許嘉誠,張夢陽,陳翠萍,閆殿海,劉 洋*

(1 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,西寧 810016;2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試(西寧)分中心,西寧 810016;3 青海省農(nóng)林科學(xué)院,西寧 810016)

胡麻(Linum usitatissimumL.)又稱油用亞麻,為亞麻科亞麻屬一年生草本經(jīng)濟(jì)作物,是我國北方地區(qū)重要的油料作物。 胡麻籽粒富含多種生物活性物質(zhì),具有重要的食用價值和營養(yǎng)價值,廣泛應(yīng)用在天然健康產(chǎn)品中[1]。 據(jù)統(tǒng)計,2000—2017 年胡麻的單產(chǎn)水平穩(wěn)步提升,近十年的胡麻消費(fèi)量也保持年均11.8%的增長率,市場需求旺盛[2]。 對胡麻的分子研究國內(nèi)外均有報道,如Bickel 等[3]最早利用AFLP 和RAPD 進(jìn)行胡麻遺傳圖譜的構(gòu)建;李丹丹等[4]采用AFLP 分子標(biāo)記的方法,利用聚類分析將80 個胡麻品種(系)分為4 個種群,并分析了胡麻農(nóng)藝性狀、胡麻種群劃分、胡麻地理來源之間的相關(guān)性;李聞娟等[5]利用篩選的SRAP 引物對胡麻品種‘隴雜1 號’和‘隴雜2 號’進(jìn)行純度鑒定;郝榮楷等[6]利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記以及SRAP 分子標(biāo)記對96 個胡麻品種進(jìn)行了指紋圖譜的構(gòu)建與遺傳多樣性分析,并分析了核心種質(zhì)資源的表型變異[7-8]。 運(yùn)用SSR 分子標(biāo)記的胡麻研究始于對引物的篩選[9-11],之后潘根等[12]應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記分析了24 個胡麻品種,構(gòu)建了相關(guān)的指紋圖譜并進(jìn)行了遺傳分析,未來將有更多胡麻品種、更多引物位點的相關(guān)研究[13]。 目前,國內(nèi)已建立了初級核心種質(zhì)資源庫,但利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良胡麻的研究較少[14]。 因此,構(gòu)建胡麻DNA 指紋圖譜庫,對其新品種鑒定及種質(zhì)資源保護(hù)具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的研究前景。 本研究采用SSR 標(biāo)記技術(shù),利用篩選出的20 對多態(tài)性好的引物,對61 份胡麻材料構(gòu)建胡麻DNA 指紋圖譜,以期建立一套穩(wěn)定、快速、可靠的胡麻品種鑒定體系,為胡麻的品種鑒定和選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料

在青海省農(nóng)林科學(xué)院作物育種栽培研究所收集的200 多份胡麻種質(zhì)資源中,選取61 份材料作為本研究的試驗材料(表1)。

表1 試驗所用61 份胡麻材料Table 1 Sixty-one flax materials used in the experiment

1.1.2 試驗試劑

試驗試劑10 ×PCR buffer、TaqDNA 聚合酶、dNTPs 等均購于寶生物工程(大連)有限公司;試驗所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取

參照李榮華等[15]的方法提取胡麻DNA。 提取的DNA 樣品經(jīng)超微量紫外分光光度計檢測,判斷濃度以及純度是否符合試驗標(biāo)準(zhǔn),并于-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系為:總體積10 μL,DNA 75 ng,引物1.2 μmol∕L,10 × PCR buffer 1.2 μmol∕L,dNTPs 0.8 μmol∕L,TaqDNA 聚合酶0.2 μmol∕L,用ddH2O 補(bǔ)足。

擴(kuò)增程序為:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,循環(huán)9 次;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)29 次;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

加入10 μL Loading Buffer 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳后,經(jīng)銀染與顯影得到清晰條帶,進(jìn)行讀帶分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過讀帶分析記錄同一引物下的等位基因位點數(shù)。 在61 個DNA 樣本中同一等位基因位點上有明顯條帶的記作“1”,無明顯條帶則記作“0”,缺失樣本記作“.”,以此做出“0-1”矩陣型讀帶表。 利用Popgen 32 軟件分析讀帶表計算出多態(tài)性指數(shù)等,采用NTSYSpc 2.1 軟件進(jìn)行非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物的篩選與多態(tài)性分析

參考Cloutier 等[16]的分析數(shù)據(jù)并結(jié)合先前研究合成193 對引物。 挑選6 份不同來源的胡麻材料對引物進(jìn)行初篩,根據(jù)初篩結(jié)果(圖1)挑選條帶清晰、多態(tài)性好的引物;用所有的供試材料進(jìn)行復(fù)篩,最終篩選出構(gòu)建胡麻指紋圖譜的20 對核心引物(表2)。

圖1 多態(tài)性引物的篩選Fig.1 Screening of polymorphic primers

表2 20 對多態(tài)性SSR 引物序列信息Table 2 Sequence information of 20 pairs of polymorphic SSR primers

由表3 可知,篩選出的20 對多態(tài)性好的引物共擴(kuò)增出88 個等位基因位點,每個引物的等位基因數(shù)在2—12 個,有效等位基因數(shù)在1.431—6.547 個,其中引物L(fēng)u2796 的等位位點數(shù)最多(12 個),引物L(fēng)u3218、Lu2966、Lu2382 的等位位點數(shù)最少(2 個),其余引物的等位位點數(shù)為3—8 個。 多態(tài)信息含量(PIC)值在0.120—0.870,平均值為0.508,以引物L(fēng)u2796 最高,引物L(fēng)u3218 最低。 多樣性指數(shù)在0.822—2.015,平均值為1.458,最高為引物L(fēng)u2796,最低為引物L(fēng)u3218。 引物L(fēng)u2796 在有效等位基因數(shù)、等位位點數(shù)、多態(tài)信息含量和多樣性指數(shù)上均為最高。 不同引物擴(kuò)增條帶片段大小在200—450 bp。

表3 SSR 引物多樣性分析指標(biāo)Table 3 SSR primer diversity analysis indicators

2.2 遺傳多樣性分析

非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析(圖2)表明:61 份胡麻材料的遺傳相似系數(shù)在0.250—0.780;在遺傳相似系數(shù)為0.771 5 處可將61 份胡麻材料分為3 類:第一類包括‘內(nèi)亞5 號’、DEHISCINTK CREDITAN、莎車早熟種紅、雁雜10 號選系-1、‘隴亞六號’等38 個材料;第二類包括‘壩選三號’、‘壩亞九號’、‘壩亞11 號’、KENYAC 1709、Crista Fiber、PALA Blue 等15 個材料;第三類包括10446146、俄羅斯高桿亞麻、‘壩亞七號’、‘壩亞12 號’、慶陽老胡麻、兩當(dāng)胡麻、‘雁雜10 號’、‘壩亞一號’。 甘肅隴亞系列的‘隴亞1 號’、‘隴亞2 號’、隴亞六號’、‘隴亞10 號’、‘隴亞11 號’、‘隴亞13 號’油用亞麻材料聚類在一起,河北壩亞系列的‘壩亞三號’、‘壩亞九號’、‘壩亞11 號’、‘壩亞13 號’油用亞麻材料聚類在一起,由此也驗證了分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

圖2 61 份胡麻材料聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 61 flax materials

2.3 指紋圖譜構(gòu)建

由表4 可見,具有特征引物的材料共有19 個,其中‘隴亞10 號’、‘隴亞2 號’、晉亞5 號選系-2 有最多的特征引物(3 對),此類材料具有較高的特異性,易于鑒別。 莎車亞麻選系-1、‘寧亞6 號’、天水白和兩當(dāng)胡麻有2 對特征引物。 莎車早熟種紅、平羅紅、‘隴亞11 號’、‘隴亞13 號’、‘晉亞5 號’、‘匈牙利3號’、10446146、‘壩選三號’、CDC Bethune、阿里安、PALA Blue 和KENYAC 1709 各有1 對特征引物。 篩選出的20 對引物對樣品DNA 都具有良好的多態(tài)性,能將某一材料從其余60 份材料中篩選出來的特征引物共有13 對(Lu2580F、Lu2184、Lu2794、Lu2796、Lu2764、Lu2292、Lu2700、Lu2420、Lu2810、Lu2105、Lu2162、Lu2778、Lu2486),其中引物L(fēng)u2292 可一次區(qū)分6 份材料(‘隴亞10 號’、‘隴亞2 號’、晉亞5 號選系-2、‘寧亞6 號’、阿里安、KENYAC 1709)。 能將2—3 份材料從其他材料中篩出合并為一類的共有17 對引物,如Lu2796 可以將Crista Fibe 和PALA Blue 從其他材料中篩出組成一類,Lu2580F 可將‘晉亞5 號’與OTT7703*ARGCB*AR*C19 從其他材料中篩出組成一類。 利用2 對或2 對以上的引物構(gòu)建指紋圖譜可提高鑒別的準(zhǔn)確性,組合運(yùn)用這類引物可改進(jìn)鑒定過程,提高鑒定效率。

表4 61 份胡麻材料鑒別的引物組合Table 4 Primer combinations for identification of 61 flax materials

綜上,組合利用上述20 對多態(tài)性引物可將61 份胡麻材料DNA 完全鑒別。 第一步:利用Lu2105 將61 份胡麻材料DNA 分為十大類。 其中有兩大類各只有1 份材料(天水白、兩當(dāng)胡麻),第三大類為‘隴亞2 號’、晉亞5 號選系-2,第四大類為褐籽胡麻、范尼、CDC Bethune、KOREN,第五大類為‘壩選三號’、壩選三號選系-1、DEHISCINTK CREDITAN、低亞麻酸,第六大類為莎車早熟種紅選系-1、莎車早熟種紅選系-2、寧亞11 號選系-1,第七大類為莎車亞麻選系-1、平羅紅、F-13-1、F-13-3、F-13-3 選系-2、俄羅斯矮桿亞麻、東鄉(xiāng)白,第八大類包括慶陽老胡麻、F-13-4、雁雜10 號選系-1 等8 份材料,第九大類包括‘壩亞七號’、‘壩亞14 號’、F-13-5 等13 份材料,第十大類包括西禮白、‘隴亞1 號、‘壩亞11 號’等18 份材料。 第二步:利用Lu2700 在這幾大類中篩選,將‘隴亞10 號’、‘隴亞13 號’、俄羅斯高桿亞麻、‘隴亞11 號’、隴亞11 號選系-2、‘隴亞1 號’、‘內(nèi)亞5 號’等13 份材料從其他材料中分出。 第三步:組合其他引物將剩余材料篩選出來,如組合Lu2184 與Lu2486 將第九大類中的8 份材料全部鑒別出來。 對這20 對多態(tài)性引物在61 份材料中的擴(kuò)增結(jié)果,以十進(jìn)制數(shù)字0—9 進(jìn)行編碼,構(gòu)建61 份胡麻材料的DNA 指紋圖譜(表5),并根據(jù)《農(nóng)作物種子標(biāo)簽二維碼編碼規(guī)則》[17]中的二維碼設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行QR 碼的繪制(圖3)。

表5 61 份胡麻材料的DNA 指紋序列Table 5 DNA fingerprint sequences of 61 flax materials

圖3 部分胡麻材料的唯一QR 標(biāo)識碼Fig.3 Unique QR identification code of some flax materials

3 討論與結(jié)論

自Gorman 等[18]在1996 年首次利用分子標(biāo)記技術(shù)研究胡麻以來,應(yīng)用于胡麻的分子標(biāo)記研究不斷增加。 目前常用的分子標(biāo)記包括AFLP、RAPD、SSR 以及SNP。 Bickel 等[3]和李丹丹[4]對胡麻遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的研究采用的是AFLP、RAPD 和SRAP 標(biāo)記方法,但存在標(biāo)記數(shù)量少、對試驗樣品的DNA 質(zhì)量要求較高、試驗步驟復(fù)雜且穩(wěn)定性較差的問題,在如今的研究中,這三類標(biāo)記方法逐漸被取代[19];作為第三代分子標(biāo)記的SNP 分子標(biāo)記擁有穩(wěn)定性高、位點豐富、檢測快速、易于實現(xiàn)自動化分析等優(yōu)點,其高效的測序技術(shù)與易于實現(xiàn)的自動化分析對未來的遺傳圖譜構(gòu)建速度有著極大的提升作用[20-21],但不斷增加的分子標(biāo)記數(shù)量的成本問題及計算效率與技術(shù)限制的矛盾亟待解決,所以SNP 測序技術(shù)更適合于開發(fā)大量的、準(zhǔn)確的分子標(biāo)記。 而SSR 標(biāo)記技術(shù)具有高多態(tài)性、共顯性以及在基因組中豐度較高且操作簡便省時、成本低等諸多優(yōu)點,已用其建立了水稻、小麥、玉米等作物的分子遺傳圖譜[22-24],因此從降低成本、操作簡便等因素考慮,本試驗采用SSR 分子標(biāo)記的方法。

本研究利用20 對SSR 引物將61 份胡麻材料進(jìn)行遺傳多樣性分析,并構(gòu)建出61 份材料的指紋圖譜,繪制了胡麻材料的QR 標(biāo)識碼。 結(jié)果表明:相同選系材料,如莎車早熟種紅、莎車早熟種紅選系-1、莎車早熟種紅選系-2 分為一類,‘隴亞六號’、隴亞六號選系-1、隴亞六號選系-2 分為一類,但也出現(xiàn)了‘雁雜10號’與雁雜10 號選系-1 并未在同一類的情況,可能是自然突變或機(jī)械混雜導(dǎo)致的;甘肅隴亞品系分為一類,河北壩亞品系分為一類,表現(xiàn)出明顯的地域特征。 該結(jié)論與黃文功等[25]對7 個國家48 個亞麻品種ISSR 分析的結(jié)論相符,地理相近的品種在聚類分析中基本歸為一類。 因此,可通過聚類分析結(jié)果進(jìn)行胡麻育種中親本的選配,并根據(jù)育種目標(biāo)選育多態(tài)性更好的品種來豐富胡麻基因資源的多樣性。 本試驗篩選的20 對引物等位基因位點共有88 個,其中多態(tài)性等位基因位點有87 個,多態(tài)性比率為98.86%,高于潘根等[12](多態(tài)性比率25%)和黃文功等[25](多態(tài)性比率91.1%)的研究結(jié)果,說明本試驗篩選的20 對引物具有很高的多態(tài)性,可以廣泛應(yīng)用于胡麻的SSR 分析中。