趙磊 張春蘭

摘? ? 要：為發(fā)現(xiàn)山西省大型真菌新成員，通過隨機踏查，對山西省北部地區(qū)林區(qū)的大型真菌進行調查，采集了481份樣本，在經典形態(tài)分類鑒定的基礎上，采用分子生物學的方法（ITS1/ ITS4? 2個保守基因片段）進行輔助驗證鑒定，利用最大似然法構建其分子系統(tǒng)學關系，采用多相分類法進行物種綜合鑒定。結果表明：結合形態(tài)學、分子生物學鑒定，發(fā)現(xiàn)2個新紀錄種，分別為毛緣菇Ripartites tricholoma和空柄假香蘑Notholepista fistulosa。研究結果增補了采自山西省毛緣菇屬和假香蘑屬的2個大型真菌新紀錄種，提供了2個新紀錄種的詳細宏觀描述、顯微特征描述和野外生態(tài)信息，對山西省大型真菌名錄是較好的補充，為相關物種的鑒定、資源開發(fā)與利用以及生物地理學的研究提供參考數(shù)據(jù)。

關鍵詞：毛緣菇；空柄假香蘑；分子系統(tǒng)學

中圖分類號：Q19? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.05.014

Abstract： In order to discover new members of macrofungi in Shanxi Province， a random survey was conducted to investigate the macrofungi in the northern forest region of Shanxi Province and 481 samples were collected. Based on the classical morphological classification and identification， molecular biological methods （ITS1/ITS4 conservative gene segments） were used for auxiliary verification and identification. The maximum likelihood method was used to construct their molecular phylogenetic relationships and the heterogeneous classification method was used for comprehensive species identification. The results showed that combining morphological and molecular biological identification， two new recorded species were found， namely， Ripartites tricholoma and Notholepista fistulosa. The results of the study supplement two new recorded species of macrofungi collected from the genera Ripartites and Notholepista in Shanxi Province， providing detailed macroscopic descriptions， microscopic characterization and field ecological information of the two new recorded species， which is a good supplement to the list of macrofungi in Shanxi Province and provides reference data for the identification of related species， resource development and utilization and biogeographical research.

Key words： Ripartites tricholoma; Notholepista fistulosa; molecular systematics

中國是世界上重要的生物多樣性研究熱點地區(qū)之一，具有豐富的物種多樣性。我國地理結構和地貌特征比較復雜，并且地區(qū)間氣候因素差異較大，導致在生物物種演化進程中具有特殊地位。山西省位于黃土高原東部，由于其特殊的生態(tài)區(qū)位和自然地理特征，自然生態(tài)系統(tǒng)的保護與恢復工作顯得尤為重要[1]。為了改善生態(tài)環(huán)境，山西省近年來，在防沙治理工程、平原綠化工程、三北防護林工程、太行山綠化工程等提高森林覆蓋率和保護森林生態(tài)學等方面開展著卓有成效的工作。生物多樣性是維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要要素，其中真菌作為分解者，已成為地球上生物多樣性組成與生態(tài)系統(tǒng)構建中的重要成員。明確區(qū)域性的大型真菌物種多樣性組成，對區(qū)域性的生態(tài)保護具有科學的指導意義。

毛緣菇屬（Ripartites P. Karst.）最早由P. Karsten 在1879年建立，該屬的模式種為毛緣菇Ripartites tricholoma（Alb. & Schwein.） P. Karst.[2]。該屬在北半球分布廣泛，index fungorum記錄該屬17條信息，經過核準后該種已知物種數(shù)為9個。2008年出版的第十版《菌物字典》記錄該屬隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、傘菌目（Agaricales）、口蘑科[3]，但最新分類系統(tǒng)將該屬歸入分類位置未定類群（Incertae sedis）（擔子菌門、傘菌綱、傘菌目）[4]。假香蘑屬Notholepista為Vizzini等人于2012年建立的屬，該屬歸入擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、分類位置未定類群[5]，目前該屬僅有2個物種。傳統(tǒng)物種鑒定主要采用形態(tài)鑒定方法[6]，該方法目前依然是現(xiàn)代分類學的主要方法，但隨著越來越多的物種被發(fā)現(xiàn)，很多隱形種、復合種難以被識別[7]。

自1990年后，分子系統(tǒng)學方法，在真菌分類學與系統(tǒng)學的研究上得到了廣泛應用，對大型真菌多個類群系統(tǒng)學研究的快速發(fā)展起到重要的推動作用。Breitenbach等[8]在1991年，開展“門”水平的高級分類單元的框架系統(tǒng)研究。隨著分子生物學方法的廣泛應用，其在大型真菌分類領域也得到了普遍應用，多基因譜系一致性系統(tǒng)發(fā)育學物種識別方法出現(xiàn)以后，使其得到了更好的應用。該方法的建立為屬內種間形態(tài)證據(jù)少的類群提供了新方法和思路。近些年，多基因譜系一致性的系統(tǒng)發(fā)育學物種識別法在大型真菌分類和生物地理學領域得到了較好的應用和發(fā)展。系統(tǒng)發(fā)育分析是研究物種進化和系統(tǒng)分類的一種常用方法，構建系統(tǒng)發(fā)育樹是研究的核心。

本研究通過隨機踏查，采集山西省蘆芽山自然保護區(qū)大型真菌樣本400余份，利用經典分類學方法，結合多基因譜系一致性的方法進行物種鑒定，發(fā)現(xiàn)了2種山西省新紀錄大型真菌。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究的全部材料均為2022年采自山西省北部多個林區(qū)的大型真菌樣本，共計481份。其中主要采集樣本的林型為針葉林、針闊混交林和闊葉林。樣本均保藏于長春大學標本研究室。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本調查 樣本采集采用隨機踏查法

1.2.2 樣本采集與處理 樣本野外生態(tài)信息獲取采用直接觀察記錄。主要設備：單反相機（佳能有限公司，80D）、三腳架（廣東富圖寶工業(yè)有限公司，X-Aircross mini）、干燥器（長虹電器股份有限公司，CKX-H310）；其他采集用工具：標本整理盒、刀、小刷子、接種鑷子、尺子、反光板等；標本存放工具為：標本盒，茶葉袋，自封袋。

1.2.3 形態(tài)學研究 標本處于野外生長狀態(tài)時，在自然狀態(tài)下對標本進行詳細的記錄。其中包括：準確記錄標本的采集地、采集時間及樣本發(fā)生的生境及拍照后的照片編號等相關信息。找到適合反應標本特征角度的位置放置背板，使用相機的手動擋調整拍照參數(shù)進行拍照。記錄菌蓋不同生長狀態(tài)的形狀、顏色、變色情況、是否有條紋、是否有絨毛（若有記錄絨毛顏色及形態(tài)）、水漬狀情況、菌蓋邊緣特征；菌褶形狀、褶幅大小、顏色、著生方式、疏密程度、菌褶附屬物及特征、是否有缺口及其他特征；菌柄從幼時至成熟的形狀、顏色、表面的狀態(tài)、是否有條紋，是否扭曲，頂部與基部是否特殊、實心還是空心；將成熟擔子果切開，取一塊菌肉，記錄氣味與味道。典型顏色反應采用5%KOH、梅氏試劑、棉藍染液、1%剛果紅染液等進行。孢子大小測量使用隨機選取20個孢子測定其正面觀計算其均值。形態(tài)觀察所用設備：顯微鏡（奧林巴斯株式會社，BX53）、成像系統(tǒng)（奧林巴斯株式會社，DP80）；切片制作工具：剃須刀片、鑷子等；浮載劑：5％KOH；染色劑：1％剛果紅、梅氏試劑等[9-11]。

1.2.4 分子生物學研究 基因組DNA提取采用改良CTAB法，分子生物學輔助鑒定使用基因片段為 ITS 序列（internal transcribed spacer，ITS1/ ITS4），ITS1/ ITS4引物使用通用引物，PCR反應體系為25 μL通用體系。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳程序為110 V，55 min。擴增片段由華大基因（北京）公司進行一代測序，將獲得的序列提交GenBank。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育關系研究 將測序成功序列的峰圖文件進行分析，而后將其導入Geneious（測序公司在線自助拼接軟件），進行在線自主拼接，然后將其保存為fasta格式文件。所得序列在網站NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行blast比對，其參數(shù)默認，結合片段所屬菌株的形態(tài)特征確保所得基因片段非污染條帶，然后再經tblastp處理，參數(shù)默認，從而進一步來驗證所得片段的準確性。對于測序有問題或不成功序列以及比對后與形態(tài)鑒定相差較遠的序列，判定為污染序列，進行剔除并重新測序。系統(tǒng)發(fā)育關系構建選用序列為GenBank下載，具體序列信息見表1。序列比對使用MAFFT 7.0，用ModelFinder進行模型選擇，最大似然法分析（Maximum Likelihood，ML）構建系統(tǒng)發(fā)育關系，用自舉法對ML樹進行評估，自舉值為1 000 bootstrap，用Figtree v1.4軟件對進化樹進行后續(xù)處理。

2 結果與分析

2.1 物種鑒定

2.1.1 毛緣菇Ripartites tricholoma Ripartites P. Karst. 子實體中等大小，菌蓋直徑2～6 cm，凸鏡形，菌蓋中央略凹陷，菌蓋邊緣近波狀或毛刺狀附屬物，未成熟時蓋緣內卷，成熟后蓋緣平展，菌蓋表層具有明顯的絨毛狀附屬物，由中央淺褐色，向四周呈灰白色，干。菌褶直生至延生，褶幅略寬，灰白色至淡肉桂色。菌柄3～6 cm×0.5 cm，空，灰白色至淡肉桂色。孢子橢圓形至近圓形，淡棕色，表面粗糙，5.0～8.5 μm×4.0～5.5 μm。擔子棒狀，4擔孢子。菌褶菌髓菌絲無色，薄壁，菌絲寬6～11 μm，不明顯的鎖狀聯(lián)合。蓋皮菌絲呈匍匐狀。菌肉菌絲鎖狀聯(lián)合明顯。菌柄菌絲鎖狀聯(lián)合明顯。子實體的生態(tài)照片及顯微特征手繪圖見圖1。

生境：單生或散生于針葉林地上。

分布：瑞士[4]、中國吉林省[4]、中國山西省等。

2.1.2 空柄假香蘑 Notholepista fistulosa Z. M. He & Zhu L. Yang? ? ?子實體中等大小，菌蓋2～5 cm，近杯傘形，表面干或近水漬狀，表面光滑，淡黃色至黃色，菌蓋邊緣成熟時易開裂。菌褶明顯延生，白色或灰白色或略帶淡黃色，菌褶中等致密，褶幅中等。菌柄2～5 cm×0.3～0.5 cm，中生，圓柱形，中空，菌柄淡黃色向下顏色漸深，菌柄略帶絨毛。擔孢子近圓形，表面粗糙，4～6 μm×3.5～4.5 μm。擔子圓柱形，4擔孢子。囊狀體缺。菌褶菌髓規(guī)則，菌絲寬5～10 μm，圓柱形，薄壁。鎖狀聯(lián)合。子實體的生態(tài)照片及顯微特征手繪圖見圖2。

生境：散生或單生于針葉林和闊葉林地上。

分布：中國甘肅省[12]、中國山西省等。

2.2 毛緣菇和空柄假香蘑的系統(tǒng)發(fā)育關系

將測序獲得的序列提交GenBank，毛緣菇登錄號為：OP978283，柄假香蘑登錄號為：OP978293。通過對毛緣菇和柄假香蘑的系統(tǒng)發(fā)育關系研究發(fā)現(xiàn)，樣本7595與Ripartites tricholoma聚為1支，根據(jù)NCBI比對結果，結合系統(tǒng)發(fā)育關系，均支持形態(tài)分類學結果，即7595為毛緣菇。樣本7965與 Notholepista fistulosa聚為1支，根據(jù)NCBI比對結果，結合系統(tǒng)發(fā)育關系，均支持形態(tài)學鑒定結果，即樣本7965為空柄假香蘑。系統(tǒng)發(fā)育關系結果見圖3。

3 討論與結論

山西省的特殊地理位置孕育著特殊的生物資源，本研究在廣泛調查的基礎上采集到毛緣菇屬和假香蘑屬2個山西省新紀錄種。毛緣菇為該屬的模式種，模式種產地為瑞士，在我國主要分布在東北地區(qū)，本研究樣本采自山西，該物種生于針葉林或闊葉林地上，形態(tài)學鑒定和分子生物學結果均支持該種為毛緣菇，該種主要特征為菌蓋凸鏡形，菌蓋邊緣帶有波狀毛，孢子表面有疣。本種與毛緣菇模式種在菌蓋邊緣附屬物和孢子表面疣突大小方面略有區(qū)別，毛緣菇模式種菌蓋邊緣的附屬物（絨毛或纖維）比較明顯而本種略顯稀疏，毛緣菇模式種的擔孢子表面疣突較本種略小。分析產生以上情況的原因，主要由于同種在不同的地理分布和生境關系較大而導致的。

空柄假香蘑為假香蘑屬下的2個物種之一，該種目前僅報道在中國有分布，其模式種產地為甘肅省[6]，形態(tài)學鑒定和分子生物學結果均支持該種為空柄假香蘑，該物種主要特征是杯傘狀，子實體淡黃色至黃色，菌柄中空，孢子粗糙。假香蘑屬目前僅有2個物種，分別是Notholepista fistulosa和Notholepista

subzonalis，目前，我國僅發(fā)現(xiàn)Notholepista subzonalis的分布，二者形態(tài)特殊區(qū)別非常明顯，通過形態(tài)及分子生物學結果均較好的支持空柄假香蘑的鑒定結果。大型真菌多樣性的研究已成為區(qū)域性生物多樣性研究的重點之一，如王建瑞[13]、王迪等[14]、徐濟責[15]分別對區(qū)域性的大型真菌多樣性開展研究。

本研究的2個物種的食藥用情況并未見相關報道，2個物種均可以在針葉林環(huán)境中生長，作為資源利用的前期工作本研究將為相關資源的開發(fā)利用提供基礎參考。

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基金項目：吉林省科技廳重點研發(fā)計劃支持（20210202080NC）

作者簡介：趙磊（1999—），男，山西沂州人，在讀碩士生，主要從事食藥用菌種質資源研究。

通訊作者簡介：張春蘭（1988—），女，吉林長春人，副教授，博士，主要從事食藥用菌資源與病害研究。