程度有關(guān)，與Song 等[16]研究結(jié)果相吻合，對(duì)OSCC 的臨床診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)和靶向治療具有重要的理論參考價(jià)值?；谝陨涎芯浚?dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-SNAI1 后，SNAI1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞存活率、劃痕愈合率與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，凋亡率顯著升高，Tca8113 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲均降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、c-Myc、Bcl-2 水平顯著降低，細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、Bax水平顯著升高，進(jìn)一步表明沉默 SNAI1 可抑制Tca8113 細(xì)胞的惡性行為。

綜上所述，沉默SNAI1 可抑制OSCC 的增殖、侵襲與遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為OSCC 的診治提供新靶點(diǎn)，但由于機(jī)制復(fù)雜，單一細(xì)胞研究存在不足之處，后續(xù)將進(jìn)一步研究以證實(shí)。