羅路，陳夢(mèng)婷，陳映之，周俊杰，楊寶盈，馮娜

（五邑大學(xué) 生物科技與大健康學(xué)院，廣東 江門 529020）

白楊素（Chysin）是一種從紫葳科木蝴蝶種子里分離提純得到的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗焦慮、治療糖尿病以及抗癌等廣泛藥理作用[1-4]. 白楊素是性能良好的抗氧化劑，能有效清除自由基[5]. Vaya 等[6]通過(guò)對(duì)白楊素的研究發(fā)現(xiàn)白楊素在體外能夠清除AAPH 分解的陽(yáng)離子型自由基，還能減少銅離子的氧化. 白楊素及其衍生物具有抑菌、免疫調(diào)節(jié)等活性. Patel 等[7]采用丁基鏈與哌嗪、嗎啉和哌啶等取代合成的白楊素衍生物具有清除DPPH 和ABTS 自由基的能力，并且能抑制癌細(xì)胞的增殖. Zhu 等[8]合成的白楊素-β-D-吡喃半乳糖苷對(duì)H22 細(xì)胞系的活性抑制，和對(duì)羥基自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子的清除能力，以及對(duì)細(xì)菌和真菌的抑制作用均比白楊素強(qiáng).

近幾十年，已有很多學(xué)者開始將秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡(jiǎn)稱線蟲）作為宿主模型用于體內(nèi)病原微生物的毒力及致病機(jī)制的研究. 在線蟲中，天然免疫反應(yīng)一方面是通過(guò)釋放殺菌物質(zhì)直接殺死病原微生物；另一方面是通過(guò)觸發(fā)天然免疫信號(hào)通路，調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)生理平衡，保護(hù)自身免受病原微生物感染的危害. 最近的研究結(jié)果顯示，活性氧（reactive oxygen species，ROS）參與了上述兩方面[9]. ROS 是一類含有氧原子的自由基和非自由基的分子或離子化合物的總稱[10].Malhotra 等[11]發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)的ROS 水平與囊腫纖維化（CF）肺部疾病有關(guān)；Li 等[12]發(fā)現(xiàn)感染腸病毒71 型（EV71）會(huì)誘導(dǎo)不同細(xì)胞系的凋亡，同時(shí)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量ROS，而外源添加NAC 可降低EV71 感染細(xì)胞的凋亡和炎癥水平，減少EV71 的增殖，這些結(jié)果表明ROS 水平與機(jī)體的感染和恢復(fù)有關(guān).

白楊素及其衍生物的抗氧化活性及免疫調(diào)節(jié)作用提示其在抗菌方面具有有益作用，因此針對(duì)白楊素的衍生化有望為發(fā)展新型抗菌劑提供思路. 本文利用線蟲-病原菌感染模型對(duì)白楊素衍生物在天然免疫中的作用進(jìn)行探討，以期為了解動(dòng)物抗感染機(jī)制、開發(fā)新的抗感染策略提供幫助.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 線蟲株系和菌株

線蟲N2 (Bristol)、TJ356 zIs356 [daf-16p::daf-16a/b::GFP+rol-6(su1006)]、CF1553 muIs84 [(pAD76)sod-3p::GFP+rol-6(su1006)]和菌株E.coliOP50、E.faecalis均由蘭州大學(xué)支德娟老師惠贈(zèng)，菌株S.aureus、Proteus由五邑大學(xué)魏萍老師惠贈(zèng)，P.aeruginosaPA14 由云南大學(xué)鄒成鋼老師惠贈(zèng).

1.2 白楊素衍生物體外抗氧化活性檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[13]的方法對(duì) DPPH 自由基清除能力進(jìn)行檢測(cè). 吸取不同濃度的待測(cè)樣品100 μL 和0.1 mM DPPH 乙醇溶液100 μL 于96 孔板，搖勻，在室溫避光放置30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光值記為At；取不同濃度的待測(cè)樣品100 μL 和 100 μL H2O，測(cè)定其吸光值記為Ar；吸取100 μL DPPH 和100 μL H2O，測(cè)定其吸光值記為A0. 按以下公式計(jì)算DPPH 自由基清除率：

參考文獻(xiàn)[14]的方法對(duì)ORAC（總抗氧化能力）進(jìn)行檢測(cè)，在96 孔板中加入50 μL 待測(cè)樣品，加入50 μL 75 mM 的PBS 溶液代替樣品作為空白組，以及50 μL VE 溶液代替樣品作為標(biāo)準(zhǔn)組，避光加入100 μL FL 工作液，放入酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，吸收波長(zhǎng)535 nm），初始熒光值記為0F；37°C 溫育箱振蕩3 min 后繼續(xù)溫育10 min，迅速加入50 μL 153 mM 的AAPH 溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，放入酶標(biāo)儀檢測(cè)孔動(dòng)力學(xué)，檢測(cè)過(guò)程中每隔150 s 測(cè)定一次熒光值記為nF，直至熒光值衰減至直線.按以下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線和總抗氧化能力指數(shù)：

VE 的濃度作為X軸，NetAUCVE作為Y軸繪制Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線，將 NetAUCSample代入Trolox 的線性方程中進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以VE 的當(dāng)量mM 來(lái)表示，得到樣品的ORAC 值，即為樣品的總抗氧化能力指數(shù)，記為mM TE/g DW.

1.3 96 孔板法測(cè)定白楊素衍生物的抑菌率

參考文獻(xiàn)[15]的方法，將復(fù)蘇的菌株用MHB 培養(yǎng)基培養(yǎng)至F2 代菌，再用MHB 稀釋菌液得到與0.5 單位麥?zhǔn)媳葷嵋篛D610 相當(dāng)?shù)木海x為細(xì)菌濃度 1.5 ×108CFU/mL ，再用MHB 將菌液100×稀釋得到最終濃度 1.5 ×106CFU/mL 的菌懸液. 然后吸取50 μL 待測(cè)樣品、50 μL 菌懸液、50 μL MHB 于96 孔板，立刻置于多功能酶標(biāo)儀上在600nm條件下測(cè)定其吸光度，記為OD0，然后將96孔板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后在相同波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度，記為OD12.其中以MHB10×稀釋的DMSO 代替樣品作為陰性對(duì)照. 按以下公式計(jì)算抑菌率：

1.4 PA14 Killing 實(shí)驗(yàn)

PA14 Killing 實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[16]的方法設(shè)計(jì)，挑取30 條大小形態(tài)相似的不同處理的L4 期成蟲至PA14/NGM 板上，然后置于25°C 培養(yǎng)，每天對(duì)線蟲的存活進(jìn)行評(píng)定，將活著的線蟲轉(zhuǎn)移至新的PA14/NGM 板上，直到全部死亡為止，按以下公式對(duì)線蟲的存活率進(jìn)行計(jì)算：

1.5 線粒體活性氧檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[17]的方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將不同處理的 L4 期線蟲用 M9 緩沖液洗 3 次，再用終濃度1 μM MitoSOXTMRed 于20°C染色20 min，然后用M9 緩沖液洗3 次后加入適量 NaN3麻痹線蟲，用瓊脂糖進(jìn)行封片，于BX63 生物熒光顯微鏡（正置）下選擇RFP 模式進(jìn)行觀察，并攝取圖片，用ImageJ量化分析.

1.6 熒光定量PCR

按照總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書[18]提取不同處理的線蟲RNA，然后配制Master Mix 混合RNA樣品在PCR 混合儀上分別進(jìn)行Step1（42°C ，2 min）和Step2（85°C ，5 s）兩步反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的cDNA，然后將Mix 和cDNA 樣品溶液混合，置于PCR 擴(kuò)增儀上，程序如下：

Stage 1：預(yù)變性（95°C ，30 s）

Stage 2：PCR 反應(yīng)40 Cycles（95°C ，3 s；60°C ，30 s）

1.7 突變株線蟲轉(zhuǎn)基因熒光可視化及熒光定量分析

本文使用TJ356 和CF1553 兩種突變株線蟲分別進(jìn)行DAF-16 核定位實(shí)驗(yàn)和SOD-3 蛋白表達(dá)分析. 實(shí)驗(yàn)步驟如下：將不同處理的L4 期線蟲用M9 緩沖液洗3 次后加入適量 NaN3麻痹線蟲，用瓊脂糖進(jìn)行封片，于BX63 生物熒光顯微鏡（正置）下選擇GFP 模式進(jìn)行觀察，并攝取圖片，用ImageJ量化分析.

2 結(jié)果分析

2.1 白楊素衍生物能有效清除自由基

體外測(cè)定抗氧化活性實(shí)驗(yàn)具有高效、簡(jiǎn)便、快捷等優(yōu)點(diǎn)[19]，適用于大量化合物的篩選. 對(duì)圖 1所示的白楊素及13 種白楊素衍生物（a -m）的抗氧化活性進(jìn)行研究，分別采用DPPH 法和ORAC法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表1 所示：對(duì)照VC 對(duì)0.1 mM DPPH 自由基的IC50為12.47±0.78μM ，而白楊素及其衍生物對(duì)DPPH 自由基的IC50都比VC 的高（p＜0.001），這表明，白楊素衍生物對(duì)DPPH 自由基的清除能力相對(duì)較弱；其中衍生物h 對(duì)0.1 mM DPPH 自由基的IC50值最小，衍生物c 的最大.

圖1 白楊素及其衍生物（a-m）結(jié)構(gòu)式

表1 白楊素及其衍生物（a-m）對(duì)0.1 mM DPPH 自由基的IC50 值

體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示：白楊素及其衍生物的總抗氧化能力指數(shù)均低于VC(55.47±4.84) mM TE/g DW，p＜0.001）；50 μM 衍生物h 表現(xiàn)出與白楊素相當(dāng)?shù)目寡趸芰?；衍生物h（4-甲氧基芐溴白楊素醚）的總抗氧化能力指數(shù)最高(28.79 ±3.75)mM TE/g DW ），比相同濃度下白楊素的總抗氧化能力指數(shù)(23.10 ±6.40) mM TE/g DW）高24.63%；其余12 種白楊素衍生物總抗氧化能力指數(shù)均比白楊素低（p＜0.001）.

圖2 白楊素及其衍生物（a-m）的總抗氧化能力指數(shù)

2.2 白楊素衍生物 h 能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但殺菌能力較弱

研究表明，白楊素具有良好的抑菌活性[8]，為了評(píng)價(jià)白楊素衍生物h 的抑菌活性，分別檢測(cè)了100、200、400 μM 衍生物h 對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、普通變形桿菌（Proteus）和銅綠假單胞菌PA14（Pseudomonas aeruginosaPA14）的體外抑菌效果，結(jié)果如圖3 所示（圖中所有數(shù)據(jù)均為（平均值±SEM））：1）圖3-a 和3-c 中，400 μM 衍生物h 對(duì)金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌的抑菌率分別為（76.32 ±11.16）%、（72.95 ±11.56）%，均大于70%，說(shuō)明高濃度衍生物h 能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；而中低濃度衍生物h 對(duì)金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌均沒(méi)有明顯的抑制作用. 2）圖3-b 和3-d 中，不同濃度衍生物h 對(duì)糞腸球菌和銅綠假單胞菌PA14 的抑菌率均小于70%，表明衍生物h 不具有抑制糞腸球菌和銅綠假單胞菌PA14 生長(zhǎng)的作用.

圖3 白楊素衍生物h 對(duì)不同細(xì)菌的抑制率

圖4 白楊素衍生物h 對(duì)PA14 感染后線蟲存活率的影響

體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，衍生物h 對(duì)糞腸球菌和銅綠假單胞菌PA14 沒(méi)有明顯的活性抑制，鑒于它的抗氧化活性，我們推測(cè)衍生物h 可能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)途徑來(lái)增強(qiáng)宿主的抗感染能力.

2.3 白楊素衍生物h 延長(zhǎng)了PA14 感染后線蟲的壽命

研究表明，銅綠假單胞菌PA14 可以感染線蟲，該病原—宿主模型廣泛用于研究宿主天然免疫與細(xì)菌感染的關(guān)系. PA14 感染后的線蟲分別用10 μM 和50 μM 衍生物h 處理或不處理，其存活情況如圖 4所示（圖中所有數(shù)據(jù)均表示為（平均值 ±SEM），使用t檢驗(yàn)計(jì)算p值，*p＜0.01，**p＜0.001，ns 無(wú)顯著性差異）：在感染PA14 的情況下，未處理組線蟲平均生存時(shí)間為(2.00 ± 0.14) d ；10 μM 衍生物h 處理組線蟲平均生存時(shí)間為(2.13 ± 0.17) d ，比未處理組線蟲壽命延長(zhǎng)了6.50%（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ns）；50 μM衍生物h 處理組線蟲平均生存時(shí)間為(2.44 ± 0.05) d ，比未處理組線蟲壽命延長(zhǎng)了22.00%（p＜0.001）. 該結(jié)果表明，10 μM 衍生物h 不能顯著延長(zhǎng)PA14感染線蟲的壽命，而50 μM 衍生物h 處理后，顯著提高PA14 感染線蟲的壽命.

2.4 白楊素衍生物h 部分恢復(fù)PA14 感染導(dǎo)致的線粒體活性氧水平的降低

ORAC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白楊素衍生物h具有一定的抗氧化活性，已有研究表明宿主體內(nèi)的ROS 水平對(duì)宿主抵御細(xì)菌感染的能力有影響[20]. 本文檢測(cè)了衍生物h對(duì)PA14 感染后線蟲體內(nèi)MitoROS 水平的影響，結(jié)果如圖5 所示（圖中所有數(shù)據(jù)均為（平均值 ±SEM），使用t檢驗(yàn)計(jì)算p值，與N2 比較，##p＜0.001；與N2/PA14 比較，p＜0.01）.

圖5 白楊素衍生物h 對(duì)PA14 感染后N2 線蟲線粒體活性氧水平的影響

如圖5-b 所示：與未處理N2 組相比，50 μM 衍生物h處理后線蟲ROS 水平顯著降低（p＜0.001），PA14 感染組的線蟲ROS 水平也顯著降低（p＜0.001），PA14 感染后的線蟲經(jīng)50 μM 衍生物h處理后ROS 水平與PA14 感染組相比顯著上調(diào)（p＜0.001），部分恢復(fù)了PA14 感染導(dǎo)致的ROS 降低. 有研究表明，銅綠假單胞菌有規(guī)避先天免疫防御的能力，它通過(guò)清除中性粒細(xì)胞來(lái)規(guī)避先天免疫反應(yīng)中ROS 的產(chǎn)生[21]. 在本文中，衍生物h能降低宿主的ROS 水平，這說(shuō)明衍生物h具有抗氧化活性，與體外的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；而PA14 感染后線蟲的ROS 水平進(jìn)一步降低，給藥處理后ROS 水平顯著回升，這可能是衍生物h對(duì)宿主的ROS 水平具有調(diào)節(jié)作用，ROS 作為信號(hào)分子誘導(dǎo)了宿主免疫反應(yīng)，調(diào)動(dòng)下游效應(yīng)因子增強(qiáng)宿主抵御PA14 感染的能力.

2.5 白楊素衍生物h 上調(diào)PA14 感染后線蟲的免疫相關(guān)基因

DAF-16/FOXO 信號(hào)通路參與介導(dǎo)線蟲的先天免疫應(yīng)答，DAF-16 核轉(zhuǎn)位啟動(dòng)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，以防御病原體感染并延長(zhǎng)線蟲的壽命[22]. 金屬硫蛋白同系物mtl- 1和線粒體超氧化物歧化酶基因sod- 3作為DAF-16 的下游基因，參與調(diào)節(jié)宿主的免疫功能[23].

為了進(jìn)一步研究白楊素衍生物h在線蟲體內(nèi)發(fā)揮抗感染作用的機(jī)制，對(duì)線蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因（sod- 1、sod- 2、sod- 3、sod- 4、sod- 5）與抗菌相關(guān)基因（mtl- 1）的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，分析衍生物h對(duì)線蟲體內(nèi)DAF-16 及其下游靶基因的影響，結(jié)果如圖6 所示（圖中所有數(shù)據(jù)均為（平均值 ±SEM），使用t檢驗(yàn)計(jì)算p值，與空白組比較，#p＜0.01，##p＜0.001；與PA14 組比較，p＜0.01，p＜0.001）.

圖6 白楊素衍生物h 對(duì)PA14 感染后線蟲免疫相關(guān)基因、DAF-16 核轉(zhuǎn)位和SOD-3 蛋白表達(dá)量的影響

如圖6-a 所示，與陽(yáng)性對(duì)照N2/PA14 組相比，50 μM 衍生物h處理后線蟲的daf- 16（p＜0.001）、sod- 1（p＜0.001）、sod- 2（p＜0.01）、sod-3（p＜0.001）、sod- 4（p＜0.001）、sod-5（p＜0.001）、mtl- 1（p＜0.001）的mRNA 水平上調(diào)，說(shuō)明衍生物h 通過(guò)上調(diào)抗氧化相關(guān)基因（sod- 1、sod- 2、sod- 3、sod- 4、sod- 5）和抗菌相關(guān)基因（mtl- 1）的表達(dá)量發(fā)揮抗PA14的作用.

線蟲中 DAF-16 在抗應(yīng)激方面起重要的作用，上游激酶的失活導(dǎo)致DAF-16 從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核移位[24]. 因此，我們?cè)贒AF-16::GFP 標(biāo)記的突變株線蟲TJ356 上分析衍生物h對(duì)轉(zhuǎn)錄因子 DAF-16 核轉(zhuǎn)位的影響.圖6-b 是線蟲DAF-16 熒光圖像；圖6-c 是對(duì)不同處理的線蟲DAF-16 核轉(zhuǎn)位的量化，對(duì)照TJ356 組，DAF-16發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)的線蟲占比3.85%；PA14感染后發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)的線蟲占比59.41%，比對(duì)照TJ356 組高14.43 倍（p＜0.001）；經(jīng)50 μM 衍生物h處理后發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)的線蟲占比71.43%，發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)的線蟲比PA14組高20.23%（p＜0.01）. 說(shuō)明衍生物h能促進(jìn)DAF-16 從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位，在抗感染的過(guò)程中通過(guò)激活DAF-16 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮積極作用.

DAF-16 調(diào)節(jié)的抗氧化酶SOD-3和CTL-2 通過(guò)保護(hù)線蟲的腸道細(xì)胞在感染期間免受ROS 的影響而促進(jìn)免疫[21]，SOD-3 是DAF-16 的下游蛋白之一. 因此，我們使用SOD-3::GFP標(biāo)記的突變株線蟲CF1553 分析衍生物h對(duì) SOD-3 蛋白表達(dá)的影響. 圖6-d 是不同處理線蟲SOD-3 熒光圖像，其熒光量化結(jié)果如圖6-e 所示，PA14 感染激活了線蟲體內(nèi)的天然免疫系統(tǒng)，與對(duì)照組 CF1553 相比，PA14/CF1553 組線蟲SOD-3 表達(dá)量上調(diào)2.74%（p＜0.01）；經(jīng)50 μM 衍生物h處理后，線蟲的天然免疫增強(qiáng)，與PA14/CF1553 組相比，SOD-3 表達(dá)量上調(diào)1.80%（p＜0.01），說(shuō)明衍生物h可以上調(diào)線蟲SOD-3 水平.

3 結(jié)論

白楊素衍生物h具有抗氧化活性，并且能夠延長(zhǎng)銅綠假單胞菌 PA14 感染的線蟲壽命（p＜0.001），說(shuō)明衍生物h具有抗感染活性. 衍生物h處理顯著上調(diào)了PA14 感染后宿主ROS 水平和daf-16、sod-1、sod-2、sod-3、sod-4、sod-5、mtl- 1免疫相關(guān)基因的mRNA，這表明，ROS 作為信號(hào)分子通過(guò)促進(jìn)下游效應(yīng)因子表達(dá)從而激活其他信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)自身免疫反應(yīng)，保護(hù)宿主抵御PA14 感染. 綜上，白楊素衍生物h通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子DAF-16 并調(diào)控下游免疫相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗感染作用，機(jī)制如圖7 所示.

圖7 白楊素衍生物h 抗感染作用機(jī)制圖