陳軍， 李靜雯*， 王立光， 朱天地， 陳琛， 包奇軍， 歐巧明

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院啤酒大麥研究所，蘭州 730070）

大麥（barley）種植歷史悠久，具有耐旱、耐瘠薄、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特性[1]。大麥?zhǔn)瞧【粕a(chǎn)的主要原料，需求量大，每年我國(guó)需從國(guó)外進(jìn)口啤酒大麥200萬(wàn)t左右，占世界啤酒大麥用量的60%~70%[2]。籽粒蛋白含量是決定啤酒大麥商業(yè)品質(zhì)的重要因素，一般的啤酒大麥品種蛋白含量均高于釀酒標(biāo)準(zhǔn)，如何降低大麥籽粒蛋白含量成為研究者關(guān)注的一個(gè)重要科學(xué)問(wèn)題[3]。

目前，關(guān)于大麥籽粒蛋白含量的研究多集中于栽培措施的優(yōu)化、氮高效利用新品種的培育、調(diào)控籽粒蛋白含量的基因克隆等方面。Mascher等[4]認(rèn)為培育氮高效利用型大麥品種可降低大麥生產(chǎn)成本并提高大麥籽粒品質(zhì)。研究表明，適量施氮可有效提高大麥籽粒的蛋白質(zhì)含量[5-9]。隨著研究的深入，不同作物中與氮素利用有關(guān)的基因陸續(xù)被克隆，小麥TaNRT2.1、水稻OsNRT1.1a、西紅柿LeNRT2.3和大麥HvNRT2/3基因均與氮素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[10]。但是，施氮栽培一般會(huì)導(dǎo)致大麥籽粒蛋白含量偏高。目前，氮高效利用品種較少，克隆的基因也無(wú)法應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。醇溶蛋白作為大麥胚乳中主要的儲(chǔ)藏蛋白，但不承擔(dān)重要的生理功能，因此可以忍受較多的突變。研究表明，醇溶蛋白與麥芽品質(zhì)及啤酒渾濁度、泡沫形成、高級(jí)醇及酯的形成等息息相關(guān)。Jonassen等[3]發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)條件下的氮素營(yíng)養(yǎng)會(huì)影響成熟籽粒中不同醇溶蛋白組分的比例。因此，通過(guò)基因工程手段降低大麥籽粒中醇溶蛋白含量成為解決該問(wèn)題的突破點(diǎn)。

項(xiàng)目組前期采用RNAi成功抑制B-hordein合成，獲得醇溶蛋白含量較對(duì)照顯著降低的轉(zhuǎn)基因大麥穩(wěn)定株系[11]，而該材料的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)量、品質(zhì)、氮素利用特性等一系列科學(xué)問(wèn)題亟待解決。因此，本研究利用此穩(wěn)定遺傳的低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥為試驗(yàn)材料，以其受體為對(duì)照，探究氮肥施用量對(duì)其花后各營(yíng)養(yǎng)器官氮素積累、分布及轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，明確該低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥花后至籽粒形成過(guò)程中氮素的變化規(guī)律，為大麥氮素轉(zhuǎn)運(yùn)的生理機(jī)制及生產(chǎn)施肥實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試大麥為甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所創(chuàng)制的以‘Golden Promise’（GP）[11]為受體獲得的帶有hpt基因的RNAi B-hordein轉(zhuǎn)基因大麥純系穩(wěn)定株系（T），其醇溶蛋白含量較對(duì)照顯著降低，總蛋白含量降低1%~2%；以其受體‘Golden Promise’作為對(duì)照（CK）。2019—2020年將2種材料在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ脺厥疫M(jìn)行土培盆栽試驗(yàn)。供試土壤采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地，其基本理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)16.65 g·kg-1，全 氮 1.1 g·kg-1，堿 解 氮 88.95 mg·kg-1，有 效 磷19.6 mg·kg-1，速效鉀 206 mg·kg-1，pH 8.57。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分別設(shè)置 0（本底氮，N0）、160（低氮，N160）、230（正常施氮，N230）和300 mg N·kg-1土（高氮，N300）4個(gè)供氮水平，每處理3次重復(fù)，采用完全隨機(jī)排列。采用陶制花盆（有托盤）進(jìn)行土培盆栽試驗(yàn)，每桶裝土10 kg。供試肥料為尿素（N 46%）、磷酸二氫鉀（P2O552%、K2O 34%）和硫酸鉀（K2O 54%）。其中，氮肥分2次施入，70%作為基肥施用，30%在拔節(jié)期作為追肥施用；磷、鉀肥均作基肥施用；其他管理按常規(guī)要求實(shí)施。

1.3 試驗(yàn)方法

分別于揚(yáng)花期（flowering period，F(xiàn)P）、灌漿期（filling stage，F(xiàn)S）和成熟期（maturity period，MP）3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期采集植株地上部樣品，用蒸餾水潤(rùn)洗，吸水紙擦干，再按莖稈、葉、穗分開(kāi)，分別裝入信封袋內(nèi)置于烘箱105 ℃殺青30 min，于80 ℃烘至恒重，粉碎備用。

測(cè)定各營(yíng)養(yǎng)器官的干物質(zhì)量；采用KDY9820型定氮儀測(cè)定全氮含量；采用近紅外谷物分析儀（Foss Tecator，Infratec 1241，Grain Analyser v.3.40）測(cè)定籽粒蛋白含量；收獲時(shí)測(cè)定株高、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量，每重復(fù)測(cè)定10株。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 20.0進(jìn)行相關(guān)分析（Pearson分析法）和差異顯著性檢驗(yàn)（Duncan法）。按照以下公式計(jì)算氮素積累量（nitrogen accumulation，NA）、氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量（nitrogen transport，NT）、氮 素 轉(zhuǎn) 運(yùn) 率（nitrogen transfer rate，NTR）、氮 肥 生 產(chǎn) 效 率（nitrogen production efficiency，NGPE）、氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)穗的貢獻(xiàn) 率（contribution rate of nitrogen transfer to ear，CRNTE）、氮 肥 農(nóng) 學(xué) 效 率（nitrogen agronomic efficiency，NAE）、氮肥偏生產(chǎn)力（nitrogen partial productivity，NPP）、氮 肥 吸 收 利 用 率（nitrogen absorption and utilization rate，NAUR）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮量對(duì)轉(zhuǎn)基因大麥產(chǎn)量構(gòu)成及籽粒蛋白的影響

由表1可知，相同施氮量水平下，轉(zhuǎn)基因大麥的單株籽粒產(chǎn)量高于對(duì)照；株高和千粒重較對(duì)照顯著降低，有效穗數(shù)和每穗粒數(shù)較對(duì)照顯著增加。由此表明，轉(zhuǎn)基因大麥通過(guò)增加分蘗和有效穗數(shù)補(bǔ)償產(chǎn)量配給，實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的籽粒產(chǎn)量形成能力，與前期研究結(jié)果一致[11]。

表1 不同處理下大麥的產(chǎn)量構(gòu)成及籽粒產(chǎn)量Table 1 Yield composition and grain yield of barley in different treatments

由圖1可知，同一施氮量水平，轉(zhuǎn)基因大麥的地上部生物量顯著高于對(duì)照，且在揚(yáng)花期至灌漿期增幅較大，灌漿期至收獲期增幅減緩，說(shuō)明揚(yáng)花期至灌漿期是大麥干物質(zhì)積累的重要時(shí)期。各生育期轉(zhuǎn)基因大麥的地上部生物量均顯著高于對(duì)照，說(shuō)明該轉(zhuǎn)基因材料的氮素吸收利用效率高于對(duì)照。

圖1 不同生育期地上部生物量Fig. 1 Aboveground biomass in different growth periods

大麥籽粒蛋白含量隨施氮量增加而增加[12-13]。由圖2可知，相同施氮量水平下，轉(zhuǎn)基因大麥的籽粒蛋白含量顯著低于對(duì)照，較對(duì)照降低0.58%~2.40%；隨著施氮量增加，轉(zhuǎn)基因大麥和對(duì)照的籽粒蛋白含量均有所增加，說(shuō)明增施氮肥有利于提高大麥籽粒蛋白含量。

圖2 籽粒蛋白含量Fig. 2 Grain protein content

2.2 施氮量對(duì)轉(zhuǎn)基因大麥營(yíng)養(yǎng)器官的氮素吸收、積累與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

2.2.1 不同生育時(shí)期轉(zhuǎn)基因大麥植株的氮素含量 同一生育時(shí)期，大麥葉、莖稈的氮素含量隨施氮量增加而提高，且施氮量影響氮素的轉(zhuǎn)運(yùn)效率[14]；而隨生育進(jìn)程推進(jìn)，莖稈、葉中氮素含量逐漸降低，穗部氮素含量逐步升高[15]。由圖3可知，隨著施氮量的增加，對(duì)照穗中的氮素含量逐漸增加，而轉(zhuǎn)基因材料穗中的氮素含量先增加后降低，在N160處理最高；對(duì)照葉中的氮素含量先增加后降低，在N230處理最高，而轉(zhuǎn)基因材料在N300處理最高；對(duì)照莖稈中的氮素含量也先增加后降低，在N160處理最高，而轉(zhuǎn)基因材料在N300處理最高。轉(zhuǎn)基因大麥各營(yíng)養(yǎng)器官的氮素含量分布表現(xiàn)為：穗＞葉片＞莖稈，且在揚(yáng)花期穗中的氮素含量最高，說(shuō)明充足的花前氮素積累主要集中在穗部，為后期灌漿結(jié)實(shí)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖3 穗、葉和莖稈中氮素含量Fig. 3 Nitrogen contents of ear， leaf and stem

2.2.2 不同生育時(shí)期轉(zhuǎn)基因大麥植株的氮素積累量及占比 氮素在植株體內(nèi)的分配決定了氮素的再利用效率。由表2可知，同一施氮量水平下，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，轉(zhuǎn)基因材料穗的氮素積累量逐步增加；葉的氮素積累量逐漸降低；莖稈的氮素積累量先增加后降低。同一生育時(shí)期隨著施氮量的增加，轉(zhuǎn)基因材料穗的氮素積累量先增加后降低，在N230處理最高；葉的氮素積累量逐漸降低；莖稈的氮素積累量先降低后升高。各營(yíng)養(yǎng)器官的氮素積累量表現(xiàn)為：穗＞葉＞莖稈，說(shuō)明穗是氮素再分配的重要組織器官；而不同生育時(shí)期表現(xiàn)為：揚(yáng)花期＞灌漿期＞成熟期，說(shuō)明揚(yáng)花期是影響大麥氮素再利用的關(guān)鍵時(shí)期。

比較氮素積累比例結(jié)果（表2）表明，對(duì)于穗部，揚(yáng)花期為23.59%~44.00%，灌漿期為31.04%~69.99%，成熟期為36.50%~68.01%；對(duì)于葉片，揚(yáng)花期為35.00%~49.98%，灌漿期為8.21%~32.55%，成熟期為18.49%~32.67%；對(duì)于莖稈，揚(yáng)花期為20.94%~29.72%，灌漿期為21.00%~44.40%，成熟期為12.10%~34.08%。由此表明，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)和施氮量增加，各營(yíng)養(yǎng)器官的氮素積累占比發(fā)生變化，說(shuō)明施氮量會(huì)影響氮素在大麥各營(yíng)養(yǎng)器官的轉(zhuǎn)移和再分配，進(jìn)而調(diào)控大麥籽粒的形成及進(jìn)程。

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2.2.3 轉(zhuǎn)基因大麥的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)及利用 養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運(yùn)量和轉(zhuǎn)運(yùn)效率是表征營(yíng)養(yǎng)體養(yǎng)分向籽粒轉(zhuǎn)移量的重要指標(biāo)。植物利用氮主要涉及氮的吸收、同化、轉(zhuǎn)運(yùn)、循環(huán)和再活化。不同植物對(duì)氮素的利用效率不同，同一作物不同品種對(duì)氮素的利用效率也存在差異。由表3可知，轉(zhuǎn)基因材料營(yíng)養(yǎng)器官的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量、氮素轉(zhuǎn)運(yùn)率及氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)穗的貢獻(xiàn)率和氮轉(zhuǎn)移量在中氮水平下較高，在高氮水平下有所降低；而對(duì)照在高氮水平下較高。轉(zhuǎn)基因大麥氮肥農(nóng)學(xué)利用率、氮肥偏生產(chǎn)力均隨著施氮量的增加逐漸降低，即在低氮水平下較高。

表3 不同大麥營(yíng)養(yǎng)器官的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量、轉(zhuǎn)運(yùn)率、干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)量、轉(zhuǎn)運(yùn)率及氮肥農(nóng)學(xué)利用率和氮肥偏生產(chǎn)力Table 3 Nitrogen transfer rate， transfer rate， dry matter transfer rate， transfer rate， agronomic utilization rate of nitrogen fertilizer， partial productivity of nitrogen fertilizer in different barley vegetative organs

2.3 不同生育時(shí)期，轉(zhuǎn)基因大麥籽粒產(chǎn)量與各營(yíng)養(yǎng)器官氮素含量的相關(guān)性

花后氮素的同化和轉(zhuǎn)運(yùn)是氮素再利用效率高低的重要影響因子。由表4可知，植株穗、葉中的氮素含量與籽粒產(chǎn)量形成和氮利用效率關(guān)系密切，主要表現(xiàn)為籽粒產(chǎn)量與揚(yáng)花期穗的氮素含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.988；與灌漿期和成熟期穗氮素含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.836和0.890；與揚(yáng)花期、灌漿期葉氮素含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.900和0.866；與揚(yáng)花期、灌漿期莖稈氮素含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.923和0.908。隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，單株產(chǎn)量與各營(yíng)養(yǎng)器官氮素含量的相關(guān)性逐漸降低，說(shuō)明揚(yáng)花期是籽粒產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時(shí)期，且籽粒氮素來(lái)源更多依賴于前期地上部營(yíng)養(yǎng)體中的氮素轉(zhuǎn)移。

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3 討論

氮素是植物生長(zhǎng)必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，參與植物蛋白質(zhì)、氨基酸、酶、葉綠素等的生物合成。氮肥運(yùn)籌是作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培的重要內(nèi)容，研究各生育期根、莖、葉、穗中氮素積累、轉(zhuǎn)移和再分配對(duì)作物高產(chǎn)具有重要意義[16]。沈會(huì)權(quán)等[17]研究表明，施用氮肥可顯著提高不同時(shí)期葉和莖稈中的氮素含量及籽粒中的蛋白質(zhì)含量。蔡劍[18]研究表明啤酒大麥的花前植株氮素積累量和轉(zhuǎn)運(yùn)量均隨著施氮量的增加呈上升趨勢(shì)。如何降低氮肥投入、減輕作物對(duì)氮素依賴、提高作物的氮素利用效率、剖析作物的低氮耐受性機(jī)理成為植物營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。

植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中氮素的運(yùn)轉(zhuǎn)和利用主要經(jīng)歷3個(gè)階段：①種子萌發(fā)階段，儲(chǔ)藏的氮素活化為萌發(fā)提供能量；②揚(yáng)花期至灌漿期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，包括氮素的同化、分配及轉(zhuǎn)運(yùn)；③成熟期，植株逐漸衰老，根、莖稈和葉中的氮素回歸自然[19]?；ê笫呛坦阮愖魑镒蚜Ｐ纬傻年P(guān)鍵階段，大部分營(yíng)養(yǎng)器官的氮素和碳水化合物向籽粒轉(zhuǎn)移[20]。本研究中低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥揚(yáng)花期穗的氮素積累量較高，成為籽粒氮素的主要來(lái)源，且主要通過(guò)增加植株分蘗數(shù)、保證有效穗數(shù)來(lái)確保籽粒產(chǎn)量?；ê蟮氐耐娃D(zhuǎn)運(yùn)是氮素再利用效率高低的重要影響因子。小麥開(kāi)花期葉片、莖桿、穗及成熟期籽粒氮素積累量與籽粒產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)[21]。本研究也表明轉(zhuǎn)基因大麥穗、葉中較高的氮素積累和分配與籽粒產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。

養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運(yùn)量和轉(zhuǎn)運(yùn)效率是表征營(yíng)養(yǎng)體養(yǎng)分向籽粒轉(zhuǎn)移量的重要指標(biāo)。氮素在植株體內(nèi)的分配情況決定了氮素的再利用能力[22]。不同植物對(duì)氮素的利用效率不同，同一作物不同品種對(duì)氮素的利用效率也存在差異。左青松等[23]研究表明，在作物生長(zhǎng)后期土壤中的氮素被吸收耗盡，植株?duì)I養(yǎng)器官中的氮素最大化轉(zhuǎn)移給穗部以完成籽粒后熟，而葉和莖稈衰老凋零，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)氮素的高效利用。董桂春等[24]認(rèn)為作物根系吸收的氮素由莖稈逐漸流動(dòng)到葉和籽粒，各器官間氮素的同化和流動(dòng)影響籽粒氮素的積累，從而影響作物生育后期的氮素再利用效率，并最終影響籽粒產(chǎn)量。徐壽軍等[16]研究表明，隨著施氮量的增加大麥花后氮素積累率及其對(duì)籽粒的貢獻(xiàn)率均呈上升趨勢(shì)，而各器官氮素轉(zhuǎn)運(yùn)率及對(duì)籽粒的貢獻(xiàn)率呈下降趨勢(shì)，且高氮與低氮處理間差異顯著。本研究表明，低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥地上部的氮素積累量在不同生育期表現(xiàn)為：揚(yáng)花期＞灌漿期＞成熟期，且揚(yáng)花期氮素積累量較高，說(shuō)明充足的花前氮素積累為花后灌漿結(jié)實(shí)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)；從地上部植株氮素總積累量來(lái)看，轉(zhuǎn)基因材料在各氮素水平下的氮素總積累量均高于對(duì)照，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因材料的氮素吸收利用能力較強(qiáng)。

高潤(rùn)紅等[25]研究表明，氮利用率的提高主要是由于氮素吸收效率提高引起的。德木其格[26]認(rèn)為，在施氮量為180 kg·hm-2時(shí)大麥的氮素利用率達(dá)到峰值，其葉片和莖稈的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)率及其對(duì)籽粒貢獻(xiàn)率、氮肥生產(chǎn)效率、氮肥生理效率均隨著施氮量的增加呈先降低后升高趨勢(shì)，氮肥農(nóng)學(xué)效率和氮肥偏生產(chǎn)力呈降低趨勢(shì)。蘇丙華等[27]研究發(fā)現(xiàn)，小麥籽粒產(chǎn)量隨著施氮量的增加逐漸增加，而氮肥農(nóng)學(xué)利用率、氮肥生產(chǎn)效率和氮肥吸收效率均逐漸降低。張如標(biāo)等[28]研究顯示，增施氮肥雖可顯著提高大麥產(chǎn)量，但降低了氮肥偏生產(chǎn)力和氮肥農(nóng)學(xué)利用效率。張金燦等[15]研究表明，大麥的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)效率和氮肥生理利用率隨著施氮量的增大均表現(xiàn)為先增大后減小。本研究表明，隨著施氮量的增加，低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因大麥的氮肥農(nóng)學(xué)利用率和氮肥偏生產(chǎn)力均逐漸降低，在160 mg N·kg-1土?xí)r氮肥農(nóng)學(xué)利用率和氮肥偏生產(chǎn)力最高，分別為5.42%和11.74。