潘敏 許嘉麟 談家金 孫玉鳳 葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué),南京,210037)

松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一種可危害黑松(PinusthunbergiiParlatore)、馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、火炬松(PinustaedaL.)、黃松(PodocarpusimbricatusBl. Enum. Pl. Jav.)等多種松樹的病害[1-3]。松材線蟲主要由松墨天牛(Monochamusalternatus)、云杉花墨天牛(M.saltuarius)等為媒介昆蟲進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播,在感病30～40 d后,寄主松樹枯死[4]。松材線蟲病在我國首次被發(fā)現(xiàn)是在1982年,自此,該病害侵害范圍不斷擴(kuò)大,已經(jīng)蔓延至我國多個省市地區(qū)[5]。由于松材線蟲病具有快速傳播性和高度危害性,導(dǎo)致其對全世界多種松樹資源都存在著巨大威脅,該病的防控已成為世界性的難題[6]。

近年來,生物防治逐漸進(jìn)入大眾視野,其最突出的特點就是不污染環(huán)境,與化學(xué)防治相比,具有較強(qiáng)的環(huán)境友好性[7-8]。微生物是生物防治的重要組成部分,而細(xì)菌因易于繁殖、生產(chǎn)簡單等優(yōu)點,在生物防治中被廣泛應(yīng)用[9-11],其中又以芽孢桿菌菌劑應(yīng)用較為廣泛[12-14]。Li et al.[11]從馬尾松中分離得到短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)LYMC-3,其代謝產(chǎn)物中的胍類化合物能對松材線蟲產(chǎn)生明顯抑殺作用。徐華潮等[15]研究發(fā)現(xiàn)2株蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)020和RBT-200701的胞外毒素對松材線蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺線蟲活性。

氧自由基的化學(xué)反應(yīng)活性高,極不穩(wěn)定,易與其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),直接或間接造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。而氧自由基能被松材線蟲體內(nèi)的過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)清除,減少氧自由基對線蟲的危害[17-18]。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)能夠催化谷胱甘肽(GSH)與活性氧反應(yīng),減輕活性氧對線蟲的損害[19]。丙二醛(MDA)是常見的膜脂過氧化指標(biāo),MDA的質(zhì)量摩爾濃度與線蟲氧化損傷程度呈正相關(guān)[20-22]。因此,檢測線蟲體內(nèi)MDA的質(zhì)量摩爾濃度及SOD、POD、CAT、GSH-Px的活性可以反映機(jī)體被氧化損傷的程度。一般來說,乙酰膽堿酯酶(AchE)在突觸或神經(jīng)肌肉連接處,催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)的水解,同時終止神經(jīng)沖動,是松材線蟲不可或缺的酶[23-24]。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)NJSZ-13是從松樹體內(nèi)分離得到的一株生防菌,已知松材線蟲在NJSZ-13的菌懸液中處理48 h后,死亡率達(dá)到81.5%[25]。為了進(jìn)一步明確菌株NJSZ-13的殺線機(jī)理,本研究在此基礎(chǔ)上,探究NJSZ-13菌株代謝產(chǎn)物對松材線蟲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、MDA質(zhì)量摩爾濃度、AchE和保護(hù)性酶(SOD、POD、CAT、GSH-Px)活性的影響,為研發(fā)微生物源殺線劑提供參考。

1 材料與方法

供試材料:蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株和松材線蟲AMA3蟲株來源于南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室。

營養(yǎng)瓊脂(NA)固體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L,氯化鈉5 g/L,蛋白胨10 g/L,瓊脂20 g/L,pH為7.2～7.4。

營養(yǎng)肉湯(NB)液體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L,氯化鈉5 g/L,蛋白胨10 g/L,pH為7.2～7.4。

菌株NJSZ-13菌懸液和發(fā)酵濾液的獲得:挑取單個NJSZ-13菌落接入NB液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、200 r/min條件下?lián)u培4 d,即得發(fā)酵液。將發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min后,上清液用注射器經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得發(fā)酵濾液,沉淀菌體用等體積的無菌水懸浮即得菌懸液(菌體濃度為3×108個/mL)。

菌株NJSZ-13處理松材線蟲:采用浸漬法,將一定數(shù)量的松材線蟲(每個處理30 000條)用蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、菌懸液分別處理6、12、24、36 h后(對照用無菌水和NB液體培養(yǎng)基處理),于室溫條件下,以3 500 r/min離心5 min去除浸漬液,之后用無菌水沖洗沉淀3次,每個處理重復(fù)3次。

線蟲生理生化指標(biāo)測定:將供試線蟲液與可溶性蛋白提取液混合于1.5 mL離心管中,用低溫預(yù)冷組織研磨儀(凈信JXFSTPRP-CL)將其研磨180 s,4 ℃、3 500 r/min條件下離心10 min,上清液即為組織勻漿液。線蟲可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定采用Bradford法[26],利用紫外分光光度計(Perkin Elmer Lambda 365)在波長595 nm處測量吸光值。其余6種指標(biāo)(SOD、POD、CAT、GSH-Px的活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度和AchE活性)的測定按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒方法進(jìn)行。

數(shù)據(jù)處理:采用Excel 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株NJSZ-13對松材線蟲可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響如表1所示,對照組與處理組在整個處理時間均呈下降趨勢。前6 h,處理組松材線蟲體內(nèi)蛋白的質(zhì)量濃度緩慢下降,處理組與對照組差異顯著(p<0.05);6 h后,處理組松材線蟲體內(nèi)蛋白的質(zhì)量濃度急劇下降,發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理組尤為明顯,且極顯著地低于對照組(p<0.05)。由數(shù)據(jù)可知,3組處理組中,線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與對照組相比顯著下降(p<0.05),這是造成菌株NJSZ-13殺死松材線蟲的重要原因之一。

2.2 菌株NJSZ-13對松材線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響如表2所示,在整個處理時間內(nèi),SOD活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在0～12 h內(nèi),處理組松材線蟲體內(nèi)的超氧化物歧化酶活性均高于對照組。6 h時3組處理組高于對照組,差異顯著(p<0.05);在12 h時各處理組和對照組結(jié)果相近,無顯著性;在24、36 h時,3組處理組低于2組對照組,差異顯著(p<0.05)。

表2 不同處理的松材線蟲超氧化物歧化酶活性

2.3 菌株NJSZ-13對松材線蟲過氧化物酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)過氧化物酶(POD)活性的影響如表3所示,菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲體內(nèi)的過氧化物酶活性在整個處理時間段均低于對照組。0～12 h時,菌懸液處理與對照組無顯著差別,24、36 h時顯著降低(p<0.05)。發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理后,與對照組相比,POD活性在處理后6、12 h存在顯著差異,在24、36 h時有極顯著差異(p<0.05)。

表3 不同處理的松材線蟲過氧化物酶活性

2.4 菌株NJSZ-13對松材線蟲過氧化氫酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同時間對松材線蟲體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的影響如表4所示,菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲體內(nèi)的過氧化氫酶活性的變化趨勢與POD相近,在處理6 h時,處理組與對照組有顯著差異(p<0.05);6 h后,CAT活性急劇下降,與對照組形成顯著差異(p<0.05)。

表4 不同處理的松材線蟲過氧化氫酶活性

2.5 菌株NJSZ-13對松材線蟲谷胱甘肽酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)谷胱甘肽酶(GSH-Px)活性的影響如表5所示,菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲體內(nèi)谷胱甘肽酶活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。菌懸液處理后,谷胱甘肽酶活性在6、12 h時,與對照差異不顯著,24、36 h時則顯著低于對照(p<0.05)。發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理后,谷胱甘肽酶活性在6 h時高于對照,但差異不顯著,隨后急劇下降,與對照組形成顯著差異(p<0.05)。

2.6 菌株NJSZ-13對松材線蟲丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度的影響如表6所示,松材線蟲體內(nèi)丙二醛質(zhì)量摩爾濃度在菌株NJSZ-13處理后的變化區(qū)別于其他幾種物質(zhì),呈現(xiàn)出上升趨勢。菌懸液處理后的松材線蟲,體內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度在6、12、36 h時較對照略高,無顯著差別,24 h時顯著高于對照(p<0.05)。發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理后的松材線蟲體內(nèi)的MDA質(zhì)量摩爾濃度在6、24 h時與對照有顯著差異(p<0.05),在12 h與對照組均達(dá)到極顯著差異水平(p<0.05),在36 h時發(fā)酵液處理與對照差異不顯著,發(fā)酵濾液處理與對照極顯著(p<0.05)。

表5 不同處理的松材線蟲谷胱甘肽酶活性

表6 不同處理的松材線蟲丙二醛質(zhì)量摩爾濃度

2.7 菌株NJSZ-13對松材線蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響

菌株NJSZ-13在不同處理時間對松材線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)活性的影響如表7所示,其中對照組和3組處理組的線蟲體內(nèi),AchE活性變化大體一致,均呈下降趨勢。處理6 h時,菌懸液處理與對照無顯著差異,發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理較對照顯著降低(p<0.05);處理12 h時,菌懸液處理酶活性降低,與對照組差異不顯著,發(fā)酵液和發(fā)酵濾液較對照極顯著降低(p<0.05);處理24、36 h時,菌懸液酶活性顯著降低,發(fā)酵液和發(fā)酵濾液均極顯著降低(p<0.05)。

表7 不同處理的松材線蟲乙酰膽堿酯酶活性

3 討論與結(jié)論

經(jīng)菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲SOD和GSH-Px的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。2種物質(zhì)的活性在處理前期升高,表明細(xì)菌處理導(dǎo)致線蟲啟動防御機(jī)制,引起活性氧迸發(fā),產(chǎn)生大量超氧自由基和過氧化物,機(jī)體以提高體內(nèi)SOD和GSH-Px活性開啟自身免疫反應(yīng)。此后2種酶的活性下降,使線蟲體內(nèi)的氧自由基不能及時被清除,造成其抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)被破壞,最終導(dǎo)致線蟲死亡。隨著細(xì)菌處理時間的延長,線蟲另外2種保護(hù)性酶POD和CAT活性受到抑制,進(jìn)一步導(dǎo)致超氧自由基和過氧化物不斷積累。蔣春艷[27]研究發(fā)現(xiàn)SOD、POD、CAT 3種保護(hù)酶在黃曲條跳甲抵抗綠僵菌引起的氧化脅迫中發(fā)揮了重要作用。李會平等[28]發(fā)現(xiàn)在桑天牛對白僵菌的免疫作用中,SOD和POD是首先發(fā)生作用的酶系,CAT是繼上述兩種酶之后發(fā)生作用的酶系,其中POD所起作用更為重要。經(jīng)菌株NJSZ-13處理后,線蟲體內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度不斷上升,說明了線蟲脂質(zhì)過氧化程度不斷加重,其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能持續(xù)受損,可能最終導(dǎo)致線蟲的死亡。

線蟲體內(nèi)的大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)為參與各種代謝的酶類,所以可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度是一個重要的生理生化指標(biāo)。3組處理的松材線蟲體內(nèi),可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著低于對照,表明菌株NJSZ-13使松材線蟲體內(nèi)蛋白代謝受到嚴(yán)重影響。AchE是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵性酶,在神經(jīng)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用[29]。試驗中發(fā)現(xiàn),菌株NJSZ-13處理后,松材線蟲行動遲緩,反應(yīng)遲鈍,一段時間后蟲體僵直死亡。這與其體內(nèi)的AchE活性降低,導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)無法正常水解,造成線蟲神經(jīng)傳導(dǎo)受到影響有關(guān)。侯金麗等[30]發(fā)現(xiàn),松材線蟲體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵酶(TChE)的活性受到Sr18菌代謝產(chǎn)物的顯著抑制,造成線蟲體內(nèi)乙酰膽堿的大量積累,使突觸后膜長期處于興奮狀態(tài),導(dǎo)致神經(jīng)傳遞中斷,引起線蟲的中毒反應(yīng)。同時,翁群芳等[31]研究發(fā)現(xiàn),駱駝蓬提取物能抑制松材線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性,從而導(dǎo)致線蟲死亡。

在蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13處理松材線蟲的過程中可以發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液對松材線蟲的各項生理指標(biāo)影響最為明顯,這與前期試驗中發(fā)酵液對線蟲的致死率最高相一致。通過菌株處理后線蟲的各個生理效應(yīng)可以推測,菌株NJSZ-13對松材線蟲的致死作用是綜合性的,其中包括蛋白代謝、保護(hù)酶系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等方面的共同作用。在今后的研究中,可考慮從代謝組和轉(zhuǎn)錄組的角度,研究菌株處理后松材線蟲的重要代謝通路和關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量變化,以期找出菌株NJSZ-13對松材線蟲的關(guān)鍵致死機(jī)制。