唐梅　孫富　何 聰　盧宏琮　黃 鸝　夏秀忠　唐忠平　鐘志堅(jiān)　陸桂耀

關(guān)鍵詞：廣西；常規(guī)香稻；SSR 熒光標(biāo)記；毛細(xì)管電泳；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

隨著近年來消費(fèi)者對(duì)稻米品質(zhì)要求的不斷提高，優(yōu)質(zhì)香稻品種以飯香濃郁和營養(yǎng)豐富等優(yōu)異品質(zhì)越來越受到市場的青睞。從1980 年我國開始進(jìn)行香稻育種，目前已經(jīng)育成一批優(yōu)質(zhì)香稻品種[1]。廣西在2000 年以來也相繼育成了‘八桂香[2]、‘田東香[3]、‘玉香占[4]、‘三香628[5]等香稻品種。但由于廣西自育香稻品種的優(yōu)質(zhì)米達(dá)標(biāo)率低、產(chǎn)量低和抗病性差等原因，推廣的香稻品種數(shù)量和質(zhì)量滿足不了市場需求[6]。為了滿足當(dāng)前消費(fèi)者對(duì)稻米品質(zhì)好聞、好吃、好看、高營養(yǎng)的理想追求，因此廣西加快了優(yōu)質(zhì)常規(guī)香稻新品種的審定。而在香稻育種中，有香味基因的親本來源較少，且遺傳背景較近，從而使得香稻品種的遺傳多樣性較低[1]。通過對(duì)香稻品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，理清香稻品種的親緣關(guān)系，加強(qiáng)香稻品種的遺傳特性研究，可為選育廣西優(yōu)質(zhì)香稻品種提供技術(shù)參考。

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)分析水稻品種遺傳多樣性是目前應(yīng)用最廣泛的手段之一，其中簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat， SSR）標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、操作方便，可利用SSR 標(biāo)記對(duì)香稻進(jìn)行遺傳多樣性分析[7-13]。唐傲等[9]利用60 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)國內(nèi)外370 份香稻材料的遺傳多樣性進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參試材料可分為秈粳兩大類。朱勇良等[10]利用40 對(duì)SSR 引物對(duì)太湖稻區(qū)和國內(nèi)其他地區(qū)的39 個(gè)香稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，試驗(yàn)結(jié)果基本反映了不同品種間的親緣關(guān)系。趙鳳民等[13]用50 對(duì)SSR 分子標(biāo)記對(duì)42 份黑龍江省香稻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果說明香稻資源的區(qū)域特征明顯，各類群中的香稻資源親緣關(guān)系較近。

聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的方法步驟繁多，耗時(shí)耗力且靈敏度低。而SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)可直接讀取目的片段準(zhǔn)確大小，大大降低了分辨擴(kuò)增產(chǎn)物的難度，提高了研究的效率和準(zhǔn)確性。利用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)用于香稻特別是涉及廣西常規(guī)香稻品種遺傳多樣性的研究還未見報(bào)道。本研究采用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)，利用48 對(duì)SSR 分子標(biāo)記對(duì)廣西審定的24 個(gè)常規(guī)香稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期分析廣西常規(guī)香稻品種間的遺傳多樣性，闡明廣西常規(guī)香稻的遺傳多樣性特點(diǎn)，為廣西常規(guī)香稻品種的遺傳基礎(chǔ)拓展、品種選育和鑒定提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以通過廣西審定的24 個(gè)常規(guī)香稻品種為材料（表1）。種子由廣西壯族自治區(qū)種子管理站提供。

1.2 方法

1.2.1 廣西常規(guī)香稻品種DNA 的提取 將香稻種子發(fā)芽7 d 后，剪取新鮮葉片，采用CTAB 法提取幼苗葉片中的DNA。

1.2.2 SSR 熒光引物及PCR 反應(yīng) 48 對(duì)SSR 核心標(biāo)記引物由農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1433—2014）推薦，熒光引物由上海生工生物公司合成。12 μL的SSR 反應(yīng)體系包括2×PCR Master Mix 5 μL，ddH2O 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1 μL 。PCR 反應(yīng)在T100 PCR 儀（BIO-RAD， USA）上進(jìn)行，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫。

1.2.3 產(chǎn)物分析 取PCR 產(chǎn)物0.3 μL、分子量內(nèi)標(biāo)0.5 μL 和去離子甲酰胺9.5 μL 混合加入PCR板，95 ℃變性5 min，迅速冷卻到4 ℃后離心，在ABI3730XL DNA 遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并用Data Collection 軟件收集電泳原始數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Genemapper 軟件分析原始數(shù)據(jù)，計(jì)算擴(kuò)增片段大小。按照毛細(xì)管電泳遷移位置，用1 和0 分別代表檢測到擴(kuò)增片段的有無，建立原始數(shù)據(jù)表。利用POPGENE 1.32 軟件統(tǒng)計(jì)觀測等位基因數(shù)（Na）、Shannons 信息指數(shù)（I）、有效等位基因數(shù)（Ne），利用NTSYS 2.10e 軟件對(duì)各品種進(jìn)行遺傳相似性分析，采用UPGMA（unweighted pairgroup method? with average）法對(duì)各品種進(jìn)行聚類分析，利用PIC-CAL 計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 48 對(duì)SSR 標(biāo)記的多態(tài)性分析

本研究利用覆蓋水稻12 條染色體的48 對(duì)SSR 引物對(duì)24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種進(jìn)行等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannons指數(shù)（I）和多態(tài)信息含量值（PIC）檢測（表2）。結(jié)果表明，48 個(gè)SSR 位點(diǎn)在24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種中檢測到170 個(gè)等位基因，等位基因數(shù)（Na）的變化幅度為1～9 個(gè)，平均為3.54 個(gè)，說明這些引物可適于24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種的遺傳多樣性檢測。有效等位基因數(shù)（Ne）的變化幅度為1～4.5534，平均為2.0736，其中有效等位基因數(shù)最高是RM21，其指數(shù)為4.5534，其次是RM481、RM493 和RM258，其指數(shù)分別為4.5000、4.4825和4.1739。說明這4 對(duì)引物有較高的檢測效率。Shannons 指數(shù)（I）的變化幅度為0～1.7942，平均為0.7726。多態(tài)信息含量（PIC）大于0.50 的位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)，在0.25～0.50 為中度多態(tài)位點(diǎn)，小于0.25 時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)[14]。24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種的PIC 值的變化范圍為0～0.7541，平均為0.3732，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，說明24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種具有一定的遺傳變異。

2.2 遺傳相似性分析

使用NTSYS 2.10 軟件計(jì)算24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種的遺傳相似性系數(shù)（表3），由表3 可知，24 個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)介于0.3299～0.9600 之間，平均值為0.5790，其中‘三香628（11）與‘農(nóng)香32（19）遺傳相似系數(shù)最小，為0.3299，說明這2 個(gè)品種遺傳基礎(chǔ)差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；‘萬香696（14）與‘廣糧香2 號(hào)（15）、‘萬香696（14）與‘糧發(fā)香絲（16）、‘廣糧香2號(hào)（15）與‘糧發(fā)香絲（16）之間的遺傳相似性系數(shù)大， 其數(shù)值分別為0.9600 、0.9293 和0.9216，說明這幾個(gè)品種遺傳基礎(chǔ)差異較小，親緣關(guān)系接近。

2.3 聚類分析

在遺傳相似性系數(shù)的基礎(chǔ)上采用UPGMA 法對(duì)24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種進(jìn)行聚類分析（圖1），在遺傳相似性系數(shù)0.504 處分為三大群類。第Ⅰ大類包括‘八桂香（1）和‘農(nóng)香32（19）2 個(gè)品種，說明這2 個(gè)品種遺傳背景較為接近；第Ⅲ大類包括‘早香一號(hào)（2）、‘玉香占（4）和‘家福香1 號(hào)（10）3 個(gè)品種，說明這3 個(gè)品種具有相近的遺傳背景，與其他品種遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；其余19 個(gè)品種被分到第Ⅱ大類。進(jìn)一步遺傳分析表明，第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)0.624 處又可分為4個(gè)亞類，第ⅰ亞類只有‘桂香2 號(hào)（3）1 個(gè)品種；第ⅲ亞類有‘三香628（11）、‘桂香99（21）和‘桂香18（23）3 個(gè)品種；第ⅳ亞類只有‘柳豐香占（9）1 個(gè)品種；剩余14 個(gè)品種劃分到第ⅱ亞類。本研究基本反映了24 個(gè)常規(guī)香稻品種的親緣關(guān)系。

2.4 SSR 指紋圖譜的構(gòu)建

從48 對(duì)標(biāo)記中篩選出14 對(duì)等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、Shannons 指數(shù)和PIC 值較高的標(biāo)記，根據(jù)檢測到的引物等位基因差異，建立24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種的指紋圖譜。對(duì)14 個(gè)標(biāo)記的擴(kuò)增片段按分子量大小排列，并進(jìn)行數(shù)字編碼（表4）。按表4 順序?qū)?4 對(duì)標(biāo)記對(duì)應(yīng)的編碼組合，每個(gè)品種可得到唯一的數(shù)字編碼，組成每個(gè)品種的DNA 指紋圖譜（表5）。如‘三香628（11）的SSR 指紋編碼如下，毛細(xì)管電泳檢測到14 個(gè)標(biāo)記在‘三香628（11）中的擴(kuò)增片段大小（bp）為192/192、148/148、169/169、194/194、170/170、179/179、162/162、147/147、136/136、263/263、148/148、186/186、106/106、164/164，轉(zhuǎn)換成28位的指紋數(shù)字代碼為1122 5511 2244 4411 33663333 3311，其中第1、第2 位的“1、1”表示標(biāo)記RM583 在‘三香628（11）中的擴(kuò)增片段（192/192）在其多態(tài)性片段中2 個(gè)片段排第1 位，第3、第4 位的“2、2”表示標(biāo)記RM71 的2 個(gè)擴(kuò)增片段（148/148）在其多態(tài)性片段中2 個(gè)片段排第2 位（表4），其余24 位類推。

3 討論

廣西香稻的種植歷史比較悠久[6]，早在南宋時(shí)靖西香糯就被列為朝廷貢品，目前仍是馳名中外的優(yōu)良品種。但是由于近年來廣西市場上可用的香稻品種不多，無法滿足消費(fèi)者對(duì)香稻的需求。因此加快廣西香稻品種的選育和推廣對(duì)廣西香稻產(chǎn)業(yè)有著十分重要的意義。而研究廣西常規(guī)香稻品種的遺傳多樣性，分析香稻品種之間的親緣關(guān)系，挖掘和利用香稻的優(yōu)異基因，可為廣西優(yōu)質(zhì)常規(guī)香稻品種選育提供技術(shù)參考。

已有的水稻品種遺傳多樣性研究中，SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物主要由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[15-17]，較難準(zhǔn)確讀出擴(kuò)增片段大小，并且整合不同試驗(yàn)批次和不同膠板的數(shù)據(jù)是個(gè)難題，容易出現(xiàn)人為的誤讀或錯(cuò)讀。SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測可直接讀出擴(kuò)增的目標(biāo)片段大小，檢測數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確[18-20]，便于遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)整合及分析。

本研究利用國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1433—2014）推薦的48 對(duì)SSR 引物，應(yīng)用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)對(duì)24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種進(jìn)行遺傳多樣性，可準(zhǔn)確有效地分析24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種遺傳多樣性。結(jié)果表明，在48 個(gè)SSR 位點(diǎn)上檢測到等位基因數(shù)170 個(gè)，等位基因數(shù)變化幅度為1～9 個(gè)，平均為3.54 個(gè)；比云南地方香稻品種[21]檢測到的平均等位基因5.44 個(gè)和黑龍江香稻[13]檢測到的平均等位基因4.08 個(gè)低。PIC 值的變化范圍為0～0.7541，平均值為0.3732，比云南地方香稻[21]的0.4300 和黑龍江香稻[13]的0.4649 低。說明廣西審定的常規(guī)香稻品種的遺傳背景比較接近，其遺傳多樣性不夠豐富。這與陳遠(yuǎn)孟等[22]的研究結(jié)果相似。

本研究利用NTSYS 2.10 軟件計(jì)算24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種的遺傳相似性系數(shù)，結(jié)果顯示24 個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)介于0.3299～0.9600 之間，平均為0.5790，低于太湖地區(qū)香稻品種的0.6400[10]，但高于云南地區(qū)香稻的0.4700[21]，進(jìn)一步說明廣西香稻品種具有一定的遺傳多樣性，但不夠豐富。在遺傳相似性系數(shù)的基礎(chǔ)上采用UPGMA 法對(duì)24份廣西常規(guī)香稻品種進(jìn)行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在遺傳相似性系數(shù)0.504 處24 個(gè)品種可分為三大群類，第Ⅰ大類包括2 個(gè)品種，第Ⅱ大類包括19 個(gè)品種，第Ⅲ大類包括3 個(gè)品種。而第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)0.624 處又可分為4 個(gè)亞類。聚類分析結(jié)果表明，雖然三大類群間部分品種存在一定遺傳差異，但遺傳多樣性還不夠豐富，其原因可能是廣西香稻種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較窄，且育種單位的親本材料遺傳背景相近[22]。因此在育種的親本選擇上可引入國內(nèi)外地緣關(guān)系較遠(yuǎn)和遺傳背景差異較大的香稻種質(zhì)資源。

DNA 指紋圖譜具有特異性，比表型鑒定更能準(zhǔn)確地鑒定品種（系），可為品種選育和鑒定提供參考[23]。本研究利用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳對(duì)24 個(gè)廣西香稻品種進(jìn)行SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測，從48 對(duì)SSR 引物中篩選出14 對(duì)多態(tài)性較好的SSR 構(gòu)建了24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種的DNA 指紋圖譜?？赏耆珜?4 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種區(qū)別開來，適于24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種的品種鑒定。本研究建立的24 個(gè)廣西常規(guī)香稻品種DNA指紋圖譜，可大幅提高24 個(gè)香稻品種鑒定的準(zhǔn)確度，對(duì)廣西香稻品種的鑒定和保護(hù)具有現(xiàn)實(shí)意義。

雖然廣西香稻品種具有一定的遺傳多樣性，但由于其親本來源較單一，遺傳基礎(chǔ)狹窄。因此要培育更好的香稻品種或進(jìn)行品種改良，應(yīng)多引進(jìn)國內(nèi)外豐富的香稻資源，挖掘更多的優(yōu)異基因?qū)氲綇V西香稻品種中，以拓寬廣西香稻品種的遺傳基礎(chǔ)，從而培育更好更優(yōu)異的知名香稻品種，打響廣西香米品牌。本研究結(jié)果可為廣西香稻品種的育種親本選配和開發(fā)新的遺傳資源提供參考。