謝繼輝

摘 要：本文研究了配方奶粉中核苷酸含量在高效液相色譜測(cè)定方法中的色譜條件優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)比較了改變流動(dòng)相中甲醇含量、改變流動(dòng)相pH值和不同色譜柱的分離效果。研究發(fā)現(xiàn)改變流動(dòng)相的pH值對(duì)分離效果影響最大，不同的色譜柱的分離效果也有影響。選擇適宜的色譜柱并找到對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相pH值，可取得較好的分離效果。

關(guān)鍵詞：嬰幼兒配方乳粉；核苷酸；色譜柱

Abstract： This paper studied the optimization of chromatographic conditions in the HPLC method for the determination of nucleotide content in formula milk powder. The separation effects of changing the ratio of organic phase in mobile phase， changing the pH value of mobile phase and different chromatographic columns were compared. It is found that changing the pH value of the mobile phase has the greatest impact on the separation effect， and different chromatographic columns also have an impact on the separation effect. The better separation effect can be obtained by selecting suitable chromatographic column and finding the corresponding mobile phase pH value.

Keywords： infant milk powder; nucleotide; chromatographic column

核苷酸是由含氮雜環(huán)堿基、五碳糖和磷酸基團(tuán)組成的一類化合物。生物的遺傳信息存儲(chǔ)于DNA和RNA中，而核苷酸是DNA和RNA的合成前體。此外，核苷酸還具有代謝調(diào)節(jié)、組成輔酶、參與糖原和糖蛋白的合成過程。遺傳信息傳遞成功，對(duì)人類生命活動(dòng)極其重要。研究表明，喂養(yǎng)強(qiáng)化核苷酸配方奶粉的嬰幼兒在體重、身長、頭圍、腸道耐受性等指標(biāo)上，與母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒數(shù)據(jù)更為接近。另有研究顯示核苷酸還具有降低腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)生率、提高免疫力、改善腸道微生態(tài)、改善嬰兒血脂組成、增強(qiáng)嬰幼兒對(duì)疫苗的反應(yīng)等功能。

由于核苷酸可在人體內(nèi)合成，對(duì)于成年人來說無需專門補(bǔ)充核苷酸。但嬰幼兒身體生長速度快，身體合成機(jī)能發(fā)育還不完善，故其體內(nèi)核苷酸的合成速度不能滿足其生長的需求。目前，嬰幼兒配方奶粉多以牛乳、羊乳為原料制成。牛乳和羊乳中核苷酸的濃度和種類與人類母乳有明顯差異。母乳是嬰兒的最佳食物，含有較高濃度的核苷酸，為使嬰幼兒配方奶粉盡可能地接近母乳，需要在其中額外添加核苷酸。自1965年起，日本、歐盟、美國先后允許將核苷酸添加在嬰幼兒配方食品當(dāng)中?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880—2012）[1]規(guī)定，核苷酸作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，可被用于嬰幼兒配方食品，含量范圍為0.12～0.58 g·kg-1（以核苷酸總量計(jì)）。嬰幼兒乳粉中通常使用的核苷酸有5種，分別是胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）和腺嘌呤核苷酸（AMP）。目前在中國的市場(chǎng)上，半數(shù)以上的嬰幼兒配方奶粉的產(chǎn)品的營養(yǎng)成分表上都標(biāo)示添加了核苷酸。

由于嬰幼兒配方奶粉的質(zhì)量關(guān)乎下一代的健康成長，我國市場(chǎng)監(jiān)管部門在每年的食品抽檢中對(duì)其非常重視，所抽檢的樣品要按照抽樣細(xì)則指定方法按營養(yǎng)成分表逐項(xiàng)檢驗(yàn)。文獻(xiàn)報(bào)道的核苷酸檢測(cè)方法有離子色譜法[2]、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法[3-5]、液相色譜-質(zhì)譜法[6]等，但在近年的食品抽檢中，嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量的測(cè)定指定的檢驗(yàn)方法是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測(cè)定》（GB 5413.40—2016）[7-9]。該方法的原理是用水提取樣品，調(diào)節(jié)pH值沉淀蛋白質(zhì)后，借助高效液相色譜儀檢測(cè)。然而，在實(shí)際的檢測(cè)過程中，往往發(fā)現(xiàn)用該方法得出的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)高于實(shí)際值，其原因是色譜分析中有雜質(zhì)沒有被完全分離，導(dǎo)致檢出值偏高。故本研究主要考察影響分離效果的主要因素，以優(yōu)化此方法，使得檢驗(yàn)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP），上海安譜；質(zhì)控樣品：QC-IP-714嬰兒配方乳粉中核苷酸定量分析質(zhì)控樣品，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；冰乙酸、磷酸氫二鉀，國藥；四丁基硫酸氫銨，MACKLIN。

高效液相色譜儀，島津LC-20AD，配二極管陣列檢測(cè)器SPD-M20A，工作站軟件LabSolutions；純水機(jī)，ELGA GLXXXDIM2；電子天平，METTLER TOLEDO XSE204；pH計(jì)，METTLER TOLEDO S220。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

①標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMP、AMP、UMP各稱取10 mg，GMP和IMP各稱取5 mg，用純水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容。此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為CMP、AMP、UMP各100 μg·mL-1；GMP、IMP各50 μg·mL-1。分別吸取此混合溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL，加超純水定容至50 mL，此為核苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。②磷酸鹽緩沖液。稱取1.36 g磷酸二氫鉀，0.475 3 g四丁基硫酸氫銨，加入接近1 L的純水溶解，用磷酸氫二鉀溶液精細(xì)調(diào)節(jié)pH值至3.2，用水定容到1 000 mL。

1.2.2 樣品處理

稱取奶粉試樣5 g于錐形瓶中，加入20 mL溫水（50～60 ℃）充分溶解，冷卻至室溫后用醋酸溶液調(diào)試樣溶液至pH=4.1，移入50 mL容量瓶中，定容，濾紙過濾，所得濾液用0.45 μm濾膜過濾備用。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）改變流動(dòng)相中有機(jī)相比例對(duì)分離效果的影響。取樣品乳粉按1.2.2處理后，使用液相色譜檢測(cè)，色譜條件依照1.2.4設(shè)置，使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相pH值按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測(cè)定》（GB 5413.40—2016）規(guī)定調(diào)節(jié)至pH=3.20左右。僅改變流動(dòng)相中甲醇含量，分別以甲醇1%、3%、7%和10%的不同比例進(jìn)行檢測(cè)。通過工作站軟件LabSolutions計(jì)算目標(biāo)峰分離度。

（2）流動(dòng)相pH值對(duì)分離效果的影響。樣品乳粉按1.2.2處理后，使用液相色譜檢測(cè)，色譜條件依照1.2.4設(shè)置，僅改變流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖液的pH值。按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定配制磷酸鹽緩沖液，之后用磷酸和磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)pH值至2.9、3.0、3.1、3.2和3.3左右。流動(dòng)相中甲醇設(shè)置為4%。更換流動(dòng)相后充分平衡后再進(jìn)樣。

（3）不同色譜柱分離效果研究。樣品乳粉按1.2.2處理后，分別使用不同型號(hào)色譜柱，并調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值至2.9、3.0、3.1、3.2、3.3左右進(jìn)行檢測(cè)分析。尋找最佳分離條件。

1.2.4 色譜條件

流動(dòng)相水相：磷酸鹽緩沖液；流動(dòng)相有機(jī)相：甲醇；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 改變流動(dòng)相中甲醇含量對(duì)分離效果的影響分析

一般來說，目標(biāo)峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于1.5，被認(rèn)為分離效果較好。本實(shí)驗(yàn)中，使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，流動(dòng)相pH值調(diào)節(jié)至3.241的情況下，UMP與GMP的分離效果不佳，即GMP的分離度明顯小于1.5。且改變流動(dòng)相中甲醇比例后，目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰出峰時(shí)間變化基本同步，不能提高分離效果，見表1。

2.2 流動(dòng)相pH值對(duì)分離效果的影響分析

由圖1可知，當(dāng)流動(dòng)相pH=3.126時(shí)，AMP與雜質(zhì)峰融合，不能分離，導(dǎo)致AMP檢出值偏高。圖2為流動(dòng)相pH=3.011時(shí)圖譜，可見AMP出峰時(shí)間提前，與雜質(zhì)峰分離。但GMP與IMP之間有一雜質(zhì)峰，對(duì)比圖1與圖2可發(fā)現(xiàn)，如pH值更低，該雜質(zhì)峰將與IMP融合，導(dǎo)致IMP檢出值偏高。反之，如pH值增加，該雜質(zhì)峰可能與GMP融合，也會(huì)導(dǎo)致檢出值偏高。其原因是當(dāng)pH值較高時(shí)，各核苷酸出峰時(shí)間均會(huì)延后，但延后程度各不相同，其中腺嘌呤核苷酸（AMP）出峰時(shí)間變化其他核苷酸更為明顯。利用這種規(guī)律可找到各核苷酸能夠正好分離的流動(dòng)相pH條件。

表2為使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，在不同流動(dòng)相pH值下的質(zhì)控樣品回收率，此結(jié)果顯示最佳pH條件在3.0左右，而且pH值僅僅改變0.1都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，因流動(dòng)相pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，所以檢驗(yàn)前平衡色譜柱需要花費(fèi)很長時(shí)間。且流動(dòng)相在配制時(shí)需要特別注意，要待試劑溶解充分后再調(diào)節(jié)pH值。進(jìn)樣時(shí)要注意儀器的使用環(huán)境，避免晝夜溫差過大使流動(dòng)相pH值產(chǎn)生變化。

2.3 色譜柱對(duì)分離效果的分析

使用不同色譜柱，在不同pH值流動(dòng)相條件下對(duì)同一樣品的分析結(jié)果顯示，不同色譜柱的分離效果有明顯不同，不同色譜柱對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相最佳pH值也不同。每種色譜柱表現(xiàn)最好的pH值和對(duì)應(yīng)回收率見表3。從結(jié)果看，一般常用色譜柱，如果找到合適的pH值（多在3.0左右），都可以把回收率控制在110%以內(nèi)，可以認(rèn)為滿足正常檢驗(yàn)需求。但不同色譜柱對(duì)本實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相條件（低pH值、高水相、含表面活性劑）的耐受性不同，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有些色譜柱表現(xiàn)不穩(wěn)定，運(yùn)行時(shí)間稍長即出現(xiàn)出峰時(shí)間變化，分離度降低等現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，嬰幼兒配方奶粉中核苷酸的分離中最大的影響因素是流動(dòng)相的pH值、其次是色譜柱的選擇以及兩者的匹配?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測(cè)定》（GB 5413.40—2016）標(biāo)準(zhǔn)中推薦的流動(dòng)相pH=3.20略高，檢測(cè)時(shí)可以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)具體條件調(diào)低一些。同理，也可以把pH值調(diào)高，pH值調(diào)高后，AMP出峰時(shí)間相比其他4個(gè)核苷酸延后更明顯，也可以達(dá)到分離效果。但此條件下核苷酸出峰時(shí)間延后，色譜時(shí)間太長。通常為縮短色譜時(shí)間，可采用梯度洗脫，但核苷酸對(duì)色譜條件極為敏感，即使采用梯度洗脫，還是需要一個(gè)相當(dāng)長的平衡時(shí)間，否則重現(xiàn)性不好。故綜合看來，低pH值分離最為合適。建議在首次開展檢測(cè)時(shí)，對(duì)選定的色譜柱，從pH=2.9～3.0開始摸索最適合的色譜條件。

本方法中流動(dòng)相含離子對(duì)試劑，流動(dòng)相pH值比較低，有機(jī)相含量也很低，這種條件對(duì)色譜柱傷害較大，使用幾次后，色譜柱柱效就會(huì)明顯下降，這也是分離效果差的一個(gè)常見原因。

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