聶梅，黃清鏵，胡彪，王慶福，梁磊

廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東省植物纖維綜合利用工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東省生物質(zhì)高值化利用工程實驗室，廣州市植物纖維綜合利用重點實驗室，藥食同源崖柏精油產(chǎn)業(yè)化研究工程中心，特色農(nóng)產(chǎn)品深加工產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新基地（廣州 510316）

甘蔗是溫帶和熱帶農(nóng)作物，其味甘、性寒，歸肺、胃經(jīng)；具有清熱解毒、生津止渴、和胃止嘔、滋陰潤燥等功效；主治口干舌燥，津液不足，小便不利，大便燥結(jié)，消化不良，反胃嘔吐，呃逆，高熱煩渴等[1]。甘蔗中含有豐富的糖分、水分，還含有各種維生素、脂肪、蛋白質(zhì)、有機酸、鈣、鐵等物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，甘蔗具有較強的抗炎、抗氧化、降血糖、正向調(diào)節(jié)血脂水平等功效[2-5]。近年來甘蔗產(chǎn)業(yè)面臨諸多瓶頸問題，如蔗糖產(chǎn)能下降市場行情低迷，全球蔗糖產(chǎn)業(yè)普遍不景氣，缺乏精深加工鏈等，甘蔗深加工成為國內(nèi)外近年來加工研究的熱點。甘蔗汁營養(yǎng)豐富，含有微生物生長所需的所有營養(yǎng)成分，是良好發(fā)酵原料，蔗汁經(jīng)發(fā)酵加工后可制備功能飲料、果酒、果醋等產(chǎn)品[6-8]，不僅拓寬甘蔗深加工多樣化產(chǎn)品開發(fā)，還豐富發(fā)酵飲品品種類型。

試驗前期利用復(fù)合益生菌協(xié)同發(fā)酵技術(shù)，發(fā)揮微生物協(xié)同效應(yīng)，優(yōu)化飲品風(fēng)味，生產(chǎn)兼具保健功能和獨特風(fēng)味的高端功能飲品[9-11]。但是由于甘蔗汁具有季節(jié)性，這制約著甘蔗汁發(fā)酵飲品的生產(chǎn)。為突破甘蔗汁原料的局限性，以甘蔗濃縮汁或紅糖為原料，經(jīng)過復(fù)原后評價其發(fā)酵性能。由于市面上部分甘蔗濃縮汁添加抗菌成分，這導(dǎo)致復(fù)原蔗汁發(fā)酵性能受到影響，紅糖加工過程經(jīng)過高溫熬煮等工藝，復(fù)原后紅糖水與甘蔗汁差異較大，顯著影響發(fā)酵性能。因此以甘蔗復(fù)原果汁的抗氧化活性和總酚含量為指標，研究甘蔗汁的濃縮工藝，以及濃縮蔗汁復(fù)原后的發(fā)酵性能評價，以期得到發(fā)酵性能良好的甘蔗濃縮汁，解決甘蔗果汁受季節(jié)性影響的局限性問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮甘蔗（廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所甘蔗種植基地）；植物乳桿菌；酵母菌；醋酸菌；沒食子酸、蘆丁、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等分析標準品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇、硝酸鋁、醋酸鉀、碳酸鈉，福林酚等（均為分析純試劑）。

1.2 方法

1.2.1 黃酮含量測定

黃酮含量參照SN/T 4592——2016《出口食品中總黃酮的測定》，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=0.41x+0.030 6，R2=0.99。樣品處理：將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物一致（13.8%）后，按標準曲線方法進行總酚含量測定。

1.2.2 總酚含量測定

總酚含量參照團體標準T/AHFIA 005——2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定》，并做相應(yīng)修改。準確吸取沒食子酸標準儲備液，用60%乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為0，20，50，100，200和300 mg/L的沒食子酸工作液。分別移取1.0 mL沒食子酸工作液于10 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚試劑，搖勻，加入2.5 mL 15% Na2CO3溶液，加水定容至刻度，搖勻，在40 ℃水浴60 min，測定其吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線y=0.005 7x+0.105，R2=0.996。樣品處理：將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物含量一致后，按標準曲線方法進行總酚含量測定。

1.2.3 抗氧化活性評價

1.2.3.1 DPPH自由基清除率

將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL的樣品加水至1.0 mL，與1.0 mL 0.4 mmol/L DPPH溶液、2 mL 60%乙醇混合均勻，室溫下靜置30 min，測定波長517 nm處的吸光度Ai。以等體積無水乙醇代替DPPH溶液測定樣品本底吸光度Aj，以等體積蒸餾水代替樣品溶液測定空白對照吸光度A0。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

1.2.3.2 ·OH自由基清除率

將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL的樣品加水至1.0 mL，加入2.0 mL 1.0 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL 1.0 mmol/L H2O2溶液、2.0 mL蒸餾水、2.0 mL 1.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，混合均勻，室溫下靜置30 min，測定波長510 nm處的吸光度Ai，以等體積蒸餾水代替H2O2溶液測定樣品本底吸光度Aj，以等體積蒸餾水代替多糖樣品溶液測定空白對照吸光度A0。按式（1）計算·OH清除率。

1.2.3.3 還原力

通過鐵氰化鉀法對還原力進行測定。將甘蔗濃縮汁稀釋到與原甘蔗汁可溶性固形物含量一致（13.8%）后，取0.2 mL樣品加水至1.0 mL，與1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液、1.0 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液混合均勻，在50 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入2.0 mL 10%三氯乙酸，按3 000 r/min離心10 min，取2.0 mL上清液加入2.0 mL蒸餾水、0.4 mL 0.3%三氯化鐵，混合均勻，在50℃水浴反應(yīng)10 min，測定700 nm波長處的吸光度A1，以等體積蒸餾水代替三氯化鐵溶液測定空白對照吸光度A2，還原力=A1-A2。

1.2.4 單因素試驗

新鮮的甘蔗，洗凈，榨汁，經(jīng)孔徑0.48 mm濾網(wǎng)過濾，以去除較大顆粒，獲得的甘蔗果汁在真空度0.05 MPa下進行真空濃縮。研究不同濃縮溫度、濃縮轉(zhuǎn)速和濃縮產(chǎn)物可溶性固形物含量對濃縮汁總酚含量和DPPH自由基清除率的影響。各因素參數(shù)分別為濃縮溫度（50，60，70，80和90 ℃）、轉(zhuǎn)速（30，40，50，60和70 r/min），濃縮汁可溶性固形物含量（40%，50%，60%，70%和80%）。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9(33)正交試驗設(shè)計，以黃酮含量（Y1）、總酚含量（Y2）和抗氧化活性（Y3）為綜合評價指標，因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

采用甘蔗汁濃縮產(chǎn)物的總黃酮含量、總酚含量和抗氧化活性3個指標綜合加權(quán)評分法進行正交試驗分析，由于3個評價指標對甘蔗濃縮汁的貢獻不一樣，因此，將黃酮含量、總酚含量和抗氧化性能的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為30%，30%和40%，綜合評分=（總黃酮含量/甘蔗濃縮汁最高總黃酮含量）×30%+（總酚含量/甘蔗濃縮汁最高總酚含量）×30%+（清除率/甘蔗濃縮汁最高清除率）×40%，以綜合評分進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 甘蔗濃縮汁對益生菌發(fā)酵性能的影響

將甘蔗濃縮汁和甘蔗原汁稀釋至可溶性固形物含量8%，pH自然（pH 5.15~5.45），在115 ℃滅菌30 min，即得濃縮汁培養(yǎng)基和原汁培養(yǎng)基。將植物乳桿菌以1%的接種量分別接種濃縮汁和原汁培養(yǎng)基中。植物乳桿菌組置于暗處，在37 ℃靜置發(fā)酵12 h，酵母菌置于30 ℃，以120 r/min，振蕩培養(yǎng)12 h。分別在濃縮汁和原汁培養(yǎng)基中添加4%無水乙醇（0.22 μm過濾器過濾除菌），接入1%醋酸菌種子液，在30 ℃，以120 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h。通過檢測發(fā)酵產(chǎn)物的菌落總數(shù)、總酸和抗氧化性能指標，比較甘蔗濃縮汁與甘蔗原汁的發(fā)酵性能。

1.2.7 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)測定參照GB 4789.2——2022《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。其中，植物乳桿菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基涂平板，酵母菌采用YPD瓊脂培養(yǎng)基涂平板，醋酸菌采用醋酸菌培養(yǎng)基涂平板（葡萄糖10 g、酵母粉10 g、碳酸鈣5 g、瓊脂粉20 g、水1 L、pH 5.5）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用Excel計算并作圖。采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1（A）濃縮溫度對甘蔗濃縮汁抗氧化和總酚含量的影響結(jié)果得出，溫度大于60 ℃時，甘蔗濃縮汁的多酚含量和抗氧化活性越來越低，濃縮溫度在50 ℃和60 ℃時總酚含量沒有明顯變化，但是采用50 ℃進行濃縮，濃縮時間顯著延長。由圖1（B）濃縮轉(zhuǎn)速對甘蔗濃縮汁抗氧化和總酚含量的影響結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)速的提高，總酚含量和抗氧化隨之提高，轉(zhuǎn)速達到60 r/min時，總酚含量最高，抗氧化活性在60 r/min時最好，提高轉(zhuǎn)速略有所降低。圖1（C）顯示，濃縮汁可溶性固形物含量從40%~80%，按比例復(fù)原后蔗汁總酚含量沒有明顯變化，抗氧化活性則在可溶性固形物含量60%時達到最高。因此，根據(jù)單因素結(jié)果得出，最適濃縮溫度60 ℃、最適濃縮轉(zhuǎn)速60 r/min、最適濃縮汁可溶性固形物含量60%。

圖1 單因素試驗結(jié)果

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素的基礎(chǔ)上選取濃縮溫度、濃縮轉(zhuǎn)速、濃縮汁可溶性固形物含量3個因素，采用濃縮汁產(chǎn)物復(fù)原到原甘蔗汁可溶性固形物含量一致的黃酮、總酚含量和DPPH抗氧化活性評價3個指標綜合加權(quán)評分法進行正交試驗分析。由表2可知，綜合評分最高的組合是A2B3C3，即濃縮溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速70 r/min、濃縮汁可溶性固形物含量70%。由極差可以看出，因素A濃縮溫度的極差最大是主要影響因素，其次是因素C可溶性固形物含量，因素B濃縮轉(zhuǎn)速影響最小，故各因素對甘蔗濃縮汁綜合評分的影響程度依次為A＞C＞B。由表3方差分析可知，濃縮溫度對甘蔗濃縮汁綜合評分有顯著影響（P＜0.05），濃縮轉(zhuǎn)速與濃縮汁可溶性固形物對評分沒有顯著性差異。這可能是因為溫度對抗氧化成分包括VC、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）含量及活性變化影響較大[12]而導(dǎo)致。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

2.3 濃縮汁與甘蔗原汁成分比較

根據(jù)正交試驗結(jié)果，采用最優(yōu)工藝，即濃縮溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速70 r/min、濃縮至可溶性固形物含量70%，將濃縮汁和甘蔗汁稀釋至可溶性固形物含量為8%，比較濃縮汁和甘蔗汁的成分含量及抗氧化活性，結(jié)果如表4所示。甘蔗濃縮汁的總黃酮含量比較高，但是總酚含量卻低于甘蔗汁?？寡趸钚越Y(jié)果顯示，濃縮汁對DPPH自由基的清除率顯著高于甘蔗汁，而羥自由基的清除能力和還原力卻無明顯差異。經(jīng)過濃縮加工后，濃縮汁的抗氧化活性高于甘蔗汁，可能是甘蔗汁在濃縮過程糖類與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，得到抗氧化活性較強的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[13]。

表4 濃縮汁與甘蔗原汁成分與抗氧化性能比較結(jié)果

2.4 益生菌發(fā)酵性能評價

將經(jīng)過益生菌發(fā)酵后發(fā)酵產(chǎn)物10倍系列稀釋后，將一定濃度的稀釋液定量地接種到瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，計算菌落總數(shù)，結(jié)果如表5所示。甘蔗濃縮汁和甘蔗原汁發(fā)酵植物乳桿菌活菌總數(shù)分別為（2.71±0.13）×1010CFU/mL和（2.65±0.09）×1010CFU/mL；酵母菌存活數(shù)分別為（2.33±0.07）×108CFU/mL和（2.36±0.09）×108CFU/mL；醋酸菌存活數(shù)分別為（4.21±0.15）×107CFU/mL和（4.17±0.19）×107CFU/mL。通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)甘蔗濃縮汁與甘蔗原汁對益生菌的發(fā)酵性能沒有顯著性差異，說明該工藝濃縮得到的甘蔗濃縮汁可替代甘蔗原汁進行益生菌發(fā)酵。

表5 濃縮汁與甘蔗原汁發(fā)酵性能評價

3 結(jié)論

采用甘蔗汁濃縮產(chǎn)物的總黃酮含量、總酚含量和抗氧化活性3個指標綜合加權(quán)評分法進行正交試驗分析優(yōu)化，確定最佳提取條件：濃縮溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速70 r/min、濃縮汁可溶性固形物含量70%。此工藝得到的濃縮汁按比例復(fù)原后，其總黃酮含量比甘蔗原汁高，但是總酚含量卻低于甘蔗汁，濃縮汁對DPPH自由基的清除率顯著高于甘蔗汁，而羥自由基的清除能力和還原力卻無明顯差異。通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)甘蔗濃縮汁與甘蔗原汁對益生菌的發(fā)酵性能沒有顯著性差異。該方法為甘蔗汁發(fā)酵產(chǎn)業(yè)提供原料支撐，為進一步開發(fā)功能性益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品提供保障。