段瑞培, 劉如佳, 劉祎寧, 羅元鴻, 崔承弼

(延邊大學 農學院,吉林 延吉 133000)

紅參為人參經蒸制后的干燥根和根莖[1]。紅參性溫,具有調節(jié)神經、心血管和內分泌,補氣益血、養(yǎng)心安神等功效。紅參具有抗氧化能力,可清除羥自由基,其活性成分中的Rg5清除自由基的效果最佳[2]。

低氘水(LDW)是指氘豐度低于天然豐度的水,是一種穩(wěn)定同位素產品。低氘水可以預防疾病、延緩衰老、活化機體免疫細胞,防治癌癥[3]。低氘水是改進化妝品品質的安全且有效的組分,有助于提高皮膚細胞抗老化、保濕、抗紫外線照射、抗過敏等功能[4]。

黃原膠分子中含有大量的親水基團,是一種良好的表面活性物質,具有抗氧化、防止皮膚衰老等功效。因此,幾乎絕大多數高檔化妝品都將黃原膠作為其主要功能成分[5]。王昌濤等以甘油作為保濕劑,研究其保濕功效,得出化妝品中添加甘油有良好的保濕效果[6]。因此,該試驗選擇以低氘水研制紅參功效成分的精華液,以期達到具有顯著美白功效、顯著抗氧化能力、符合化妝品行業(yè)有關規(guī)定的精華液。

1 材料與設備

1.1 材料

低氘水(瀘州哈羅德健康科技有限公司);紅參(長白山科學研究院提供);75%乙醇;甘油;黃原膠;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉);透明質酸鈉;1,3-丁二醇;尿囊素;蓖麻油;青花香精;蒸餾水;維生素C(Vc);磷酸鹽緩沖溶液(PBS,Gibco公司);L-酪氨酸(Sigma試劑公司);酪氨酸酶(諾維信生物技術有限公司)。

1.2 設備

電熱恒溫水浴鍋(HWS-24型,上海百典儀器設備有限公司);水浴鍋(OSB-2100-CE型,東京理化器械株式會社);落地式連續(xù)投料粉碎機(DF-35,溫嶺市林大機械有限公司);多功能熒光酶標儀(SP-Max3500FL型,上海閃譜生物科技有限公司);離心機(TG16A-WS型,上海盧湘儀器有限公司);分析天平(FA2004型,上海上平儀器有限公司);立式鼓風干燥箱(DHC-9620A型,上海百典儀器設備有限公司);pH計(FE28型)。

2 試驗方法

2.1 紅參提取方法

采用水提醇沉法[7]提取紅參中的有效成分。200 g紅參稱重粉碎,按照料液比1∶20(g∶mL)加入75%乙醇,40 ℃蒸煮2 h,用離心機以4 000 r/min離心3 min,取上清液,濾渣重復操作1次,最后結合3次離心的上清液進行旋蒸濃縮,離心取上清液,將上清液置于-80 ℃冷凍后凍干成粉末,提取物粉末密封保存在4 ℃冰箱中[8]。

2.2 單因素與正交試驗

2.2.1 單因素試驗

1) 標準品溶液 準確稱取紅參粉末0.1 g(精確到0.000 1 g)置于10 mL容量瓶,蒸餾水定容,配制成10%的儲備液。

參考李波等[9]制作靈芝面膜精華液的基礎配方,選定紅參提取液添加量、甘油添加量以及黃原膠添加量作為單因素試驗的對象,在此基礎配方中黃原膠的質量分數為0.05%～0.25%,參考林志魁等[10]研制的一種新型瓊膠寡糖面膜精華液中甘油添加量4%～12%、瓊膠寡糖添加量0.6%～1.4%,制定單因素試驗的濃度梯度。

2) 紅參提取液添加量的選擇 在甘油10%,黃原膠0.15%的條件下,以0.5%、1%、2%、3%和4%(質量分數)的紅參提取液濃度進行單因素試驗,根據感官評價確定3個最優(yōu)值,以確定制作功能性低氘水精華液中紅參提取液的最優(yōu)濃度。

3) 甘油添加量的選擇 在紅參提取液1%,黃原膠0.15%的條件下,以6%、8%、10%、12%和14%的甘油添加量進行單因素試驗,根據感官評價確定3個最優(yōu)值,以確定制作精華液甘油的最優(yōu)添加量。

4) 黃原膠添加量的選擇 在紅參提取液1%,甘油10%的條件下,以0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的黃原膠添加量進行單因素試驗,根據感官評價確定3個最優(yōu)值,以確定制作精華液黃原膠的最優(yōu)添加量。

精華液感官標準如表1所示。

表1 精華液感官評價指標

2.2.2 正交試驗

利用正交試驗表L9(33)設計試驗,正交試驗設計如下(表2)。

將紅參提取液(0.5%、1%、2%)、甘油(8%、10%、12%)、黃原膠(0.10%、0.15%、0.20%)作為變量,進行3因素3水平試驗。DPPH自由基在517 nm下有吸收峰[11],在517 nm測定各組的DPPH自由基清除率,以DPPH自由基清除率作為正交試驗結果的判斷依據。

表2 正交試驗設計表

DPPH自由基清除率試驗操作時,按表3在96孔板中進行點樣:對照組(AC)加入20 μL蒸餾水、180 μL DPPH(DPPH濃度:稱取1.971 6 mg DPPH,在閉光環(huán)境中用無水乙醇定容至50 mL);空白組(ACB)加入20 μL蒸餾水、180 μL乙醇;樣品組 (AS)加入20 μL不同濃度的樣品溶液、180 μL DPPH;樣品空白組 (ASB)加入20 μL不同濃度的樣品溶液、180 μL乙醇(75%);點樣完成后,在避光條件下,在560 nm處測定吸光度[12]。每個樣品重復檢測3次,結果取平均值。

表3 DPPH自由基清除試驗

所得數據根據公式計算DPPH自由基清除率:

式中,AC:對照組吸光度;ACB:空白組吸光度;AS:樣品組吸光度;ASB:樣品空白組吸光度。

2.3 精華液的制備

在制備過程中使用的儀器與設備均需經過紫外線滅菌和乙醇消毒。產品配方參考李波等[9,13-14]人制備靈芝面膜精華液的方法(表4)。

表4 低氘水精華液的配方

1) 制備A相溶液:取甘油、黃原膠、尿囊素、1,3-丁二醇、蓖麻油,在80～90 ℃水浴條件下加熱,攪拌均勻。

2) 制備B相溶液:取適量低氘水,加入EDTA二鈉、紅參提取液,攪拌至溶解完全。

3) 將A相溶液加入B相溶液中,攪拌均勻,在80～ 90 ℃下保溫30 min,繼續(xù)攪拌10 min,冷卻后加入C相溶液,繼續(xù)攪拌5 min,即得紅參精華液。

2.4 理化指標的測定

2.4.1 pH值測定

參考林志魁[10]的方法,取1 mL精華液,加入去離子水9 mL,充分攪拌并加熱至40 ℃,放置冷卻至室溫,用pH計測定其pH值,每個樣品測定3次,取其平均值。參照GB/T 13531.1-2008《化妝品通用檢測法》,pH值在3.5～8.5均符合要求。

2.4.2 離心穩(wěn)定性測試

取5 g于10 mL離心管中,于3 000 r/min離心15 min,觀察其是否有分層、浮油、變色等現象[15]。

2.4.3 美白功效的評定

通過對酪氨酸酶活性的影響試驗判定該精華液的美白功效。

參照文獻[16],取1 mL精華液,將其稀釋至1、1.5、2、2.5、3 mL。按表5在2 mL離心管中加入pH值6.8的PBS緩沖液、樣品溶液、質量分數0.1%的L-酪氨酸溶液、用磷酸鹽緩沖溶液配制的質量濃度為200 μg/mL的酪氨酸酶溶液,每組的總反應體系為1.4 mL。將溶液充分搖勻后,在37 ℃水浴鍋中加熱20 min。取出后,向96孔板點樣,每個孔中加入200 μL樣液,在475 nm處測定其吸光度。

每組稀釋樣品以同濃度VC作為陽性對照(稱取與樣品相同的質量,定容到相同體積的容量瓶中,用與樣品的稀釋倍數相同的溶劑,稀釋成與樣品相同的濃度梯度)。

表5 抑制酪氨酸酶試驗

根據公式計算得出樣品對酪氨酸酶的抑制率:

2.5 安全性評價

通過人體試用實驗觀察樣品對人體皮膚的安全性,選取年齡在20～55歲的33名志愿者組成安全性評價小組。受試者直接將精華液涂抹于手背。電話隨訪受試者有無皮膚反應或全身性不良反應如惡心、乏力、月經紊亂及其他不適等,觀察涂抹樣品部位皮膚反應,按表6皮膚反應分級標準記錄結果。試用時間為8周。受試者回訪時,仔細詢問、檢查并記錄受試者在使用樣品期間所發(fā)生的任何不良事件[17-18]。

表6 人體試用試驗皮膚反應分級標準

3 結果與分析

3.1 單因素與正交試驗

紅參提取物具有滋養(yǎng)皮膚、防治皮膚粗糙和生成小皺紋等功效,其用量對精華液品質的影響為:隨紅參提取物含量的增加,精華液感官評分呈先上升后下降的趨勢,在添加量為0.5%～2%時,分值較高(表7)。紅參提取物呈紅褐色,添加量過多時精華液顏色過深。在一定范圍內,DPPH自由基清除率與摩爾濃度呈正相關關系[19]。經成本、評分等多因素綜合分析,選擇0.5%、1%和2%的紅參提取物含量作進一步的正交試驗。

表7 紅參提取物添加量對精華液感官品質的影響

甘油是一種常用的化妝品保濕劑,會對產品的黏感、厚重感、滋潤度和補水性起作用。但甘油具有一定的黏性,因此甘油添加量過低或過高都會對以上指標產生不良影響。經此次單因素試驗后,選取8%、10%和12%的添加量進行正交試驗(表8)。

表8 甘油添加量對精華液感官品質的影響

黃原膠又名黃桿菌膠,是一種天然食品增稠劑。黃原膠在精華液中主要作增稠劑使用[20],添加量過多會導致精華液過稠而厚重油膩,不易被皮膚吸收;添加量過少會導致精華液過稀,延展性過強,像水一樣。因此,根據試驗結果,選取0.1%、0.15%和0.2%作正交試驗(表9)。

表9 黃原膠添加量對精華液感官品質的影響

最終選取紅參提取液0.5%、1%、2%,甘油8%、10%、12%,黃原膠0.1%、0.15%、0.2%進行正交試驗,用以確定最終配方。

取紅參、甘油、黃原膠進行DPPH自由基清除率試驗,結果如表10所示。

表10 低氘水精華液配方正交試驗結果

由試驗結果可知,最佳因素組合為A3B1C3,即紅參提取液2%,甘油8%,黃原膠0.2%時,對DPPH的清除效果最好。其中,紅參是發(fā)揮抗氧化作用的主要成分,甘油作為保濕劑,黃原膠因其含有大量的親水基團,作為流變調節(jié)劑,并兼有抗氧化、抗衰老等功效。

3.2 理化性質

3.2.1 pH值測定

用pH計測定樣品的pH值,3次測定結果均為5.2,符合《化妝品通用檢測法》所規(guī)定的要求。

3.2.2 離心穩(wěn)定性測試

離心管中的5 mL精華液在經過3 000 r/min離心15 min后,并未出現分層、浮油、變色等現象,表明精華液具有良好的離心穩(wěn)定性。

3.2.3 美白功效的評定

美白過程是指抑制酪氨酸酶活性,對作用于黑色素代謝的各個階段進行調控,從而達到抑制黑色素生成的目的。參與黑色素合成過程的一系列酶中最關鍵的是酪氨酸酶[21],研究表明酪氨酸酶活性過高會導致黑色素過度地生成,還會導致人體皮膚產生色素性疾病[22],對酪氨酸酶進行活性調節(jié)是影響黑色素合成的關鍵。因此,對酪氨酸酶的抑制作用是評價美白作用的一項重要指標。從試驗結果可以看到,未稀釋的精華液對酪氨酸酶的抑制率最大,隨著精華液稀釋倍數的增加,其對酪氨酸酶的抑制率也下降。因此,通過對酪氨酸酶活性的影響試驗可以判定該精華液的美白功效(表11)。

表11 低氘水精華液的酪氨酸酶抑制率

3.3 產品安全性評估

研究期間33名受試者僅1位出現微弱紅斑,參考表6中規(guī)定的人體試用皮膚不良反應分級標準,評定測試樣品具有良好的安全性[23](表12)。

表12 安全性評價表

4 討論與結論

目前,市場上常見的精華液以靈芝[9]、茶葉[24]為主要的天然成分,還有不少對天然多糖類[25]和中藥材類[26]精華液的研究。而該試驗以紅參為主要成分,以低氘水為特色成分,側重于配方優(yōu)化,后續(xù)對其功能活性進行了研究。

紅參多糖能清除DPPH自由基和羥自由基[27],在正交試驗中,紅參提取液清除DPPH自由基的能力隨著濃度(0.5%→2%)的增加而增強,這與李慧萍[28]證明的紅參提取物含量與其體外抗氧化能力呈現一定的相關關系一致。且與袁元等[29]人的研究結果一致,但袁元等人的研究主要側重于對紅參、白參和黑參抗氧化效果的對比,黑參強于紅參和白參,因此,能否用黑參代替紅參作為精華液的有效成分還有待探索。

紅參提取物的添加量影響精華液的色澤和抗氧化性。甘油作為主要的保濕劑,可以保護皮膚的表皮層和真皮層的水分不流失,使肌膚保持良好狀態(tài)。黃原膠作為增稠劑,起到使產品性質穩(wěn)定不分層的功效,但過量時易導致成品過于黏稠,功效成分無法被完全吸收。經正交試驗最終選定的精華液配方為:紅參提取液2%、甘油8%、黃原膠0.2%、1,3-丁二醇5%、蓖麻油1%、尿囊素0.2%、EDTA二鈉0.03%、香精0.05%,最后低氘水補至100 mL。

從試驗結果來看,紅參低氘水精華液對酪氨酸酶具有顯著的抑制作用。張亞茹等[30]人研究發(fā)現,不同濃度的低氘水均能抑制酪氨酸酶活性,但他們的研究主要側重于不同ppm的低氘水對酪氨酸酶活性的影響。同時,Parvez S[31]和黃寶亮等[32]人研究發(fā)現,紅參中的熊果苷和精氨酸雙糖苷均能通過相應的作用機制抑制酪氨酸酶的活性。這表明低氘水和紅參對酪氨酸酶活性均有抑制作用,與試驗結果一致,但低氘水和紅參共同使用是否存在協(xié)同作用還有待進一步探討。

除了功效外,精華液的離心穩(wěn)定性和pH值直接影響其品質。根據《化妝品通用檢測法》,在3 000 r/min離心15 min未出現分層、浮油、變色等現象,即可表明精華液具有良好的離心穩(wěn)定性,試驗表明該精華液具有較好的離心穩(wěn)定性,同時pH值為5.2,表明精華液溫和無刺激。

化妝品接觸性皮炎根據發(fā)病機制和誘因不同可以分為過敏性接觸性皮炎(CACD)和刺激性接觸性皮炎(CICD)。過敏性接觸性皮炎(ACD)非常常見,約5人中就有1人發(fā)生[33]。目前報道中最常見引起CACD的過敏原主要有:香料、防腐劑、染料中的對苯二胺、表面活性劑等[34]。該試驗中引起志愿者發(fā)生微弱紅斑的可能是由青花香精、甘油或1,3-丁二醇引起的。雖然宋利萍[35]研究發(fā)現,紅參對被動皮膚過敏反應和接觸性皮炎具有抑制作用,但王智彪[36]也報道過相關紅參過敏的案例,因此,也不排除志愿者可能對紅參過敏。

綜上所述,以紅參提取物為原材料所制成的低氘水精華液質地均勻、性質穩(wěn)定,溫和無刺激,具有良好的美白功效,且契合目前對化妝品“天然”的要求,為消費者提供了一種天然健康護膚產品的生產可能。