劉勇 龔林忠 王富榮 王會良 艾小艷 朱煒 張楊 何華平

摘要 流膠病在湖北‘天仙紅桃樹上發(fā)生嚴重。為明確引起‘天仙紅桃流膠病的病原，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及柯赫氏法則對采集的病害樣品進行了病原菌鑒定。結(jié)果表明，獲得的分離菌株JSZ01的形態(tài)學(xué)特征與小新殼梭孢Neofusicoccum parvum基本一致。BLAST比對結(jié)果顯示，分離菌株JSZ01的ITS、TEF1-α和β-tubulin 基因序列與N.parvum的相似性在99.2%～100%，在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中JSZ01與小新殼梭孢的類群處于同一分支。JSZ01接種健康桃樹枝條5 d后接種部位出現(xiàn)潰瘍流膠癥狀，與田間癥狀一致。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、序列分析以及致病性測定結(jié)果，將‘天仙紅桃樹流膠病的病原菌鑒定為N.parvum。

關(guān)鍵詞 天仙紅桃;?流膠病;?病原菌鑒定;?小新殼梭孢

中圖分類號： S 436.621

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022002

Abstract Gummosis is a wide spread disease on ‘Tianxianhong peach tree in Hubei province. To identify the pathogen causing peach gummosis， the pathogenic fungus JSZ01 from the diseased twigs was isolated and purified. The morphological and molecular identification of JSZ01 was conducted. The pathogenicity of JSZ01 was confirmed according to Kochs rule. The results indicated that the morphological characteristics of JSZ01 were in agreement with Neofusicoccum parvum. BLAST analysis showed that the rDNA-ITS， TEF1-α and β-tubulin sequences had 99.2% to 100% identity with those of N.parvum. Phylogenetic analysis showed JSZ01 was attributed to the same branch with N.parvum in phylogenetic tree. After five days， the inoculated peach twigs exhibited necrotic lesions and secreted gum from the lesions， which were highly similar to the symptoms observed in the field. Based on the morphological characteristics， sequences analysis and pathogenicity tests， the pathogen that causing gummosis of ‘Tianxianhong peach was identified as N.parvum.

Key words ‘Tianxianhongpeach;?gummosis;?pathogen identification;?Neofusicoccum parvum

桃Prunus persica是湖北省重要栽培水果，2019年全省桃種植面積5.5萬 hm 2，產(chǎn)量86.5萬t，生產(chǎn)規(guī)模居全國第六位［1］?！煜杉t桃是一種湖北地方特色新品種，具有紅肉、離核、硬溶質(zhì)、豐產(chǎn)等優(yōu)良性狀，近年來在湖北產(chǎn)區(qū)得到了大力發(fā)展。目前，以‘天仙紅為核心的早熟桃產(chǎn)業(yè)已發(fā)展成為大別山南麓丘崗地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著‘天仙紅桃種植規(guī)模擴大，流膠病的發(fā)生也越來越重。桃流膠病致病因素復(fù)雜，分為侵染性流膠病和非侵染性流膠病兩種類型，前者由真菌侵染所致，后者則與環(huán)境條件、品種、栽培管理措施等因素有關(guān)［2］。目前關(guān)于侵染性流膠病的報道較多，葡萄座腔菌屬Botryosphaeria真菌中的B.dothidea、B.rhodina、B.obtusa均可引起桃樹流膠［3-4］。此外，Leptosphaeria pruni、Cucurbitaria spp.、Phoma persicae、Phomopsis spp.等真菌在條件適宜時也能引起桃枝干潰瘍或流膠［5］。由于致病因素復(fù)雜，生產(chǎn)上尚缺乏有效的防控手段。鑒于此，本研究對‘天仙紅桃樹流膠病的發(fā)病特點及其病原物進行了初步研究，以期為本產(chǎn)區(qū)桃樹流膠病的防控提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

從湖北省孝昌縣7年生‘天仙紅桃樹采集表現(xiàn)明顯流膠癥狀的枝干樣品10份，用于病原菌的分離;選用湖北省武漢市江夏區(qū)金水閘桃資源圃內(nèi)種植的6年生‘天仙紅桃樹新梢枝條進行致病性測定。

1.2?病原菌的分離純化

采用常規(guī)組織分離法［6］對感病枝條樣品病健交界處組織進行分離純化，獲得的病原菌分離菌株置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

將分離菌株接種于PDA平板上于25℃培養(yǎng)，觀察記錄菌落形態(tài)。參照雷建姣等［7］的方法，將分離菌株接種到含有松針的水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上培養(yǎng)，待松針表面形成子實體后在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。

1.4?病原菌的分子生物學(xué)鑒定

采用真菌基因組DNA抽提試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取菌絲基因組 DNA。具體方法參照試劑盒說明書。采用真菌通用鑒定引物ITS1/ITS4［8］、Bt2a/Bt2b［9］和EF1-728F/EF1-986R［10］分別對分離菌株的核榶體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）、β微管蛋白（β-tubulin）、翻譯延伸因子（TEF1-α）基因序列進行PCR擴增，獲得的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序。測序結(jié)果提交至GenBank，在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）中進行序列比對，并采用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹以確定病原菌的分類地位。

1.5?病原菌的致病性測定

參照Gao等［11］的方法，略有改動。選取健康、粗細一致的一年生‘天仙紅枝條，剪成長約15 cm左右的枝段，75%乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗3次，晾干備用。用無菌接種針在枝條中間部位針刺4針，取直徑為0.5 cm的菌餅接種于傷口上，以接種無菌培養(yǎng)基為對照，每個處理接種10根枝條。接種后的枝條置于白瓷盤（長30 cm，寬20 cm，高5 cm）中，浸濕的滅菌吸水紙鋪在盤底，用保鮮膜覆蓋瓷盤保濕，26℃恒溫培養(yǎng)（L∥D=12 h∥12 h），培養(yǎng)2 d后去除菌餅。接種5 d后觀察不同處理枝條的發(fā)病情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?田間癥狀表現(xiàn)

流膠病主要危害‘天仙紅桃樹主干和側(cè)枝，也可危害當年新生梢枝。發(fā)病初期被害枝干表面形成隆起的小皰斑，條件適宜時病斑皮層開裂，溢出無色透明膠體，氧化后變?yōu)榻瘘S色，最后形成茶褐色或黑褐色膠體附著在枝干上，發(fā)病嚴重時樹干密布流膠點，導(dǎo)致樹勢衰弱（圖1）。該病害在湖北產(chǎn)區(qū)每年1月－4月危害較輕，5月以后開始逐步加重，7月－9月是其危害高峰期，部分果園的發(fā)病率高達100%。

2.2?病原菌的形態(tài)學(xué)特征

采用組織分離法從10份樣品中獲得了17個菌落形態(tài)一致的分離菌株。分離菌株在PDA平板上菌落呈圓形或近圓形，氣生菌絲發(fā)達，生長高度可以達到并貼緊培養(yǎng)皿蓋。菌落邊緣不整齊，初期灰白色，培養(yǎng)5～6 d后氣生菌絲變?yōu)榛液谏▓D2a），基質(zhì)菌絲變?yōu)楹谏▓D2b）。分生孢子器著生在松針表面，黑色、近球形、單腔。分生孢子單胞，無色透明，紡錘形（圖2c），大小為（13.65～20.55） μm×（4.61～7.41） μm （n=50）。分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征與前人描述的小新殼梭孢Neofusicoccum parvum［7， 12］相符。

2.3?分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

對代表性分離菌株JSZ01的ITS、β-tubulin和TEF-1α基因進行PCR擴增，分別獲得長度為490、418 bp和258 bp的目標片段，將測序獲得的基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫（NCBI序列登錄號分別為OK310848.1、OK337998.1和OK338000.1）。比對結(jié)果顯示JSZ01的ITS、β-tubulin和TEF-1α基因序列與NCBI登錄號為MT645687.1、MN318108.1、MK781982.1等Neofusicoccum parvum分離菌株的相似度分別為100%、99.3%和99.2%。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載 N.parvum、N.ribis、N.brasiliense、Guignardia philoprina等分離菌株ITS、β-tubulin、TEF-1α 基因序列聯(lián)合構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示分離菌株JSZ01與小新殼梭孢N.parvum的類群聚為一支（圖3）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定，確定分離菌株為N.parvum。

2.4?病原菌的致病性測定

采用菌絲塊接種的方法將分離菌株JSZ01接種到一年生‘天仙紅枝條上。接種后5 d，分離菌株JSZ01菌絲塊接種點周邊組織出現(xiàn)橢圓形深褐色潰瘍斑并溢出透明膠體 （圖4a），而PDA瓊脂塊接種的空白對照枝條均未發(fā)病（圖4b）。取病健交界處組織進行病原菌的再分離，獲得與原接種菌一致的分離菌株。根據(jù)柯赫氏法則判定JSZ01菌株為導(dǎo)致‘天仙紅桃枝條產(chǎn)生流膠癥狀的病原菌。

3?結(jié)論與討論

本研究對表現(xiàn)流膠癥狀的‘天仙紅桃枝干樣品進行了病原菌分離，得到的分離菌株JSZ01在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生分生孢子但在含松針的水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上可產(chǎn)分生孢子，與雷建姣等［7］的研究結(jié)果一致。鑒于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征尚不能準確鑒定Botryosphaeria真菌［3］，本研究同時擴增分離菌株JSZ01的ITS、β-tubulin和TEF-1α 基因并進行測序比對，構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹進行分析。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果，確定分離菌株JSZ01為小新殼梭孢Neofusicoccum parvum。侵染性桃流膠病主要病原為Botryosphaeria真菌（有性型），其無性型包括殼梭孢屬Fusicoccum真菌［4］。本研究中分離菌株JSZ01為新殼梭孢屬Neofusicoccum真菌，在分類上是從Fusicoccum演化出來的新屬［13］，研究結(jié)果為后期進行侵染性桃樹流膠病病原研究提供了新的信息，為將來開展病原性流膠病的致病機理及防控研究提供了基礎(chǔ)。此外，N.parvum寄主范圍廣泛，可侵染柑橘、藍莓、鱷梨、杧果等多種植物［14］，并引起柑橘、杧果等產(chǎn)生潰瘍流膠癥狀［15-16］，本文所分離菌株JSZ01是否能夠引起其他桃樹品種及其他植物產(chǎn)生流膠癥狀也值得進一步研究。

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（責任編輯：田?喆）