胡民強(qiáng) 譚東輝 楊曙 朱倩晨 賴若沙 謝華平 鄧健航 鄧忠 謝鼎華 伍偉景*

1 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長沙 410011）

2 中南大學(xué)耳科研究所（長沙 410011）

3 湘南學(xué)院附屬醫(yī)院（郴州 423000）

4 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（長沙 410081）

5 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（株洲 412000）

越來越多的夫妻通過輔助生殖技術(shù)來幫助懷孕，其中體外受精胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）最為常見，通常被稱為“試管嬰兒”技術(shù)[1]。臨床上試管嬰兒技術(shù)不僅用于解決生育障礙的困境，對于某些單基因遺傳病可通過體外阻斷，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。試管嬰兒并非自然生殖，研究發(fā)現(xiàn)通過輔助生育技術(shù)育出的嬰兒出生缺陷的幾率比自然受孕的嬰兒要高[2]，這些缺陷的出現(xiàn)是受到輔助生育技術(shù)處理流程的影響，還是由遺傳因素所致，目前尚無明確結(jié)論[3]。

臨床上時(shí)常遇到，采取IVF-ET 技術(shù)妊娠的夫妻，即使雙方?jīng)]有耳聾病史和家族史，也會生育出先天性聾的嬰兒。本文對3 個(gè)IVF-ET 先天性聾家庭進(jìn)行了詳盡的臨床資料收集、遺傳特征分析及遺傳學(xué)檢測，對包括4 名先天性感音神經(jīng)性聾（sensorineural hearing loss,SNHL）患兒在內(nèi)的5 名嬰兒及其父母進(jìn)行了全外顯子組基因測序（whole exome sequencing,WES）和Sanger測序分析，以期為明確這些嬰兒出現(xiàn)先天性SNHL 的原因，避免IVFET生育聽力缺陷嬰兒提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究收集2020年1月至5月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院就診的3 個(gè)IVF-ET 先天性耳聾家庭，均為父母親本供精供卵。3 個(gè)家庭共生育5 名嬰兒，家庭1 和家庭2 為異卵孿生，足月剖宮產(chǎn)，家庭3 為單胎，足月順產(chǎn)。其中家庭1男嬰和女嬰，家庭2女嬰，家庭3 男嬰出生時(shí)新生兒聽力篩查均未通過，家庭2男嬰聽力篩查通過。

對3 個(gè)家庭成員的家族史、遺傳史、臨床表現(xiàn)等資料進(jìn)行收集，排除相關(guān)病毒感染、缺氧及病理性黃疸等致聾病因，對所有嬰兒及其父母共11 名成員分別進(jìn)行相關(guān)耳科和全身檢查，全面聽力學(xué)評估，簽署知情同意書后，采取外周靜脈血進(jìn)行遺傳基因檢測。嬰幼兒聽力評估采取聽性腦干反應(yīng)、多頻穩(wěn)態(tài)反應(yīng)、耳聲發(fā)射和聲導(dǎo)抗測試為主，結(jié)合聲場測聽進(jìn)行主觀聽力評估；成人聽力評估采取純音測聽、聲導(dǎo)抗和耳聲發(fā)射測試。確診為雙耳極重度SNHL 的4 名嬰兒均進(jìn)行耳部高分辨率CT 和磁共振成像檢查，并接受人工耳蝸植入。該研究得到中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 全外顯子組測序

采用基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，經(jīng)Qubit3.0 熒光定量儀鑒定，所提取的DNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

應(yīng)用基于目標(biāo)序列捕獲的二代測序技術(shù)進(jìn)行WES 測序鑒定。實(shí)驗(yàn)流程包括：文庫構(gòu)建，分選純化DNA及片段化，末端修復(fù)，3’末端加A，連接測序接頭，文庫純化和片段大小篩選，PCR擴(kuò)增文庫，全外顯子芯片雜交，雜交文庫清洗及純化，PCR 擴(kuò)增外顯子DNA文庫，文庫質(zhì)量檢測，上機(jī)測序。

1.2.2 生物信息分析

對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，獲取每個(gè)樣本原始序列數(shù)量和測序讀長，以“Q20(%)”和“Q30(%)”分別表示原始數(shù)據(jù)中測序質(zhì)量值Q 不低于20和30的序列堿基比例。通過對三組家庭進(jìn)行WES，分析發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)量在13GB～18GB 之間，平均測序深度在155X，目標(biāo)測序區(qū)域10X 覆蓋堿基覆蓋比例約99%，Q20 的比例均在97%以上，Q30 的比例在92%以上。

堿基質(zhì)量評估，比對，使用BWA 工具將測序序列比對到hg19。比對完成使用Picard 工具進(jìn)行Q20，Q30 平均測序深度等數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。使用GATK Haplotype Caller 方法檢測樣本的SNV/InDel。通過annovar 工具對突變進(jìn)行基因功能等注釋。運(yùn)用SNPscan 分型技術(shù)檢測96個(gè)高頻位點(diǎn)，驗(yàn)證全外顯子組測序的準(zhǔn)確性。

1.2.3 致病基因篩選

針對全部的SNV/InDel 位點(diǎn)，保留符合這些條件的位點(diǎn)用于進(jìn)一步分析：①頻率性數(shù)據(jù)庫選擇低頻突變：1000Genomes的頻率低于0.01；②屬于外顯子突變或剪切位點(diǎn)突變的所有不是同義突變的位點(diǎn)；③突變在保守性數(shù)據(jù)庫（Sift,POLYPhen V2,Mutation Taster,Cadd,Dann,dbscSNV）中預(yù)測為有害；④基于基因功能以及基因與疾病篩選和耳聾相關(guān)的基因。

1.2.4 Sanger測序驗(yàn)證

在WES 的基礎(chǔ)上對10 個(gè)樣本的7 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了測序驗(yàn)證，總共設(shè)計(jì)了7 對引物。①DNA 樣本取1l 1%agarose 電泳對其樣本進(jìn)行質(zhì)量及濃度估計(jì)，再根據(jù)濃度將樣本稀釋到工作濃度5-10ng/l，沒有DNA 條帶的樣本保持原濃度。②設(shè)計(jì)PCR 反應(yīng)，包括PCR 引物和設(shè)計(jì)PCR 條件。③利用SAP 和Exo I 進(jìn)行PCR 純化。④測序產(chǎn)物上ABI3730XL 測序儀，測序文件用Polyphred 軟件分析，最后人工校對，整理出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果

3 個(gè)家庭父母聽力均正常，家族中無耳聾患者。家庭1母親受孕時(shí)31歲，有宮外孕史，患“甲狀腺功能減退”8年。家庭2 母親受孕時(shí)29 歲，患“多囊卵巢綜合征”，月經(jīng)紊亂。家庭3 母親受孕時(shí)32歲，患“輸卵管不通，多囊卵巢綜合征”，月經(jīng)紊亂，有不明原因流產(chǎn)史。

聽力評估結(jié)果表明，家庭1 雙胞胎男嬰和女嬰均為雙耳極重度SNHL；家庭2 雙胞胎中男嬰聽力正常，女嬰為雙耳極重度SNHL；家庭3 男嬰為雙耳極重度SNHL。

影像評估顯示家庭1 兩名耳聾嬰兒內(nèi)耳發(fā)育無畸形，家庭2 耳聾女嬰為Mondini 畸形并前庭水管擴(kuò)大（圖1）。家庭3 耳聾男嬰雙側(cè)內(nèi)聽道狹窄（圖2）。

圖1 家庭2聾兒耳部CT顯示Mondini畸形并前庭水管擴(kuò)大。Fig.1 CT scan of deaf infant in Family 2 showing Mondini malformation and enlarged vestibular conduct.

圖2 家庭3聾兒耳部CT顯示內(nèi)聽道狹窄。Fig.2 CT scan of deaf infant in Family 3 showing stenosis of internal auditory canal.

2.2 基因檢測結(jié)果

運(yùn)用WES 對約20000 個(gè)基因測序后發(fā)現(xiàn)突變候選基因3193個(gè)，分析篩選出4個(gè)常見與耳聾相關(guān)基因，其他為目前認(rèn)為與耳聾無相關(guān)性的隱性基因和新生突變基因。

2.2.1 三組家庭耳聾相關(guān)基因突變

三組家庭11 名成員WES 基因檢測共發(fā)現(xiàn)4 個(gè)基因7 個(gè)突變位點(diǎn)，包括MYO3A、MYO15A、SLC26A4和TPO基因（表1）。

表1 基因檢測結(jié)果（人）,n=11Table 1 Genetic test results(human),n=11

2.2.2 三組家庭父母及患兒的耳聾基因突變位點(diǎn)

家庭1患兒父母均為MYO3A雜合突變，其突變位點(diǎn)相同，為MYO3A:NM_017433:exon32:c.4462A＞G:p.K1488E（圖3A,B）。其父母同時(shí)還攜帶突變位點(diǎn)不同的MYO15A雜合突變，父親突變位點(diǎn)為：MYO15A:NM_016239:exon22:c.5638G＞A:p.G1880R（圖4A）；母親突變位點(diǎn)為：MYO15A:NM_016239:exon4:c.3693-2A＞G（圖4B），該兩處突變位點(diǎn)位于剪切區(qū)，不參與蛋白質(zhì)的合成，過去未見報(bào)道。

圖3 家庭1 MYO3A 基因測序圖。A：先證者父親擁有雜合突變:c.4462A＞G；B：先證者母親擁有雜合突變:c.4462A＞G；C：男先證者擁有純合突變:c.4462A＞G；D：女先證者擁有雜合突變:c.4462A＞G。Fig.3 MYO3A gene sequencing of Family 1.A:Proband's father owns heterozygous mutation:c.4462A＞G ; B: Proband's mother owns heterozygous mutation:c.4462A＞G; C: Male proband owns homozygous mutation:c.4462A＞G; D: Female proband owns heterozygous mutation:c.4462A＞G.

圖4 家庭1 MYO15A 基因測序圖。A：先證者父親和男女患兒擁有雜合突變:c.5638G＞A；B：先證者母親和男女患兒擁有雜合突變c.3693-2A＞G。Fig.4 Gene sequencing of Family 1 MYO15A.A: Proband's father the male and female probands own heterozygous mutation:c.5638G＞A; B: Proband's mother and the male and female probands own heterozygous mutation:c.3693-2A＞G.

家庭1 男患兒為MYO3A基因純合突變，與父母共有突變位點(diǎn)MYO3A: NM_017433: exon32:c.4462A＞G:p.K1488E（圖3C），同時(shí)還攜帶其父母的MYO15A突變位點(diǎn)，表現(xiàn)為復(fù)合雜合突變，與母親共有突變位點(diǎn)MYO15A:NM_016239:exon4:c.3693-2A＞G，與父親共有突變位點(diǎn)MYO15A:NM_016239:exon22:c.5638G＞A:p.G1880R。女患兒為MYO3A基因雜合突變，突變位點(diǎn)與其父母相同（圖3D），同時(shí)也攜帶來自其父母的MYO15A基因突變位點(diǎn)，表現(xiàn)為復(fù)合雜合突變，與其父親共有突變位點(diǎn)MYO15A:NM_016239:exon22:c.5638G＞A:p.G1880R，與母親共有突變位點(diǎn)MYO15A:NM_016239:exon4:c.3693-2A＞G。

家庭2 中父母均為SLC26A4雜合突變，但雙方突變位點(diǎn)并不相同。父親突變位點(diǎn)為：SLC26A4:NM_000441:exon10:c.1229C＞T:p.T410M（圖5A）；母親突變位點(diǎn)為：SLC26A4: NM_000441: exon19:c.2168A＞G:p.H723R（圖5B）。家庭2 中女患兒攜帶來自父母的SLC26A4基因突變位點(diǎn)，表現(xiàn)為復(fù)合雜合突變；與其父親共有的突變位點(diǎn)為：SLC26A4:NM_000441:exon10:c.1229C＞T:p.T410M；與其母親共有的突變位點(diǎn)為：SLC26A4:NM_000441: exon19:c.2168A＞G:p.H723R。家庭2 中另一男嬰經(jīng)篩選為野生型。

圖5 家庭2 SLC26A4 基因測序圖。A: 患兒和父親共有雜合突變:c.1229C＞T;B:患兒和母親共有雜合突變:2168A＞G。Fig.5 Family 2 SLC26A4 gene sequencing.A: The female deaf infant and her father own heterozygous mutation:c.1229C＞T; B: The female deaf infant and her mother own heterozygous mutation:2168A＞G.

家庭3 中父母均為TPO雜合突變，雙方突變位點(diǎn)不同。父親突變位點(diǎn)為：TPO:NM_175721:exon13:c.2404C＞T:p.R802W（圖6A）；母親突變位點(diǎn)為：TPO:NM_175721:exon14:c.2515C＞T:p.P839S（圖6B）。家庭3 患兒攜帶來自其父母的TPO基因突變，表現(xiàn)為復(fù)合雜合突變。與父親共有的突變位點(diǎn)為TPO:NM_175721:exon13:c.2404C＞T:p.R802W；與母親共有的突變位點(diǎn)為TPO:NM_175721:exon14:c.2515C＞T:p.P839S。

圖6 家庭3 TPO 基因測序圖。A:患兒和父親共有雜合突變:c.2404C＞T;B:患兒和母親共有雜合突變:c.2515C＞T。Fig.6 TPO gene sequencing of family 3.A: The deaf infant and his father own heterozygous mutation: c.2404C＞T; B:The deaf infant and his mother own heterozygous mutation:c.2515C＞T.

本組病例WES基因測序表明，家庭1男患兒攜帶耳聾相關(guān)突變基因MYO3A，為純合突變，同時(shí)攜帶MYO15A突變基因，為復(fù)合雜合突變。女患兒攜帶MYO15A突變基因，為復(fù)合雜合突變。家庭2 中女患兒攜帶SLC26A4基因突變位點(diǎn)，為復(fù)合雜合突變。家庭3 中男患兒攜帶TPO突變基因，為復(fù)合雜合突變。以上突變均由其父母提供，所有先證者其耳聾的產(chǎn)生符合遺傳規(guī)律。

3 討論

臨床上通過輔助生殖技術(shù)生育出先天性缺陷嬰兒并非少見，逐漸引起人們關(guān)注。不孕不育會增加試管嬰兒出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)，國外研究報(bào)道IVFET 或胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）的出生缺陷率分別為8.6% 和9.0%[3]，但另一項(xiàng)研究指出在考慮包括母親年齡在內(nèi)的父母因素的多變量分析后，IVF-ET 和出生缺陷之間并無明顯關(guān)聯(lián)[4]。輔助生殖技術(shù)伴隨著出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)增加，可能涉及的因素包括潛在的低生育能力、誘導(dǎo)排卵藥物、顯微操作技術(shù)等[5]。

目前國內(nèi)外關(guān)于IVF-ET與出生缺陷的研究較多，但對其與聽力缺陷的關(guān)系報(bào)道較少。Ludwig等[6]通過前瞻性、對照、盲法隨訪研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用ICSI與自然受孕對照組的聽力和視力發(fā)育無差異。而Liang 等[7]報(bào)道，與自然受孕相比，IVF-ET 或ICSI 技術(shù)單胎妊娠眼、耳、臉和頸部畸形的風(fēng)險(xiǎn)增加20%。Kim 等[8]報(bào)道IVF-ET 技術(shù)導(dǎo)致聽力篩查失敗可能有以下幾個(gè)原因，如IVF-ET 技術(shù)程序本身的直接影響，或者與IVF-ET技術(shù)程序相關(guān)的處理（如輔助孵化、囊胚培養(yǎng)）以及與不孕癥本身有關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)運(yùn)用IVF-ET或ICSI技術(shù)可能引起基因突變導(dǎo)致異常甲基化，進(jìn)而引起表型的改變，并報(bào)道RIPOR2突變引起甲基化異?？赡芘c聽力缺陷有關(guān)，因?yàn)樗幋a毛細(xì)胞纖毛的質(zhì)膜相關(guān)蛋白[9]。齊月娥等[10]報(bào)道，試管嬰兒與正常妊娠出生的新生兒聽力檢查結(jié)果無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，孟曄等[11]通過基因測序發(fā)現(xiàn)運(yùn)用IVF-ET或ICSI技術(shù)子代遺傳性耳聾基因突變發(fā)生率與自然妊娠組子代相似。我們在近年的臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)IVF-ET 生育先天性聾兒的實(shí)例并非罕見，而且在這些家系中，父母及家族成員均無耳聾，亦未調(diào)查出遺傳家族史。

基于在遺傳性聾中，非綜合征性隱性遺傳所占比例最高，在考慮輔助生殖技術(shù)伴發(fā)先天性聾的病因時(shí)，遺傳因素必須引起高度重視。雖然這些家庭可能沒有耳聾家族史，父母聽力表現(xiàn)正常，但其攜帶隱性遺傳耳聾基因的可能性值得注意。在本組IVF-ET 先天性聾病例的遺傳學(xué)探查與分析中，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、人類遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫（Human Gene Mutation Database HGMD）等數(shù)據(jù)庫篩選出4 種耳聾相關(guān)致病基因MYO15A、MYO3A、SLC26A4、TPO，這4 種基因突變與三組家庭出現(xiàn)耳聾患兒的相關(guān)性極大。值得注意的是，家庭1 同時(shí)存在MYO3A和MYO15A兩種耳聾相關(guān)基因突變，根據(jù)ACMG 指南MYO3A:NM_017433:exon32:c.4462A＞G:p.K1488E 變異的致病性分級為良性，提示該突變位點(diǎn)可能不是致聾原因，但Wu等[12]曾報(bào)道該基因純合突變的感音神經(jīng)性聾。另外，MYO15A的2 個(gè)新突變位點(diǎn)的致病性有待進(jìn)一步驗(yàn)證，可對新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)進(jìn)行克隆，進(jìn)一步構(gòu)建載體，再通過顯微注射到胚胎，或者通過CRISPR/Cas9 基因敲出技術(shù)摸擬突變位點(diǎn)，觀察表型的改變。TPO基因突變被認(rèn)為是自身免疫性甲狀腺疾病的常見原因，Kara 等[13]報(bào)道TPO突變可能與甲狀腺功能減退癥伴先天性聾有關(guān)。本組家庭3 患兒未檢測出甲狀腺功能異常，需追蹤觀察，其TPO基因突變與耳聾的關(guān)系待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本組病例中，除了上述4 種耳聾相關(guān)基因外，還發(fā)現(xiàn)三個(gè)家庭均攜帶有其他隱性遺傳突變基因，如家庭1 中還有CYP1A1純合突變，DMXL1、HMCN2、MUC16復(fù)合雜合突變，家庭2 有PDE4DIP純合突變，HERC2、HMCN2、MIA3、TGFBRAP1、OBSCN、TTC37復(fù)合雜合突變，家庭3 有AHNAK復(fù)合雜合突變。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和OMIM、HGMD數(shù)據(jù)庫，這些基因突變與耳聾關(guān)系不大，可能參與其他表型[14]。

總之，3 組家庭父母攜帶有MYO15A、MYO3A、SLC26A4、TPO與耳聾相關(guān)的基因突變，患病嬰兒的臨床表現(xiàn)符合遺傳規(guī)律。因此，臨床上開展輔助生殖技術(shù)時(shí)，與自然受孕一樣，應(yīng)高度重視對候選夫妻進(jìn)行廣泛耳聾基因的篩查，且不僅限于目前常見的4 種基因，做好產(chǎn)前診斷，以減少聽力缺陷嬰兒的出生，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。