陳國(guó)浩, 毛鐵墻, 董宏坡, 歐亞飛, 張家偉

（華東師范大學(xué) 河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200241）

0 引 言

硝化過程是氮素轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié), 包括氨氧化作用和亞硝酸鹽氧化作用, 主要是由微生物主導(dǎo)[1-2].氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)主要負(fù)責(zé)將氨氧化為亞硝酸鹽[3-4], 而亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(nitrite-oxidizing bacteria, NOB)主要負(fù)責(zé)將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽[5]. 盡管最近發(fā)現(xiàn)了能夠直接將氨氧化為硝酸鹽的細(xì)菌[6], 即全程氨氧化細(xì)菌(complete ammonia oxidizer, Comammox), 但至今仍未在海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)Comammox 的基因組序列[7],故NOB 對(duì)于亞硝酸鹽的氧化仍為硝酸鹽的主要來源之一[8-9].

硝化螺菌(Nitrospira)是NOB 中多樣性最為豐富的屬, 至今已發(fā)現(xiàn)至少有6 個(gè)世系(lineages)[10],然而, 僅5 個(gè)lineages 的亞硝酸鹽氧化還原酶(nitrite oxidoreductase, NXR)基因序列[11]和3 個(gè)lineages的基因組被揭示. 特別地, lineage Ⅲ的培養(yǎng)代表和基因組至今未被發(fā)現(xiàn), 這意味著Nitrospira仍然存在較多未知的類群. 其中, Comammox 在進(jìn)化上屬于Nitrospiralineage Ⅱ, 是近年來氮循環(huán)中的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn), 該細(xì)菌可以獨(dú)立地完成兩步硝化過程[6].Nitrospira廣泛分布在土壤、淡水、熱泉、地下水、人工系統(tǒng)和海洋中[10-12]. 根據(jù)調(diào)查和生理實(shí)驗(yàn),Nitrospira的分布和多樣性受到鹽度、溫度和底物濃度等因素的影響[13-15].

近年來, 發(fā)現(xiàn)Nitrospira不僅存在全球分布的特征, 還有著多樣的代謝功能和生存方式. 有的Nitrospira編碼著脲酶和氰酸酶基因[16-17], 能將這些有機(jī)氮素降解為氨, 為氨氧化微生物提供能源. 特別地, 部分ComammoxNitrospira能直接利用尿素和氰酸鹽作為能源[6,18-19], 拓寬了對(duì)Nitrospira利用氮素的認(rèn)識(shí). 另外,Nitrospira還可利用氫氣、甲酸鹽和硫化物作為電子供體驅(qū)動(dòng)生長(zhǎng)[16,19-20]. 這些功能潛力對(duì)氮循環(huán)和Nitrospira自身生長(zhǎng)均至關(guān)重要. 然而, 目前從潮灘濕地獲得的Nitrospira基因組及培養(yǎng)樣品較為缺乏, 對(duì)其在潮灘濕地中的功能認(rèn)識(shí)非常有限. 因此, 利用一些新技術(shù)獲取更多基因組對(duì)Nitrospira進(jìn)行研究很必要.

潮灘濕地是陸地和海洋的交界地帶, 其在全球的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用. 大量富含氮的生活污水和農(nóng)業(yè)肥料通過徑流作用在潮灘濕地富集, 經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)化作用后, 部分流入海洋.根據(jù)已有的報(bào)道,Nitrospira在人工污水處理系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用, 具有較高的功能多樣性[18-19,21].天然的潮灘濕地, 包括紅樹林濕地、鹽沼濕地和河口等, 是龐大而重要的污水處理系統(tǒng), 含有豐富多樣的Nitrospira物種[22-25]. 為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Nitrospira在潮灘濕地中的功能, 本研究選取了中國(guó)沿海5 個(gè)跨不同緯度的潮灘濕地, 從沉積物樣品中恢復(fù)了14 個(gè)Nitrospira基因組. 通過對(duì)系統(tǒng)發(fā)育、代謝通路和環(huán)境適應(yīng)等方面的分析, 深入研究了這些基因組, 以期為理解Nitrospira在潮灘濕地中的重要生態(tài)功能提供更多的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究站位和采樣

本研究從中國(guó)沿海的3 個(gè)潮灘濕地獲得12 個(gè)沉積物樣品, 包括遼河口鹽沼濕地(LH01 和LH02)、崇明島東灘濕地(CM01 和CM02)、三亞青梅港紅樹林自然保護(hù)區(qū)(QM). 使用重力柱采集器,在崇明島東灘濕地和三亞青梅港紅樹林自然保護(hù)區(qū)獲得3 個(gè)1 m 深的沉積物柱, 且每個(gè)沉積柱樣品被平均分割成3 ～ 4 份; 在遼河口鹽沼濕地獲得兩個(gè)表層(0 ～ 5 cm)沉積物樣品(LH01 和LH02). 所有樣品采集完后立即裝進(jìn)密封的無菌樣品盒, 并放入裝有干冰的儲(chǔ)物箱中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室, 將樣品儲(chǔ)藏在 —80℃冰箱中用于測(cè)序和理化分析. 另外, 兩個(gè)潮灘濕地的宏基因組樣品數(shù)據(jù)(表1)從開放的公共數(shù)據(jù)庫(kù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(the national center for biotechnology information, NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得.

表1 樣品的物理和化學(xué)性質(zhì)Tab. 1 Physical and chemical properties of the samples

1.2 DNA 提取和測(cè)序

使用DNA 提取試劑盒 (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA), 從5 ～ 10 g 沉積物中提取基因組DNA, 使用Qubit 2.0 和Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量. 檢測(cè)合格的 DNA 樣品被用于文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序. 宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)由Illumina HiSeq 2500 儀器生成, 每個(gè)樣品大約獲得60 G 雙端原始測(cè)序序列數(shù)據(jù).

1.3 宏基因組組裝和基因組重構(gòu)

本研究共獲得15 個(gè)宏基因組數(shù)據(jù)(表1), 包括從NCBI 下載的3 個(gè)數(shù)據(jù) (YD、ZN01 和 ZN02) ,其中, YD 由2 個(gè)較小的宏基因組混合組成. 宏基因組拼接與分箱步驟包括: 先使用Trimmomatic 軟件[26]對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)量裁剪, 再使用MEGAHIT 軟件[27]進(jìn)行組裝, 參數(shù)為(--k-min 27, --k-max 127,--k-step 10), 然后將拼接得到的序列使用MetaBAT 軟件[28]進(jìn)行分箱, 最后使用CheckM 軟件[29]將分箱得到的基因組進(jìn)行完整度和污染度的質(zhì)量分析. 多樣的基因組組裝參數(shù)通過QUAST[30]進(jìn)行評(píng)估.基因組的分類使用GTDB-TK 工具[31]獲得, 僅屬于Nitrospirae 門的基因組被關(guān)注. 序列分類通過CAT 軟件 (https://github.com/dutilh/CAT/releases/tag/v5.2.3)識(shí)別, 分類成其他門的序列被移除;同時(shí), 不一致的序列被CheckM 軟件[29]基于單拷貝基因進(jìn)行識(shí)別和手動(dòng)移除. 最后, 對(duì)候選的基因組基于GC (guanine and cytosine)含量、覆蓋度和四核苷酸頻率使用RefineM[32]進(jìn)行檢查和校正, 完整度大于70%和污染度小于5%的基因組會(huì)被進(jìn)一步分析.

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析和基因組注釋

為確定重構(gòu)基因組的系統(tǒng)發(fā)育地位, 本研究從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了Nitrospirae 門的基因組. 通過使用GTDB-TK 軟件[31]對(duì)細(xì)菌的120 個(gè)標(biāo)記蛋白進(jìn)行串聯(lián), 并使用IQ-TREE 軟件[34]構(gòu)建最大似然樹, 利用iTOL[35]對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行可視化. 為進(jìn)一步識(shí)別基因組的進(jìn)化地位, 使用Barrnap 軟件(https://github.com/tseemann/barrnap)預(yù)測(cè)基因組的16S rRNA 基因. 同時(shí), 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了其他的16S rRNA 基因, 使用MAFFT 軟件[36]對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì), 并使用BMGE 軟件[37]進(jìn)行切邊處理. 最后, 使用IQ-TREE 軟件[34]構(gòu)建最大似然樹和利用iTOL[35]對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行可視化.

為探究氰酸酯酶基因的進(jìn)化地位, 從NCBI 中下載已知的NOB 和AOA 的氰酸酶基因的氨基酸序列及相似的部分序列, 并利用HMMER3[38]識(shí)別公共數(shù)據(jù)庫(kù)及本研究獲得的Nitrospira屬基因組中的氰酸酶基因. 比對(duì)所有這些氨基酸序列, 對(duì)所得結(jié)果使用IQ-TREE 軟件[35]進(jìn)行最大似然樹的構(gòu)建.

使用Prodigal 軟件[39]對(duì)基因組的開放閱讀框(open reading frame, ORF)進(jìn)行預(yù)測(cè), 并將核酸序列翻譯為蛋白序列. 然后, 使用BlastP 工具[40]比對(duì)COG 和NCBI 非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù), 進(jìn)行蛋白功能的注釋(E-value 閾值 ＜ 1 × 10—5). 同時(shí), 通過在線的KASS[41]工具進(jìn)行注釋.

2 結(jié)果與討論

2.1 Nitrospira 基因組的恢復(fù)

從5 個(gè)跨越溫帶和熱帶的潮灘濕地沉積物中, 使用宏基因組測(cè)序的方法拼接與組裝得到14 個(gè)較高質(zhì)量(完整度＞70%、污染度＜5%)的Nitrospira基因組 (metagenome-aassembled genomes, MAGs)(表2). 依據(jù) 大 于95%的種 間 平均 核 酸 相 似度 (average nucleotide identity, ANI)閾 值[42], 這 些MAGs 可被劃分為10 個(gè)新物種. 同時(shí), 基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)顯示, 這些MAGs 位于3 個(gè)不同lineages 中, 包括lineage Ⅱ、lineage Ⅳ和一個(gè)未被定義的系統(tǒng)發(fā)育分支. 其中, 3 個(gè)MAGs 與clade A comammoxNitrospira聚在一起. 依據(jù)已有的研究, lineage Ⅱ和lineage Ⅳ分別來自兩個(gè)完全不同的生態(tài)環(huán)境系統(tǒng), 分別為陸地和海洋[10], 這意味著潮灘濕地的Nitrospira有更高的物種多樣性. 有趣的是,基因組進(jìn)化樹顯示, QMm6 和QMb135 這兩個(gè)Nitrospira物種形成獨(dú)立的一簇(圖1), 且不屬于任何已知的世系, 可能為新的Nitrospira物種.

圖1 基于120 個(gè)保守串聯(lián)蛋白構(gòu)建的Nitrospira 基因組最大似然樹Fig. 1 Nitrospira genomic maximum likelihood tree based on 120 conserved proteins

表2 從潮灘濕地宏基因組組裝中提取的14 個(gè)硝化螺旋菌的基因組特征Tab. 2 Genomic features of 14 Nitrospira MAGs recovered from metagenomic assembly in tidal flat wetlands

為了進(jìn)一步揭示由QMm6 和QMb135 聚類成的這一未知的系統(tǒng)發(fā)育分支, 基于Nitrospira16S rRNA 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2). 本研究發(fā)現(xiàn)16S rRNA 基因樹與Nitrospira基因組樹有著近乎一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 且QMm6 和QMb135 這兩個(gè)未曾被揭示的基因組所含的16S rRNA 基因序列與前人報(bào)道的lineage Ⅲ中的16S rRNA 序列聚類成一簇, 這意味著這兩個(gè)MAGs 隸屬于此前被劃分的lineage Ⅲ[12]. 這一獨(dú)特的lineage 從發(fā)現(xiàn)至今已超過20 年, 但只有相應(yīng)的16S rRNA 基因被揭示, 而該分支的培養(yǎng)樣品和基因組均未被獲得[11-12], 因此, 其生理功能和代謝潛力仍有著很大的未知. 本研究首次發(fā)現(xiàn)的這兩個(gè)隸屬于lineage Ⅲ的MAGs 有著較高的恢復(fù)質(zhì)量(完整度分別為95.91%和96.82%),在中國(guó)三亞青梅港紅樹林沉積物中獲得. 同時(shí), 對(duì)16S rRNA 序列的分析發(fā)現(xiàn), 該lineage 的成員分布在深海沉積物[43-44]、陸地喀斯特巖洞[45-46]和鹽堿土環(huán)境中 (圖2). 而本研究在紅樹林沉積物中首次發(fā)現(xiàn)了lineage Ⅲ, 擴(kuò)大了它們的生境分布范圍.

圖2 基于Nitrospira 16S rRNA 序列構(gòu)建的最大似然樹Fig. 2 Maximum likelihood tree based on Nitrospira 16S rRNA sequences

2.2 代謝潛力分析

本研究重構(gòu)了14 個(gè)NitrospiraMAGs 的代謝途徑(圖3), 結(jié)果表明, 這些MAGs 有著典型的Nitrospira所具備的中心碳代謝和能量傳遞系統(tǒng), 如還原型三羧酸循環(huán)、糖酵解/糖質(zhì)新生及磷酸戊糖途徑等. 盡管少部分MAGs 缺失亞硝酸鹽氧化還原酶alpha 亞基和亞硝酸鹽氧化還原酶beta 亞基, 但有多個(gè)拷貝的亞硝酸鹽氧化還原酶gamma 亞基存在于這些基因組中. 在3 個(gè)Comammox 的基因組中, 僅CM01m262 含有氨單加氧酶gamma 亞基和CM01s42 含有羥胺氧化還原酶(hydroxylamine oxidoreductase, HAO), 但它們均含有區(qū)別于嚴(yán)格亞硝酸鹽氧化Nitrospira的Rh 類型氨轉(zhuǎn)運(yùn)體[18,47],意味著這3 個(gè)MAGs 為典型的ComammoxNitrospira. 這些MAGs 除具有進(jìn)行亞硝酸鹽氧化或全程氨氧化的作用外, 還具有更多的代謝潛力.

圖3 重構(gòu)14 個(gè)Nitrospira 基因組的代謝途徑Fig. 3 Metabolic pathways of 14 Nitrospira MAGs

近年來, 研究者們發(fā)現(xiàn)Nitrospira可將尿素或氰酸鹽降解為銨鹽, 通過“互喂作用”為氨氧化微生物和Comammox 提供底物[16-18,48]. 尿素的裂解已經(jīng)在一些富集培養(yǎng)的Comammox 菌株(Ca.Nitrospira nitrosa,Ca.Nitrospira nitrificans和Ca.Nitrospira inopinata) 中被觀察到[6,47]. 在本研究中, 脲酶基因在兩個(gè)Comammox MAGs(CM01m262 和 YD_bin17)中被識(shí)別(圖3), 其中YD_bin17 含有部分相應(yīng)的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng), 這意味著尿素也可以被這些來自潮灘濕地的Comammox 所利用. 這些Comammox 主要存在于鹽度較低的CM01 和YD 站位中. 最近的研究表明, 有機(jī)肥的使用和工廠產(chǎn)生了大量的尿素, 這些尿素通過徑流進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)中, 并在河口濕地中積累[45], 導(dǎo)致河口濕地富營(yíng)養(yǎng)化[49]和水體缺氧[50], 而本文獲得的這些Comammox 可以直接轉(zhuǎn)化尿素并減緩尿素的積累. 盡管尿素的利用已經(jīng)在一些富集培養(yǎng)的典型Nitrospira中被觀察到[16,51], 然而, 本研究獲得的所有11 個(gè)典型的Nitrospira基因組均沒有包含脲酶基因, 這意味著典型的Nitrospira與氨氧化微生物通過降解尿素進(jìn)行互惠生長(zhǎng)的過程在潮灘濕地中可能并不普遍. 研究表明, 尿素可自發(fā)地裂解為氰酸鹽, 廣泛存在于環(huán)境中并參與氮循環(huán)[52-53]. 本研究獲得的6 個(gè)NitrospiraMAGs 中含有氰酸酯酶基因(圖3), 其中3 個(gè)來自CM02 和QM 站位的NitrospiraMAGs 編碼著相應(yīng)的氰酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體, 表明這些Nitrospira可分解潮灘濕地環(huán)境中的氰酸鹽為銨鹽, 并為硝化微生物提供能源, 對(duì)氮素循環(huán)發(fā)揮著重要的作用.本研究中的3 個(gè)Comammox MAGs 均不含有氰酸酯酶基因, 這些基因僅在污水處理系統(tǒng)的幾個(gè)ComammoxNitrospira成員中被發(fā)現(xiàn)[18-19]. 令人意外的是, 從lineage Ⅲ兩個(gè)基因組中發(fā)現(xiàn)的氰酸酯酶與此前在其他Nitrospira成員中發(fā)現(xiàn)的有著不同的進(jìn)化關(guān)系(圖4(a)), 它們之間有著較低的氨基酸相似度(＜40%); 前人發(fā)現(xiàn)的Nitrospira中的氰酸酯酶與AOA 菌株Nitrososphaera gargensis的氰酸酯酶有著更近的發(fā)育關(guān)系(圖4(b)), 而本研究獲得的這些序列與Nitrospinae 門和厭氧氨氧化細(xì)菌(anaerobic ammonium oxidation, anammox)的氰酸酯酶有著更近的進(jìn)化關(guān)系(圖4(c)). 在AOA 菌株Nitrososphaera gargensis中, 氰酸酯酶可分解氰酸鹽產(chǎn)生氨作為單一能源[17]; 而海洋中的anammox和Nitrospina細(xì)菌也表現(xiàn)出降解氰酸鹽的潛力, 可以使用氰酸鹽作為氮源, 或基于對(duì)氨氧化微生物的“互喂” 機(jī)制作為間接能源[54-56]. 在潮灘濕地MAGs 中發(fā)現(xiàn)的這些氰酸酯酶氨基酸序列均含有保守的Arg96、Glu99、Ser122 活性位點(diǎn)殘基[57](圖5), 這意味著Nitrospira成員中發(fā)現(xiàn)的這兩種有著不同親緣關(guān)系的氰酸酯酶均具有裂解氰酸鹽的潛力. 這些新發(fā)育分支的氰酸酯酶氨基酸序列與Nitrospinasp.(MBM14886.1)有著較高的氨基酸相似度(75% ～ 82%), 意味著它們之間可能發(fā)生了水平基因轉(zhuǎn)移事件. 在Nitrospira中新的氰酸酯酶進(jìn)化分支的這一發(fā)現(xiàn), 拓展了研究人員對(duì)Nitrospira成員中氰酸酯酶的認(rèn)知, 表明該酶在Nitrospira中的分布可能更為多樣化. 這兩個(gè)進(jìn)化分支的氰酸酯酶基因廣泛存在于Nitrospira不同的lineage 基因組中, 而這些不同lineage 的Nitrospira廣泛分布于全球的各種生態(tài)系統(tǒng), 包括開闊大洋和陸地生態(tài)系統(tǒng), 意味著氰酸鹽在全球廣泛被Nitrospira作為有機(jī)氮降解的底物, 并為氨氧化微生物提供能源.

圖4 氰酸酯酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of cyanase amino acid sequences

圖5 氰酸酯酶氨基酸位點(diǎn)的比對(duì)Fig. 5 Alignment of cyanase amino acid sites

特別地, 這些NitrospiraMAGs 可能在參與有機(jī)氮轉(zhuǎn)化方面具有更大的功能潛力. 本研究中獲得的9 個(gè)NitrospiraMAGs 中注釋有“nitrilase/cyanide hydratase and apolipoprotein N-acyltransferase”或“carbon-nitrogen hydrolase family protein”, 它們屬于氮-碳裂解酶或腈水解酶超家族蛋白, 所有這些蛋白質(zhì)似乎都參與了有機(jī)氮化合物的還原和氨的產(chǎn)生[58-59](圖3). 另外, 本文還注意到多個(gè)站位的NitrospiraMAGs 含有將一些氨基化合物降解產(chǎn)生氨的酶, 包括煙酰胺酶、酰胺酶和胺氧化酶, 這意味著Nitrospira可能有更多未被揭示的與氨氧化微生物耦合生長(zhǎng)的機(jī)制, 這些酶可能對(duì)潮灘濕地有機(jī)氮的去除發(fā)揮著關(guān)鍵的作用.

在本研究中,NitrospiraMAGs 含有多種潛在的替代能源, 暗示著Nitrospira在潮灘濕地環(huán)境中有更廣泛的生存策略. 甲酸已被發(fā)現(xiàn)作為一些Nitrospiralineage Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ菌株的電子供體和碳源[16,21,60].僅4 個(gè)來自CM01、ZN02 和QM 站位的NitrospiraMAGs 含有甲酸脫氫酶, 意味著這些Nitrospira可能有著利用甲酸鹽作為生長(zhǎng)能源的潛力. 盡管NitrospiraMAGs 被識(shí)別出含有多種有機(jī)物利用途徑,但大多數(shù)有機(jī)物被驗(yàn)證并不能維持Nitrospira的持續(xù)生長(zhǎng)[15,61-62]. 有研究表明,Nitrospira在混合營(yíng)養(yǎng)中能更好地生長(zhǎng)[12,60-61], 意味著其可能利用部分有機(jī)物作為碳源, 這些過程可能對(duì)潮灘濕地中有機(jī)物的去除有著重要作用. 10 個(gè)NitrospiraMAGs 含有周質(zhì)的亞硫酸鹽脫氫酶(sulfite oxidoreductase,SOR)和4 個(gè)lineage Ⅱ MAGs 含有硫化氫氧化還原酶(sulfide/quinone oxidoreductase, SQR) (圖3),這兩種酶可催化亞硫酸鹽(SO3—)或硫化氫 (H2S)的氧化, 并產(chǎn)生電子[63-65]; 盡管這兩種酶也存在于Nitrococcus和Nitrotoga中[66-67], 但仍缺乏相關(guān)的生理實(shí)驗(yàn)證實(shí)NOB 能夠利用這兩種酶催化相應(yīng)硫化物作為生長(zhǎng)能源. 另外,NitrospiraMAGs 含有不同類型的氫氣氧化酶, 其中11 個(gè)MAGs 編碼著Group 3b 鎳鐵硫還原氫化酶(group 3b [Ni-Fe] sulfur-reducing hydrogenase, HYD), 該酶能將氫氣氧化并產(chǎn)生NADPH, 同時(shí)能消耗NADPH 將硫還原[55,66-68]. 3 個(gè)Comammox MAGs 和來自CM02 站位的CM02s178 (圖3) 中含有假定的Group 4 氫化酶 (putative group 4 hydrogenase, HYF). 但該酶的大亞基缺失兩對(duì)在鎳鐵類型氫化酶中均存在的鎳鐵中心的半胱氨酸配體[69], 這一特征在其他典型Nitrospira中也被揭示[16,70], 暗示著該酶發(fā)揮著未知的功能. 來自QM 站位的QMb347 和QMm174 中含有Group 2a 鎳鐵氫化酶(group 2a [Ni-Fe] hydrogenase, HUP), 該酶在Nitrospira moscoviensis菌株中被證實(shí)能夠催化氫氣氧化, 從而獲得能量用于碳的固定和生長(zhǎng)[16].

2.3 Nitrospira 在潮灘濕地環(huán)境的適應(yīng)

許多研究表明, 潮灘濕地是重金屬和污染物積累的區(qū)域[71-73], 并且有著較大范圍的鹽度和底物濃度的變化[74]. 本研究獲得的Nitrospira基因組編碼著次氯酸鹽歧化酶、砷酸鹽還原酶和汞還原酶, 這或許能消除細(xì)胞對(duì)來自潮灘中的毒性[75-77]. 我們還發(fā)現(xiàn), 這些基因組編碼著超過氧化物歧化酶和過氧化物酶，這些酶能抵抗高濃度的活性氧(reactive oxygen species, ROS)[78]. 大部分的Nitrospira還編碼著碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA), 可以將進(jìn)入細(xì)胞的 H C轉(zhuǎn)化為CO2[79], 為還原型的三羧酸循環(huán)提供碳源. 根據(jù)報(bào)道, 大部分培養(yǎng)的Nitrospira含有鞭毛[51], 而我們獲得的14 個(gè)基因組中僅QM、ZN02 和LH01 站位中的3 個(gè)編碼著較完整的鞭毛系統(tǒng), 這意味著潮灘濕地中的Nitrospira可能有著獨(dú)立的生態(tài)位.

由于潮灘濕地有著較大的鹽度差, 故Nitrospira可能需要有特殊的代謝途徑來適應(yīng)鹽度變化較大的潮灘環(huán)境. 有研究表明,Nitrospira編碼著調(diào)節(jié)滲透壓的重要物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道, 包括水通道 (aquaporin Z, AqpZ)、機(jī)械離子感應(yīng)通道 (mechanosensitive ion channel, MSC)和甜菜堿ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[80-82].值得注意的是, 本研究獲得的MAGs 中, 僅隸屬于lineage Ⅳ和lineage Ⅲ的MAGs 編碼有H+/Na+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體和甘氨酸/甜菜堿ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體, 這些基因組主要來自鹽度更高(9‰ ～ 27‰)的QM 和LH 站位. 水通道蛋白僅在隸屬于lineage Ⅱ的3 個(gè)MAGs 中被發(fā)現(xiàn)(圖3), 這些基因組來自鹽度更低(＜5‰)的CM02 和ZN01 站位. 有研究表明, 許多生活在低營(yíng)養(yǎng)海洋環(huán)境中的細(xì)菌通常存在一些有機(jī)滲透物(甜菜堿、脯氨酸和甘露糖醇等)的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體[83], 使得這些細(xì)菌能夠更好地適應(yīng)高鹽度的海洋環(huán)境[84]. 這意味著在潮灘濕地中, 不同鹽度站位的Nitrospira成員有著不同的滲透壓調(diào)控機(jī)制, 高鹽度站位的Nitrospira可通過編碼有機(jī)滲透物的ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)體來適應(yīng)高鹽度的脅迫.

令人驚訝的是, 本研究獲得的這些NitrospiraMAGs 的抗病毒系統(tǒng)有著較高的多樣性(圖3), 大部分MAGs 編碼CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 相關(guān)蛋白. 然而,由于一個(gè)完整的CRISPR 防御系統(tǒng)至少含有一個(gè)核心的cas基因[85], 而本研究獲得的MAGs 中僅QMb347 和QMb135 含有核心的cas基因, 故而暗示著其他MAGs 可能不能利用CRISPR 系統(tǒng)進(jìn)行病毒的防御. 但有研究表明, 細(xì)菌的限制-修飾 (restriction-modification, R-M) 病毒免疫系統(tǒng)廣泛存在于原核生物中, 能攻擊進(jìn)入細(xì)胞的外來DNA[86]. 本研究獲得的NitrospiraMAGs 中注釋有Type Ⅰ -ⅢR-M 系統(tǒng)的關(guān)鍵基因 (Restriction endonuclease 和DNA methylase), 意味著該免疫系統(tǒng)可能在這些NitrospraMAGs 中發(fā)揮著重要的病毒防御作用. 此外, 毒素抗毒素系統(tǒng)(toxin-antitoxin, TA) 和流產(chǎn)感染系統(tǒng)(abortive infection system, Abi)的相關(guān)基因也普遍存在于這些MAGs 中, 這兩種免疫系統(tǒng)均采用自殺方式進(jìn)行病毒的抵抗[87-88]. 另外, QMm125 基因組中包含噬菌體排斥系統(tǒng) (bacteriophage exclusion, BREX) 的大部分基因, 也可能發(fā)揮著相應(yīng)的病毒防御功能[89]. 盡管噬菌體讓大量細(xì)菌感染致死并影響著微生物群落結(jié)構(gòu), 但同時(shí)也是驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)化和生物遺傳多樣性的重要?jiǎng)恿90]. 特別地,NitrospiraMAGs 中發(fā)現(xiàn)含有大量噬菌體組裝和侵染相關(guān)基因, 這表明噬菌體介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT) 可能廣泛發(fā)生在Nitrospira群體中[91-92], 并推動(dòng)Nitrospira基因組趨于多樣化和適應(yīng)全球廣泛的生態(tài)環(huán)境.

本研究中從潮灘濕地恢復(fù)的NitrospiraMAGs 分布在較寬的緯度范圍 (18.22°N ～ 40.78°N), 這些長(zhǎng)期棲息在不同緯度位置的Nitrospira可能受到不同溫度的脅迫. 研究表明, 極端嗜熱蛋白需要更多的帶正電荷的殘基及通過犧牲極性氨基酸殘基來保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[93]. 因此, 帶電氨基酸和極性氨基酸的百分比差異(difference between the proportions of charged versus polar (non-charged) amino acids, CvP-bias)常被用來研究微生物的熱適應(yīng)能力[94-95]. 我們計(jì)算了14 個(gè)Nitrospira基因組的CvPbias 值, 將每個(gè)站位基因組的CvP-bias 平均值與緯度位置進(jìn)行線性回歸. 結(jié)果顯示, CvP-bias 平均值與緯度之間有一定負(fù)相關(guān)性, 但并不顯著 (y= — 5.708x+ 46.58,R2= 0.203 8,p= 0.445 4; 圖6(a)).最小和最大的平均基因組CvP-bias 值分別對(duì)應(yīng)最高緯度和最低緯度. 這意味著, 在有更高溫度的較低緯度位置,NitrospiraMAGs 可能有更高的CvP-bias 值, 即需要使用更多的帶電氨基酸以適應(yīng)更高的溫度. 但這一結(jié)果并不顯著, 這可能與基因組和站位數(shù)量有關(guān). 為進(jìn)一步驗(yàn)證緯度及溫度與Nitrospira基因組CvP-bias 值關(guān)系的顯著性, 所有含緯度信息(1°N ～ 82°N)的99 個(gè)Nitrospira基因組的CvP-bias 值被計(jì)算. 為克服不同生境差異帶來的偏差, 取每10° 緯度間的基因組CvP-bias 值的平均值, 且熱泉基因組被假定為赤道樣品(0°), 并與緯度位置進(jìn)行線性回歸. 線性擬合結(jié)果顯示, 基因組的CvP-bias 與緯度呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性 (y= — 67.99x+ 227.7,R2= 0.773 9,p＜ 0.005; 圖6(b)).這表明, 生活在較低緯度和熱環(huán)境的Nitrospira在一定程度上擁有更多帶電氨基酸來維持蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性, 而在高緯度位置的Nitrospira普遍有更低的CvP-bias 值.

圖6 緯度與平均CvP-bias 值的線性關(guān)系Fig. 6 Linear relationship between latitude and CvP-bias

3 結(jié) 論

本研究獲得了不同緯度位置潮灘濕地的宏基因組樣品, 并分析了14 個(gè)從中恢復(fù)的NitrospiraMAGs 的系統(tǒng)發(fā)育、功能潛力和潮灘環(huán)境適應(yīng)機(jī)制. 結(jié)果顯示, 這些NitrospiraMAGs 有著豐富的物種多樣性和生態(tài)功能潛力. 本研究首次獲得了兩個(gè)隸屬于Nitrospiralineage Ⅲ的基因組, 暗示潮灘濕地含有未被揭示的類群. 代謝通路分析發(fā)現(xiàn), 這些NitrospiraMAGs 有多種可選擇能源利用途徑、壓力防御方式和病毒抵抗機(jī)制. Comammox 和典型的Nitrospira在尿素和氰酸酶的利用上存在明顯差異. 此外, 更多含氮有機(jī)化合物可能被這些Nitrospira作為硝化作用的能源, 這對(duì)潮灘濕地有機(jī)氮素的去除起著重要作用. 同時(shí), 這些Nitrospira來自不同的緯度位置, 研究表明了它們?cè)诓煌恼疚粦?yīng)對(duì)鹽度、溫度和含氮化合物等展現(xiàn)出不同的適應(yīng)策略. 這些研究結(jié)果加深了對(duì)Nitrospira在代謝潛力和環(huán)境適應(yīng)機(jī)制上的認(rèn)識(shí), 為深入理解潮灘濕地的氮循環(huán)過程提供了重要的依據(jù)。