常艷婷,張聞博,夏夢(mèng)思,范可可,胡曉萌,王淑華,張 雪,白一葦,張 娜,胡 陶,江澤慧

(國際竹藤中心,園林花卉與景觀研究所,國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100102)

牡丹(PaeoniaSect.Moutan)屬于芍藥科芍藥屬牡丹組,其9個(gè)原生種都原產(chǎn)于我國。作為一種常見的園林植物,牡丹具有花大色艷、雍容華貴的特點(diǎn),因此備受民眾喜愛,被稱作“花中之王”。牡丹的花期集中在4—5月,有效觀賞時(shí)間受限。因此,探究牡丹開花時(shí)間的調(diào)控機(jī)理,并用于調(diào)控牡丹錯(cuò)峰開花,有利于增加牡丹的觀賞價(jià)值。

SEPALLATA1(SEP1)是MADS-box家族的基因,在植物中普遍存在,并且在植物形態(tài)建成、花分生組織鑒定、花器官特化和果實(shí)成熟等方面的功能較為保守。桃中SEP基因參與調(diào)控果實(shí)的成熟與軟化過程[1]。黃瓜中SEP基因與SHP基因互作,共同調(diào)控花器官的形成[2]。番茄中的SEP基因SlCMB1表達(dá)受到抑制會(huì)造成花序形態(tài)改變和花瓣的擴(kuò)大[3]。水稻中SEP基因OsMADS5和OsMADS34則調(diào)控花序的分枝狀態(tài)[4]。在植物ABCE模型中屬于E類基因,調(diào)控花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊的發(fā)育。擬南芥中的4個(gè)SEP基因(SEP1、SEP2、SEP3、SEP4)在花器官發(fā)育過程中是花瓣、雄蕊和心皮發(fā)育所必需的,并且需要與ABC類基因共同行使功能[5-6],sep1sep2sep3sep4四突變體中,4種花器官全都突變?yōu)槿~狀的結(jié)構(gòu),而在sep1sep2sep3三突變體中則突變?yōu)檩嗥瑺畹慕Y(jié)構(gòu),但是AtSEP1、AtSEP2、AtSEP4在花發(fā)育的早期表達(dá),如萼片原基和分生組織等,而AtSEP3則在后期表達(dá),因此,SEPs基因被認(rèn)為具有冗余但不完全相同的功能[5]。SEP還參與調(diào)控植物花形態(tài)建成,如心皮和胚珠的特化,主要是通過與其他轉(zhuǎn)錄因子蛋白互作來調(diào)控心皮和胚珠的特化。在十字花科的菘藍(lán)(Isatisindigotica)中IiSEP4通過與IiSVP、IiSHP2和IiFUL之間發(fā)生蛋白互作來分別調(diào)控開花時(shí)間、柱頭的鑒定和果實(shí)的發(fā)育[7]。梅花(Prunusmume)中的PmSEP4可以與PmSEP1和PmSEP2之間兩兩互作,但只參與萼片的形成,而PmSEP2和PmSEP3則參與梅花雄蕊和雌蕊的形成[8]。

SEP1還可以通過與ABC類基因形成蛋白復(fù)合體從而調(diào)控葉片轉(zhuǎn)化為花器官的過程,縮短植物的營養(yǎng)生長時(shí)期,影響植物的開花時(shí)間。小麥中的SEP-like基因TaMADS1過量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致擬南芥提早開花和花器官發(fā)育改變,如萼片變成葉片、花瓣和柱頭的數(shù)目減少等[9]。甜櫻桃中的PavSEP可以與PavSVP互作,共同促進(jìn)成花轉(zhuǎn)變[10]。牡丹中曾被報(bào)道1個(gè)在趙粉中克隆的SEP1基因PsMADS5,其在花瓣中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他花器官,表明該基因可能參與花瓣的發(fā)育調(diào)控,但發(fā)揮功能的機(jī)制尚不清楚[11]。

牡丹中包括調(diào)控開花時(shí)間的SVP、SOC1、FUL和調(diào)控花器官發(fā)育的AGL6、AP1、SEP1、MADS4、MADS5等在內(nèi)的MADS-box家族基因已見報(bào)道。其中,FUL1基因是在洛陽紅中克隆得到,是調(diào)節(jié)開花的重要轉(zhuǎn)錄因子[12]。魯菏紅中PsSVP基因的表達(dá)量隨著花芽休眠解除而上升,并且在擬南芥中超表達(dá)該基因可以造成開花時(shí)間的推遲和根長、株高的發(fā)育延緩[13]。紫斑牡丹(Paeoniarockii)中的PrSOC1基因在花芽中表達(dá)量最高,為牡丹開花時(shí)間調(diào)控提供了新的基因資源[14]。洛陽紅中的PsAGL6在薔薇型牡丹花瓣中表達(dá)量最高,表明其參與牡丹花器官的形成[15]。但牡丹中是否有參與調(diào)控開花時(shí)間的SEP1基因,還有待于進(jìn)一步的挖掘。

本研究以二次開花牡丹品種海黃(High noon)花芽發(fā)育過程的cDNA文庫為材料,獲得PlSEP1基因的全長編碼序列,利用生物信息學(xué)分析其理化特性和進(jìn)化關(guān)系,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析PlSEP1基因在牡丹花芽發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式,探究PlSEP1與開花時(shí)間調(diào)控之間的關(guān)系,通過在擬南芥中異源過量表達(dá)來探索PlSEP1對(duì)植物生長發(fā)育的影響,進(jìn)而為牡丹開花時(shí)間的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用海黃牡丹品種來自山東省菏澤冠宇牡丹產(chǎn)業(yè)有限公司種植基地。海黃花芽在9月開始進(jìn)入第1次花芽發(fā)育階段,分別于2017年9月采集第1次開花的花芽營養(yǎng)期(Vegetative stage,VS),10,11月采集同一批次的花芽分化期(Differentiation stage,DS)及完成期(Differentiation completed stage,DCS)[16],采集的花芽置于液氮中速凍,之后用裝有干冰的泡沫盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取與定量PCR 利用RNA提取試劑盒(華越洋,中國)提取海黃花芽發(fā)育3個(gè)時(shí)期的總RNA。3個(gè)時(shí)期的RNA等量混合后測全長轉(zhuǎn)錄組,單獨(dú)3個(gè)重復(fù)測二代轉(zhuǎn)錄組。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金,中國,AT311-02)合成cDNA。設(shè)計(jì)PlSEP1基因特異引物(表1),以TUBULIN基因?yàn)閮?nèi)參,利用TBGreenⅡ(TaKaRa,RR820A)定量試劑在qTOWER儀器(耶拿,德國)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù),每組設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系為20 μL(TBGreenⅡ mix 10 μL、上下游引物(20 mmol/L)1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL)。下機(jī)結(jié)果利用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2PlSEP1基因CDS序列的獲得與表達(dá)載體構(gòu)建 利用擬南芥中的AtSEP1基因序列在園林花卉與景觀研究所前期獲得的海黃花芽全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì),獲得相似性最高的同源基因,命名為PlSEP1,根據(jù)該基因的序列信息設(shè)計(jì)上、下游特異引物(表1),以海黃花芽的總cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增PlSEP1基因;PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳后膠回收,將獲得的基因片段利用雙酶切法連接到PHG載體中,通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑選陽性克隆進(jìn)行菌落PCR后,經(jīng)測序驗(yàn)證正確,即為PlSEP1表達(dá)載體。

表1 引物信息列表Tab.1 Primer information list

1.2.3PlSEP1基因的多序列比對(duì)與建樹 利用MAFFT軟件[17]對(duì)PlSEP1和其他物種SEP1基因的氨基酸序列(NCBI網(wǎng)站下載)進(jìn)行多序列比對(duì),參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)。

利用MEGA 7軟件[18]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。經(jīng)過ClustalW多序列比對(duì)后,利用Neighbour-Joining法(NJ法)計(jì)算遺傳距離,參數(shù)設(shè)置:1 000步長重復(fù),泊松模型。

1.2.4PlSEP1基因的生物信息學(xué)預(yù)測 利用NCBI CD-Search網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi?)預(yù)測PlSEP1基因編碼氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域。利用ExPASy網(wǎng)站[19](https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)分析PlSEP1蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)。利用SiglalP-5.0軟件[20](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測PlSEP1中的信號(hào)肽。

1.2.5PlSEP1基因的亞細(xì)胞定位 將構(gòu)建好的PlSEP1表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101,經(jīng)過液體培養(yǎng)至OD600為0.6,集菌并懸菌,利用注射器侵染煙草葉片下表皮,光照培養(yǎng)3～7 d,剪取約0.5 cm×0.5 cm面積的葉片在熒光顯微鏡下488 nm激發(fā)光下觀察發(fā)光情況,DAPI染色觀察細(xì)胞核所在位置。

1.2.6PlSEP1基因的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證 將構(gòu)建好的PlSEP1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌種GV3101,利用浸花法侵染擬南芥野生型(Col-0)花序,經(jīng)過潮霉素篩選及擴(kuò)繁獲得穩(wěn)定遺傳的擬南芥植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 PlSEP1基因CDS的獲得與序列分析

以牡丹花芽的cDNA為模板,利用全長轉(zhuǎn)錄組設(shè)計(jì)引物,通過PCR得到長度為735 bp的片段,共編碼244個(gè)氨基酸,測序后經(jīng)Blast分析,表明該基因?yàn)橹参颯EP1的同源基因,命名為PlSEP1。NCBI CD-Search網(wǎng)站預(yù)測SEP1蛋白包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別為MADS-DEF2-like結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域(圖1),表明PlSEP1屬于MADS-box基因家族。

利用MAFFT軟件對(duì)PlSEP1蛋白氨基酸序列與其他物種中的SEP1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明,PlSEP1蛋白與其他物種的SEP1的蛋白具有較高的相似性,具有MADS-box基因家族所特有的MADS-DEF2-like結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域。

為探究PlSEP1與其他物種中SEP1的親緣關(guān)系,利用MEGA 7軟件對(duì)PlSEP1編碼的氨基酸序列與其他物種中的SEP1的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)PlSEP1與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)、中華獼猴桃(Actinidiachinesis)親緣關(guān)系較近,與香睡蓮(Nymphaeaodorata)、中國蓮(Nelumbonucifera)、郁金香(Tulipagesneriana)、同色兜蘭(Paphiopedilumconcolor)和鴿石斛(Dendrobiumcrumenatum)親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與前人報(bào)道的趙粉中的PsMADS5也較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 PlSEP1與其他物種SEP1的進(jìn)化Fig.2 Phylogenetic tree of PlSEP1 and SEP1 proteins from other species

2.2 PlSEP1蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測

利用ExPASy軟件預(yù)測得知,PlSEP1的相對(duì)分子質(zhì)量為27 858.66,理論等電點(diǎn)(pI)為5.87,蛋白質(zhì)分子式為C1215H1957N355O375S10,原子總數(shù)為3 912。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為56.47,屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪酸指數(shù)為75.36,總疏水性數(shù)值為-0.698,預(yù)測該蛋白為親水性蛋白。利用SiglalP-5.0預(yù)測蛋白的信號(hào)肽,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PlSEP1蛋白中CS平均加權(quán)值為0.001 9,遠(yuǎn)小于0.5,故推測PlSEP1不含信號(hào)肽。

2.3 PlSEP1的亞細(xì)胞定位

為探究PlSEP1在細(xì)胞中的表達(dá)位置,本研究利用煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系觀察PlSEP1的亞細(xì)胞定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PlSEP1蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá),與其轉(zhuǎn)錄因子特性一致(圖3)。

圖3 PlSEP1的亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of PlSEP1

2.4 PlSEP1的表達(dá)特性分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測PlSEP1基因在海黃不同組織材料中的表達(dá)量,結(jié)果顯示(圖4),PlSEP1基因在花芽中表達(dá)量最高,其次依次為花瓣、雄蕊、雌蕊和莖,而在葉中表達(dá)量最低,表明PlSEP1基因可能在花芽和花發(fā)育中發(fā)揮功能。

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。圖5—6同。Different lowercase letters above bars means significant difference(P<0.05).The same as Fig.5—6.圖4 PlSEP1在不同組織中的表達(dá)量分析Fig.4 Relative expression level of PlSEP1 in different tissue

為進(jìn)一步探究PlSEP1基因在花芽發(fā)育過程中的作用,本研究利用花芽發(fā)育的營養(yǎng)期、發(fā)育期和完成期的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其表達(dá)量。結(jié)果顯示,PlSEP1基因在花芽分化期表達(dá)量最高,而在營養(yǎng)期表達(dá)量最低(圖5),表明PlSEP1在花芽的成花轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮作用。

圖5 PlSEP1在花芽發(fā)育過程中的表達(dá)量分析Fig.5 Relative expression level of PlSEP1 in floral bud development

2.5 PlSEP1過表達(dá)擬南芥的開花特性

為研究PlSEP1基因的功能,本研究在擬南芥中過量表達(dá)PlSEP1基因,獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株OE1、OE2、OE3這3個(gè)株系(圖6-A、B)。相比野生型,過表達(dá)PlSEP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥開花時(shí)間平均為27 d,而對(duì)照組開花時(shí)間平均為39 d(圖6-C、D),轉(zhuǎn)基因組顯著早于對(duì)照組。同時(shí)觀察開花時(shí)蓮座葉數(shù)量,發(fā)現(xiàn)野生型植株開花時(shí)平均具有14片蓮座葉,而過表達(dá)PlSEP1的擬南芥植株則在開花時(shí)的蓮座葉數(shù)量均低于10片,顯著低于對(duì)照組,這些結(jié)果表明PlSEP1可能參與調(diào)控開花時(shí)間。

圖6 過表達(dá)PlSEP1擬南芥的早花表型Fig.6 Early flowering phynotype of OE-PlSEP1 in Arabidopsis

3 結(jié)論與討論

本研究利用前期獲得的全長轉(zhuǎn)錄組中的序列信息在二次開花牡丹品種海黃中獲得1個(gè)PlSEP1基因,經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn),該基因具有MADS-box家族保守的結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),海黃中的PlSEP1蛋白與擬南芥、大豆和中華獼猴桃等物種中的SEP1蛋白親緣關(guān)系較近,而趙粉中的SEP基因編碼的PsMADS5蛋白則與鴿石斛更近,表明海黃與趙粉的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這可能與其親本之間的親緣關(guān)系相關(guān),趙粉屬于中原牡丹品種群,而海黃的親本則是滇牡丹(Paeonialutea)。

熒光定量分析顯示,本研究中的PlSEP1基因在海黃花芽分化期表達(dá)量最高,而在營養(yǎng)生長期和花芽分化完成期表達(dá)量較低,表明PlSEP1基因的功能主要是促進(jìn)花芽的成花轉(zhuǎn)變,而洛陽紅中的FUL1基因表達(dá)量因花期早晚與開花時(shí)期不同而差異顯著,表明其在開花時(shí)間調(diào)控中具有重要作用,而前人在牡丹品種趙粉中克隆得到的SEP基因PsMADS5則主要在花瓣中表達(dá),可能參與花瓣的形態(tài)建成,表明SEP基因在牡丹中的作用不同。在擬南芥中過表達(dá)PlSEP1基因時(shí)則表現(xiàn)出開花提前的表型,表明PlSEP1基因具有促進(jìn)開花的功能,這與小麥中的SEP基因TaMADS1[9]和崧藍(lán)中的LiSEP1基因[21]表現(xiàn)一致,表明SEP基因在調(diào)控植物開花時(shí)間方面具有一定的保守性。而在雷竹中發(fā)現(xiàn)的SEP-like基因PvMADS5則具有抑制擬南芥植株開花的功能[22],與本研究中的基因功能相反,表明SEP1基因的功能分化具有多樣性。本研究中的PlSEP1基因是通過何種機(jī)制促進(jìn)花芽分化的,是否有其他因子的相互作用,還有待進(jìn)一步的研究。

本研究中獲得的PlSEP1是在牡丹品種海黃的花芽中克隆得到的,而海黃是牡丹中的一個(gè)特殊品種,具有連續(xù)形成花芽、連續(xù)成花的特性[23-24]。同時(shí),PlSEP1基因具有促進(jìn)擬南芥提早開花的特點(diǎn),并且在花芽分化及形成過程中表達(dá)量顯著變化,結(jié)合二者之間的關(guān)系,推斷PlSEP1基因可能是通過影響海黃中花芽的形成,從而促使其連續(xù)成花,當(dāng)然這一推論還需要進(jìn)一步的證據(jù)來證明。本研究在二次開花牡丹品種海黃中獲得的PlSEP1基因具有促進(jìn)開花的生理功能,但在其他方面的功能還有待于進(jìn)一步研究。

本研究在牡丹二次開花品種海黃中獲得1個(gè)SEP類基因PlSEP1,其開放閱讀框?yàn)?35 bp,編碼244個(gè)氨基酸,具有MADS-box基因家族成員保守的MADS-DEF2-like和K-box結(jié)構(gòu)域,親緣關(guān)系上PlSEP1與擬南芥、大豆和中華獼猴桃等物種中的SEP1較近。PlSEP1在花芽的成花轉(zhuǎn)變過程中表達(dá)量升高,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中,并且在擬南芥中超表達(dá)能夠促進(jìn)開花,因此,推測PlSEP1是促進(jìn)牡丹開花的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。