葉湖 李曉芹 方志娟 金萍 鐘曉紅

摘要 ［目的］明確和優(yōu)化國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.32—2016中含油固體食品9種抗氧化劑的檢測(cè)方法。［方法］樣品用1～2倍體積石油醚浸泡4 h提取油脂，濾紙過(guò)濾后，濾液氮吹至石油醚揮發(fā)完全。浸提的油脂用乙腈直接提取，C18固相萃取柱凈化。采用Agilent Poroshell 120 SB-Aq色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm），以0.5%乙酸溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。［結(jié)果］9種抗氧化劑在18 min內(nèi)完全分離，有效縮短分析時(shí)間，且信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度增加。在薯片樣品中進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，20、40、100 mg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平，9種抗氧化劑的回收率為75.2%～104.7%，RSD均小于10%（n=6）。［結(jié)論］該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)周期短，適用于固體食品中抗氧化劑的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 含油固體食品；抗氧化劑；檢測(cè)方法；優(yōu)化

中圖分類號(hào) TS 207.3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）07-0193-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.044

Optimization of 9 Antioxidant Detection Methods in Oil-Containing Solid Foods

YE Hu， LI Xiao-qin， FANG Zhi-juan et al

（Suzhou Food Inspection and Testing Center，Suzhou，Jiangsu 215104）

Abstract ［Objective］To clarify and optimize the detection methods of 9 antioxidants in oil-containing solid foods in the national standard GB 5009.32-2016. ［Method］The sample was soaked in 1-2 times the volume of petroleum ether for 4 hours to extract the oil. After filtering with filter paper， the filtrate was blown with nitrogen until the petroleum ether was completely volatilized. The leached oil was directly extracted with acetonitrile and purified by C18 solid phase extraction column. An Agilent Poroshell 120 SB-Aq column （100 mm×3.0 mm， 2.7 μm） was used for gradient elution with 0.5% acetic acid solution-acetonitrile as the mobile phase. ［Result］The 9 antioxidants were completely separated within 18 minutes， which effectively shortened the analysis time and increased the signal response intensity. Method validation was carried out in potato chips samples， with three spiked levels of 20 mg/kg， 40 mg/kg and 100 mg/kg， the recoveries of 9 antioxidants were 75.2%-104.7%， RSD? were less than 10%（n=6）. ［Conclusion］The method has the advantages of simple operation， high accuracy and short detection period， and is suitable for the determination of antioxidants in solid food.

Key words Oil-containing solid foods;Antioxidants;Detection method;Optimization

基金項(xiàng)目 蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（SS202121）；江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（KJ21125028）。

作者簡(jiǎn)介 葉湖（1967—），男，江蘇蘇州人，高級(jí)工程師，從事食品檢驗(yàn)與質(zhì)量控制研究。

收稿日期 2022-09-23

食用油、焙烤食品、油炸面食品、熟制的堅(jiān)果與籽類等含不飽和脂肪酸的食品，容易受空氣、溫度、光照等因素的影響發(fā)生氧化酸敗，產(chǎn)生酮類、醛類和酸類物質(zhì)，出現(xiàn)異味，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低甚至對(duì)健康產(chǎn)生危害［1-2］。加入抗壞血酸棕櫚酸酯或酚類抗氧化劑等可以抑制油脂氧化，延緩酸敗，增加貨架期［3］。抗氧化劑如特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）、丁基羥基茴香醚（BHA）、沒食子酸丙酯（PG），過(guò)量攝入可能對(duì)人體造成健康風(fēng)險(xiǎn)，如腎損傷、致突變、致癌等［4-5］，生產(chǎn)過(guò)程中要避免出現(xiàn)使用過(guò)量的問(wèn)題。

GB 2760—2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［6］對(duì)抗氧化劑的使用進(jìn)行了明確規(guī)定，對(duì)于部分堅(jiān)果與籽類、糕點(diǎn)、油炸面制品、膨化食品等抗氧化劑的使用限量“以油脂中的含量計(jì)”［7］。目前，檢測(cè)食品中抗氧化劑需根據(jù)GB 5009.32—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測(cè)定》［8］。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)的前處理方法為固體食品直接稱樣后提取凈化，并未有“以油脂中的含量計(jì)”相關(guān)的例如“油脂提取”的步驟［9］，與判斷標(biāo)準(zhǔn)（GB 2760—2014）不一致。其余還存在二丁基羥基甲苯（BHT）回收率不高、檢驗(yàn)效率偏低等問(wèn)題［10-11］。含油固體食品在日常消費(fèi)中占很大部分，因此很有必要建立一套快速、準(zhǔn)確的抗氧化劑含量的檢測(cè)方法［12］。該研究從實(shí)際應(yīng)用角度，對(duì)含油固體食品中9種抗氧化劑檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步明確和優(yōu)化，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)室人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。

UPLC H-Class超高效液相色譜儀（沃特世）；N-EVAP型氮吹儀（Organomation）；Allegra X-30R高速冷凍離心機(jī)（貝克曼）；RiOs超純水儀（密理博）。

1.1.2 試材。

試驗(yàn)用到的樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?。乙腈（色譜級(jí)，默克），甲醇（分析純，國(guó)藥），30～60 ℃石油醚（分析純，國(guó)藥）；乙酸（色譜級(jí)，TCI）。C18固相萃取柱，2 g/12 mL（艾杰爾）。9種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：沒食子酸丙酯（PG，CAS121-79-9）、2，4，5-三羥基苯丁酮（THBP，CAS1421-63-2）、叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ，CAS1948-33-0）、去甲二氫愈創(chuàng)木酸（NDGA，CAS500-38-9）、叔丁基對(duì)羥基茴香醚（BHA，CAS25013-16-5）、2，6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚（Ionox-100，CAS88-26-6）、沒食子酸辛酯（OG，CAS1034-01-1）、2，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚（BHT，CAS128-37-0）、沒食子酸十二酯（DG，CAS1166-52-5），均為1 000 μg/mL，均購(gòu)自阿爾塔科技公司，4 ℃避光保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

（1）9種抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈定容，配制成100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，棕色儲(chǔ)液瓶存儲(chǔ)，4 ℃保存。

（2）9種抗氧化劑系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用乙腈稀釋得到2、5、10、50、100 μg/mL的校準(zhǔn)曲線溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 油脂浸提。

樣品粉碎后依據(jù)含油量取適量置于廣口瓶中，加入1～2倍體積30～60 ℃石油醚，充分混合后靜置浸提4 h，取石油醚層濾紙過(guò)濾，在40 ℃以下的水浴中氮吹至石油醚揮發(fā)完全，殘留油脂即為待測(cè)試樣。

1.2.3 提取、凈化。

加入5 mL乙腈，渦旋1 min充分混勻，8 000 r/min離心3 min，收集乙腈層于試管中，再重復(fù)使用5 mL乙腈提取，合并2次提取液。用5 mL甲醇活化C18固相萃取柱，再以5 mL乙腈平衡，棄去流出液。將所有提取液倒入柱中，棄去流出液，再以5 mL乙腈+甲醇的混合溶液（體積比2∶1）洗脫，收集所有洗脫液于試管中，40 ℃下氮吹至干，加1 mL乙腈定容，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，供液相色譜測(cè)定。

1.2.4 色譜條件。

色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-Aq，100 mm×3.0 mm，2.7 μm（安捷倫）。

柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，流速0.4 mL/min。流動(dòng)相為0.5%乙酸水（A）、乙腈（B）；梯度洗脫：0 min 10%B，9 min 75%B，10 min 95%B，13 min 95%B，14 min 10%B，18 min 10%B，共18 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件優(yōu)化

該研究擬在縮短分析時(shí)間的前提下，保證良好峰分離度，需選擇柱效更高的色譜柱。通過(guò)比較XBridge C18（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）、Poroshell 120 SB-Aq（2.7 μm，3.0 mm×100 mm）和Poroshell 120 SB-C18（2.7 μm，3.0 mm×100 mm）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用0.5%甲酸-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，SB-Aq能夠在更短的保留時(shí)間獲得9種抗氧化劑良好分離。

一般情況下，乙腈具有更強(qiáng)的洗脫性能。將流動(dòng)相甲醇更換為乙腈后，SB-Aq仍能獲得良好的分離度和峰型，且產(chǎn)生的柱壓較低。將0.5%甲酸更換為0.1%甲酸時(shí)，PG的峰型明顯變差，更換為0.5%乙酸后，整體響應(yīng)變強(qiáng)且分離度良好，能有效區(qū)分雜質(zhì)峰。因此，最終采用0.5%乙酸-乙腈作為流動(dòng)相。此外，因色譜柱粒徑小且采用梯度洗脫，為獲得良好峰型進(jìn)樣量不宜超過(guò)5 μL。所得色譜圖見圖1。

2.2 提取溶劑優(yōu)化

根據(jù)質(zhì)控樣回收結(jié)果，發(fā)現(xiàn)采用GB 5009.32—2016方法，雖通過(guò)3次重復(fù)提取，部分樣品BHT仍難以獲得滿意的回收率，回收率在20%～50%，難以準(zhǔn)確定量。乙腈飽和的正己烷溶液、正己烷飽和的乙腈溶液進(jìn)行提取是影響回收率的關(guān)鍵步驟。商軍等［13］在測(cè)定飼料中5種合成類抗氧化劑含量時(shí)，采用乙腈輔助超聲提取，得到的回收率均在70%以上。該研究在采用乙腈重復(fù)提取2次后，BHT回收率提高至70%以上，TBHQ回收率約85%，能夠滿足方法學(xué)要求。

2.3 浸提時(shí)間優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)固體類樣品要求是稱取1 g樣品，但在實(shí)際的應(yīng)用中，是要以油脂中的含量計(jì)算的。雖然可以結(jié)合營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽予以換算，但在提取油脂后再進(jìn)行檢測(cè)更符合數(shù)據(jù)的獨(dú)立性、真實(shí)性要求［7］。實(shí)際操作中可根據(jù)標(biāo)簽脂肪含量推算浸提所需樣品量。

浸提時(shí)間影響試驗(yàn)效率。該研究比較了浸提2、4、8和16 h后提取獲得的油脂量和對(duì)TBHQ結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)浸提時(shí)間越長(zhǎng)，提取到的油脂量越多，但對(duì)TBHQ的檢出值無(wú)明顯影響。考慮到檢驗(yàn)效率，選擇浸提4 h。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

按照“1.2.4”色譜條件對(duì)9種抗氧化劑系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以抗氧化劑的濃度作為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。結(jié)果表明，9種抗氧化劑在2～100 μg/mL線性關(guān)系良好（R2>0.99）。

分別在陰性薯片樣品中加入20、40和100 mg/kg 3個(gè)水平的抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)6次，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，其回收率和RSD結(jié)果見表2。結(jié)果表明，9種抗氧化劑的回收率為75.2%～104.7%，RSD均小于10%，滿足方法測(cè)定要求。

3 結(jié)論與討論

該研究通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相、色譜柱，縮短了9種抗氧化劑的分析時(shí)間至18 min。在18 min內(nèi)，9種抗氧化劑有效分離，峰型良好，響應(yīng)強(qiáng)度增加。明確了固體含油食品的油脂浸提步驟，加入1～2倍體積的石油醚提取4 h后氮吹至溶劑揮發(fā)完全。采用乙腈提取抗氧化劑，可明顯提高BHT的回收率。經(jīng)薯片樣品進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，9種抗氧化劑的回收率為75.2%～104.7%，RSD均小于10%，滿足方法測(cè)定要求。

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