許娜麗， 余慧霞， 姚明明， 王彥青， 李清峰， 劉彩霞， 孫剛，陳佳靜， 龍姣卉， 王掌軍*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 銀川 750021；2.信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河南 信陽 064000）

小麥（Triticum aestivumL.）作為世界和我國重要糧食作物之一，是全球約35%～40%人口的主食，提供人類約21%的食物熱量和20%的蛋白質(zhì)，其產(chǎn)量高低和品質(zhì)優(yōu)劣直接關(guān)系國家糧食安全和人民生活水平[1-3]。目前，由于少量骨干親本的高頻利用和育種選擇，導(dǎo)致大量?jī)?yōu)異基因流失，品種資源的遺傳多樣性日益狹窄。而小麥遺傳多樣性的開發(fā)是品種改良的基礎(chǔ)，對(duì)小麥育種起重要作用[4-5]。目前，小麥遺傳多樣性研究多基于表型和分子標(biāo)記分析，表型性狀受基因顯隱性關(guān)系及環(huán)境條件的影響，造成其多樣性分析結(jié)果不穩(wěn)定；分子標(biāo)記體現(xiàn)了DNA水平上的遺傳差異，能更深入、穩(wěn)定地分析小麥品種資源的遺傳多樣性[6]。目前，國內(nèi)外學(xué)者利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）、簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）等分子標(biāo)記研究小麥的遺傳多樣性，分析了小麥品種資源的遺傳基礎(chǔ)和親緣關(guān)系[7-15]。王秋云等[16]利用SSR標(biāo)記對(duì)引自國際玉米小麥改良中心（International Maize and Wheat Improvement Center，CIMMYT）的56份人工合成小麥進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)人工合成小麥較栽培品種具有更高的遺傳多樣性。張思妮等[17]基于102對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)128份國內(nèi)外小麥進(jìn)行分析，其多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）為0.248～0.897，平均0.724，表明小麥的遺傳多樣性較高。Wang等[18]利用62個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)238個(gè)國外小麥品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均每個(gè)SSR標(biāo)記有19.37個(gè)等位基因，其PIC值為0.760，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。Dong等[19]利用30個(gè)SRAP標(biāo)記分析了15份以色列野生小麥的遺傳多樣性，其Nei’s多樣性指數(shù)（H）和Shannon指數(shù)（I）分別為0.198和0.295，表現(xiàn)出較低的多樣性水平。Hassan等[20]利用36對(duì)有多態(tài)性的SRAP標(biāo)記對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)的50份春小麥材料的多樣性進(jìn)行研究，表明地理來源相同的春小麥品種之間遺傳差異較小，種植區(qū)域的環(huán)境（自然選擇）是影響春小麥親緣關(guān)系的重要因素。趙小慶等[21]利用17對(duì)SRAP標(biāo)記對(duì)7個(gè)內(nèi)蒙古春小麥品種進(jìn)行分析，其PIC、有效等位基因數(shù)（Ne）、I分別為0.630、1.601、0.710，表明研究材料遺傳變異較大。小麥產(chǎn)業(yè)未來發(fā)展面臨提升質(zhì)量、降低成本和環(huán)境保護(hù)3大挑戰(zhàn)。寧夏作為北方主要春麥區(qū)之一，本地品種資源相對(duì)匱乏，且親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性日趨狹窄，這些已成為制約寧夏小麥新品種選育的瓶頸。因此，本研究基于課題組前期對(duì)251份小麥種質(zhì)資源主要農(nóng)藝與品質(zhì)性狀遺傳多樣性的分析[22]，利用SSR和SRAP標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行DNA水平上的遺傳多樣性分析，以期明確品種間的親緣關(guān)系和遺傳差異，結(jié)合不同類群品種的農(nóng)藝與品質(zhì)性狀表現(xiàn)，挖掘優(yōu)異育種親本，指導(dǎo)雜交組合配制，為寧夏小麥遺傳改良及新品種選育提供優(yōu)良基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以來自國內(nèi)外的251份小麥品種資源（表1）為研究對(duì)象，均由寧夏大學(xué)小麥育種課題組提供。材料包括205份育成品種，其中寧夏51份，國內(nèi)其他?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）151份，國外3份；46份地方品種，其中寧夏8份，國內(nèi)其他?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）31份，國外7份。

表1 供試材料編號(hào)與名稱Table 1 Code and name of the test materials

表1 供試材料編號(hào)與名稱Table 1 Code and name of the test materials 續(xù)表Continued

表1 供試材料編號(hào)與名稱Table 1 Code and name of the test materials 續(xù)表Continued

于2020和2021年將251份小麥品種種植在寧夏大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)（38°13′3″N，106°14′12″E）。試驗(yàn)地屬中溫帶干旱氣候區(qū)，海拔1 110 m，有效積溫3 300 ℃，平均氣溫8.5 ℃，年降水量180～200 mm，土壤為灌淤土，肥力中等，可揚(yáng)黃自流灌溉。2年材料均種植在地力、水肥條件均一的同地段，每個(gè)材料種植5行，行長1.10 m，行距0.20 m，田間管理同大田。

1.2 農(nóng)藝性狀考察

農(nóng)藝性狀考察參照《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[23]，每個(gè)性狀設(shè)置15次重復(fù)。其中，株高、穗下莖長和穗長均采用卷尺測(cè)量；有效小穗數(shù)為每個(gè)單株上的總小穗數(shù)；不孕小穗數(shù)為各小花均不結(jié)實(shí)的小穗數(shù)目；結(jié)實(shí)小穗數(shù)為每穗均結(jié)實(shí)的小穗數(shù)。其中，結(jié)實(shí)小穗數(shù)與不孕小穗數(shù)的和為有效小穗數(shù)。穗粒數(shù)和穗粒重為每個(gè)株系隨機(jī)選取15個(gè)單穗統(tǒng)計(jì)粒數(shù)并稱重，取平均值；千粒重為1 000粒籽粒質(zhì)量。經(jīng)濟(jì)系數(shù)為經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量與生物學(xué)產(chǎn)量的比值，其中，生物學(xué)產(chǎn)量為收獲晾干后未脫粒前的植株質(zhì)量，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量為脫粒后的籽粒質(zhì)量。

1.3 品質(zhì)性狀測(cè)定

用瑞典DA7200型近紅外品質(zhì)分析儀測(cè)定籽粒水分、粗蛋白和濕面筋含量及出粉率、吸水率、降落值、沉降值、硬度指數(shù)和容重共9個(gè)籽粒品質(zhì)性狀，每個(gè)樣本分別取約30 g，5次重復(fù)，在國家小麥改良中心西北分中心（銀川）進(jìn)行測(cè)定[24]。

1.4 分子標(biāo)記分析

基因組DNA提取采用CTAB法[25]。SSR和SRAP標(biāo)記均為已發(fā)表引物，其中能夠在群體中穩(wěn)定擴(kuò)增的47對(duì)SSR和25對(duì)SRAP（Me-與Em-組合）引物信息詳見表2，以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 SSR與SRAP引物編號(hào)及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers

表2 SSR與SRAP引物編號(hào)及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers 續(xù)表Continued

表2 SSR與SRAP引物編號(hào)及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers 續(xù)表Continued

PCR 反應(yīng)體系為 10 μL，包含 10×Reaction Buffer 2 μL，dNTPs (2.5 mmol·L-1) 0.8 μL，上、下游引物 (10 μmol·L-1) 各 0.2 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1) 0.1 μL，模板 DNA (50 ng·μL-1) 1 μL，ddH2O 5.7 μL。SSR 標(biāo)記的 PCR 程序?yàn)椋?4 ℃3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，34～40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。SRAP標(biāo)記的PCR 程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電壓為180 V，1.5 h左右，銀染后觀察拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010對(duì)分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，相同遷移位置上出現(xiàn)條帶記為“1”，無條帶記為“0”。用PopGen 32軟件計(jì)算各多態(tài)性引物的有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）、Nei’s多樣性指數(shù)（H）[26]。采用MEGA 5軟件中的非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（unweighted pair group method with arithmetic average，UPGMA）進(jìn)行聚類分析，繪制聚類圖[27]。多態(tài)性信息含量(PIC)[28]的計(jì)算公式如下。

式中，Pij表示標(biāo)記i的第j個(gè)帶型出現(xiàn)的頻率；PIC值的大小反映多態(tài)性的高低，PIC值最大為1，表示非常高的多態(tài)性；最小值為0，表示無多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品種資源農(nóng)藝與品質(zhì)性狀分析

對(duì)251份小麥品種資源的10個(gè)農(nóng)藝和9個(gè)品質(zhì)性狀進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。251份材料中蘊(yùn)含著豐富的遺傳變異。農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)為14.25%～41.77%，其中，分蘗數(shù)、穗粒重的變異系數(shù)較大，分別為41.77%、36.58%；小穗數(shù)、結(jié)實(shí)數(shù)的變異系數(shù)較小，分別為14.43%、14.25%。品質(zhì)性狀變異系數(shù)為2.24%～15.42%，其中，沉降值、降落值、濕面筋的變異系數(shù)較大，分別為15.42%、9.23%、9.15%；出粉率、容重的變異系數(shù)較小，分別為3.18%、2.24%?？傮w來看，農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)明顯高于品質(zhì)性狀的變異系數(shù)。

表3 251份小麥品種資源的農(nóng)藝性狀與品質(zhì)性狀Table 3 Agronomic traits and quality traits of 251 wheat cultivar resources

2.2 小麥品種資源遺傳多樣性分子標(biāo)記分析

2.2.1 SSR與SRAP標(biāo)記多態(tài)性引物篩選 選取提摩菲維小麥、中國春、蘇麥3號(hào)、甘育2號(hào)和寧春4號(hào)這5份農(nóng)藝性狀存在顯著差異（P＜0.05）的小麥品種用于引物的篩選，結(jié)果如表4所示。747對(duì)SSR引物共篩選出153對(duì)，多態(tài)性比例為20.48%，其中能夠在群體中穩(wěn)定擴(kuò)增的有47對(duì)；SRAP引物中，12條正向引物和64條反向引物相互組合共篩選出96對(duì)，多態(tài)性比例為12.73%，能夠在群體中穩(wěn)定擴(kuò)增的有25對(duì)。

表4 多態(tài)性引物篩選數(shù)目和比例Table 4 Number and proportion of polymorphism primer screening

2.2.2 SSR與SRAP標(biāo)記多態(tài)性信息量分析 利用能夠穩(wěn)定擴(kuò)增的45對(duì)SSR引物對(duì)251份小麥品種資源進(jìn)行多樣性分析，共檢測(cè)到234個(gè)等位變異，不同位點(diǎn)等位變異數(shù)為3～11，平均4.979。引物的有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）分別為1.103～1.772、0.089～0.429、0.181～0.618，平均值分別為 1.474、0.289、0.445，其中，引物XbarcM156的Ne、H、I均最大，分別為1.772、0.429、0.618；多態(tài)性信息量（PIC）為0.097～0.862，平均0.652，引物Xbarc78的PIC最大（表5）。

25對(duì)穩(wěn)定擴(kuò)增的SRAP引物在251份小麥品種資源中共檢測(cè)出342個(gè)等位變異，不同位點(diǎn)的等位變異數(shù)為6～21，平均13.680。SRAP引物的Ne、H、I分別為 1.152～1.734、0.125～0.403、0.235～0.584，平均值分別為 1.429、0.257、0.399，其中，Me5-Em62的Ne、H、I均最大，分別為1.734、0.403、0.584；PIC為0.651～0.932，均大于0.500，平均為0.826，屬于高多態(tài)性水平，引物組合Me7-Em44的PIC最大（表5）。

表5 251份小麥品種資源SSR與SRAP標(biāo)記多態(tài)性信息量Table 5 Polymorphic information of SSR and SRAP markers in 251 wheat cultivar resources 續(xù)表Continued

表5 251份小麥品種資源SSR與SRAP標(biāo)記多態(tài)性信息量Table 5 Polymorphic information of SSR and SRAP markers in 251 wheat cultivar resources 續(xù)表Continued

2.2.3 基于SSR與SRAP標(biāo)記的小麥品種資源聚類及農(nóng)藝品質(zhì)性狀分析 利用2種標(biāo)記共72對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)251份小麥品種資源進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。將251份材料分為4個(gè)類群，其中，類群Ⅰ包括100份材料（C129～C230），主要為北方春麥區(qū)品種，其株高適宜，以寧夏、甘肅春性品種居多，分別為45、31份，其中，2份河南品種及1份四川品種被聚在此類群中；類群Ⅱ包括39份材料（C145～C157），主要為華北地區(qū)和中原地區(qū)的冬性品種；類群Ⅲ包括81份材料（C99～C126），其株高偏低，主要是以江蘇省為代表的長江中下游地區(qū)的弱冬性品種；類群Ⅳ包括31份材料（C19～C26），主要為國內(nèi)外地方品種和人工合成種，其中，寧春20號(hào)、寧春21號(hào)、寧春35號(hào)為寧夏早期選育品種，這一類群的主要特點(diǎn)是株高較高，易倒伏，但品質(zhì)性狀優(yōu)異。

圖1 基于SSR和SRAP標(biāo)記的小麥品種資源聚類Fig. 1 Dendrogram based on SSR and SRAP marker of wheat cultivar resources

進(jìn)一步分析4個(gè)類群的農(nóng)藝與品質(zhì)性狀，結(jié)果（表6和7）表明，類群Ⅰ的穗長最長，結(jié)實(shí)數(shù)、穗粒數(shù)、穗粒重、千粒重、出粉率、容重、硬度指數(shù)均最高，水分含量最低；類群Ⅱ的分蘗數(shù)、降落值均最高；類群Ⅲ的株高最矮，經(jīng)濟(jì)系數(shù)最高；類群Ⅳ的穗下莖長、小穗數(shù)、粗蛋白含量、濕面筋含量、吸水率、沉降值均最高。對(duì)4個(gè)類群的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行差異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各類群間的農(nóng)藝與品質(zhì)性狀存在顯著或極顯著差異（P＜0.05和P＜0.01），尤其各個(gè)類群間在株高、穗下莖長、千粒重、粗蛋白含量上存在極顯著差異。

表6 4大類群的農(nóng)藝性狀Table 6 Agronomic traits of 4 groups

表7 4大類群的品質(zhì)性狀Table 7 Quality traits of 4 groups

3 討論

小麥新品種的培育對(duì)世界和我國糧食安全作出了重大貢獻(xiàn)。目前，大多育成品種所聚合的優(yōu)良基因位點(diǎn)較為相似，變異空間狹小，親緣關(guān)系較近，而且由于商業(yè)化育種，多數(shù)雜交組合的親本選配均圍繞高產(chǎn)品種，忽視了其他性狀，導(dǎo)致新培育的品種（系）間遺傳相似性不斷升高，品種資源的遺傳多樣性日趨狹窄[29-30]。拓寬小麥育成品種的遺傳多樣性迫在眉睫。研究表明，通過擴(kuò)大引種來源[31]；重視對(duì)古老地方品種與農(nóng)家品種中蘊(yùn)含的優(yōu)異性狀[32]；充分挖掘小麥野生近緣植物中蘊(yùn)藏的豐富基因源；加強(qiáng)對(duì)小麥野生近緣植物的保護(hù)力度以及利用遠(yuǎn)緣雜交將近緣種（屬）的優(yōu)異基因?qū)胄←湹却胧?duì)豐富小麥資源類型、拓寬遺傳基礎(chǔ)、創(chuàng)新品種資源具有重要現(xiàn)實(shí)意義[33]。本研究選取了251份小麥品種資源，有小麥近緣屬，如黑麥、大麥；有親緣種，如栽培一粒小麥、硬粒小麥、東方小麥等；有合成小麥，如‘小黑麥’‘小大麥’‘荊輝1號(hào)’等；還有國外小麥（‘素諾拉64’）及國內(nèi)不同麥區(qū)的農(nóng)家品種、地方品種及新育成品種，這些資源對(duì)于豐富寧夏小麥品種資源類型具有重要補(bǔ)充作用。

小麥遺傳多樣性的開發(fā)是改良現(xiàn)有品種的基礎(chǔ)。研究技術(shù)和手段對(duì)小麥遺傳多樣性評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性有很大影響。表型性狀屬于數(shù)量性狀，受栽培措施、生態(tài)環(huán)境等影響，存在一定的局限性；而分子標(biāo)記在基因水平上反映了不同品種資源之間的遺傳差異。已有大量研究利用不同類型分子標(biāo)記分析了小麥遺傳多樣性，但研究結(jié)果卻不盡相同[27,34-35]。本研究采用了SSR和SRAP標(biāo)記，這2種類型分子標(biāo)記具有一定的互補(bǔ)作用，其中SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組，主要表現(xiàn)為3～5個(gè)堿基的差異；SRAP標(biāo)記因個(gè)體品種開放閱讀框（open reading frames，ORF）序列長度差異不同，放大基因的開放閱讀框，與隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和ISSR相比，SRAP標(biāo)記表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和多態(tài)性[36]。本研究利用這2種標(biāo)記分別對(duì)251份小麥品種資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，其SSR標(biāo)記的多態(tài)性信息量與Abbasabad等[37]研究結(jié)果基本一致，但低于Salehi等[38]的研究結(jié)果；SRAP標(biāo)記多態(tài)性信息量顯著高于Hassan等[20]的研究結(jié)果，這可能由于供試材料在數(shù)目、類型和遺傳差異等不同所致。另外，本研究中2種標(biāo)記的多態(tài)性信息量基本保持一致，因此，結(jié)果具有一定的可靠性。

依靠科技發(fā)掘優(yōu)良基因?qū)υ耘嗥贩N進(jìn)行遺傳改良，是解決人類對(duì)糧食需求的根本途徑。本研究利用2種標(biāo)記將小麥品種資源聚為4個(gè)類群，其中類群Ⅳ具有豐富的遺傳多樣性，與其他類群間表現(xiàn)出明顯的遺傳差異，這與胡立芹等[39]和鄭軍等[40]研究結(jié)果基本一致，而與王鳳濤等[41]研究結(jié)果存在差異，可能是由于材料的數(shù)量、來源及標(biāo)記類型不同所致。對(duì)不同類群的農(nóng)藝與品質(zhì)性狀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，各類群間的農(nóng)藝與品質(zhì)性狀存在顯著或極顯著差異，其中類群Ⅰ的穗粒數(shù)、穗粒重、千粒重均最高，可作為小麥產(chǎn)量性狀改良的親本加以利用；類群Ⅳ大多為地方品種，其粗蛋白和濕面筋含量較高，可用于改良小麥品質(zhì)性狀。目前，寧夏審定的多數(shù)小麥品種與‘寧春4號(hào)’的親緣關(guān)系較近，遺傳背景日趨狹窄，嚴(yán)重限制了寧夏小麥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[42]。本研究中的251份小麥品種資源之間遺傳多樣性較豐富，結(jié)合聚類和農(nóng)藝、品質(zhì)性狀分析結(jié)果，可選用綜合性狀優(yōu)異且有一定遺傳差異的材料作為育種親本，對(duì)寧夏小麥品種改良和拓寬小麥遺傳多樣性具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。