張海英 王暉 潘佳俊 高海波 趙欣然 劉春燕 唐群

〔摘要〕 目的 觀察六味地黃湯（Liuwei Dihuang Decoction， LWDHD）調(diào)控miR-210/HIF-1α信號通路對CoCl2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transdifferentiation， EMT）的作用和機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，分對照組（N組）、模型組（M組）、LWDHD血清組（LW組）、空白血清+miR-210過表達(dá)組（LV-miR-210組）、空白血清+miR-210沉默組（LV-anti-miR-210組）、空白血清+miR-210陰性對照組（LV-miR-210 NC組）、LWDHD血清+miR-210過表達(dá)組（LW+LV-miR-210組）、LWDHD血清+miR-210沉默組（LW+LV-anti-miR-210組）、LWDHD血清+miR-210陰性對照組（LW+LV-miR-210 NC組），除N組外，其他各組加入CoCl2處理。CCK-8法檢測不同濃度LWDHD、CoCl2在24 h后對HK-2細(xì)胞活性的影響并選擇最佳干預(yù)濃度。細(xì)胞免疫熒光和Western blot法檢測各組HK-2細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）、β-聯(lián)蛋白（β-catenin）、波形蛋白（Vimentin）、上皮鈣黏素（E-cadherin）蛋白表達(dá)情況；qPCR法檢測miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin mRNA表達(dá)情況。通過慢病毒感染HK-2細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)miR-210的過表達(dá)和抑制，并加入CoCl2，觀察miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)以及LWDHD的干預(yù)作用。結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示，LWDHD、CoCl2最佳干預(yù)濃度分別為10%、200 μmol/L。與N組相比，M組細(xì)胞形態(tài)由鋪路石樣向長梭形改變，HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），miR-210 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與M組相比，LW組HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），miR-210 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。與LV-miR-210 NC組相比，LV-anti-miR-210組HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；與LV-miR-210 NC組相比，LV-miR-210組HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。在慢病毒轉(zhuǎn)染各組的基礎(chǔ)上，加入LWDHD處理后，LWDHD可降低各組HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 LWDHD抗纖維化作用機(jī)制與其下調(diào)miR-210/HIF-1α信號通路，抑制腎小管EMT有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 腎纖維化；六味地黃湯；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；miR-210；缺氧誘導(dǎo)因子1α；HK-2細(xì)胞

〔中圖分類號〕R259 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.007

Effects and mechanism of Liuwei Dihuang Decoction on CoCl2-induced epithelial-mesenchymal transition of HK-2 cells through the miR-210/HIF-1α signaling pathway

ZHANG Haiying， WANG Hui， PAN Jiajun， GAO Haibo， ZHAO Xinran， LIU Chunyan*， TANG Qun*

Medical College， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects and mechanism of Liuwei Dihuang Decoction （LWDHD） regulating epithelial

mesenchymal transition （EMT） of HK-2 cells induced by CoCl2 through miR-210/HIF-1α signaling pathway. Methods HK-2 cells were cultured in vitro and divided into normal group （N group）， model group （M group）， LWDHD medicated serum group （LW group）， blank serum+over-espressed miR-210 group （LV-miR-210 group）， blank serum+silent miR-210 group （LV-anti-miR-210 group）， blank serum+miR-210 negative group （LV-miR-210 NC group）， LWDHD medicated serum+over-expressed miR-210 group （LW+LV-miR-210 group）， LWDHD medicated serum+silent miR-210 group （LW+LV-anti-miR-210 group） and LWDHD medicated serum+miR-210 negative group （LW+LV-miR-210 NC group）. Except for N group， the other groups were treated with CoCl2. CCK-8 was used to detect the effect of different concentrations of LWDHD and CoCl2 on the activity of HK-2 cells after 24 hours， and the best intervention concentration was selected. Cell immunofluorescence and Western blot were used to determine hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1）， β-catenin， Vimentin， and E-cadherin protein expression levels. miR-210， HIF-1α， β-catenin and Vimentin mRNA expression levels were measured by qPCR. By lentivirus transfection of HK-2 cells， miR-210 was overexpressed and inhibited. Then CoCl2 was added to the medium. The miR-210， HIF-1α ， β-catenin， Vimentin protein and mRNA expression of the regulation effect of LWDHD were observed. Results The CCK-8 showed that the optimal intervention concentrations of LWDHD and CoCl2 were 10% and 200 μmol/L， respectively. Compared with N group， the morphology of cells in group M changed from the shape of paving stone to the shape of long spindle. HIF-1α， β-catenin， Vimentin protein and mRNA expression increased （P<0.05， P<0.01） while miR-210 mRNA expression increased （P＜0.01） and E-cadherin protein expression decreased （P<0.01）. Compared with M group， LW group can significantly reduce the expression of HIF-1α， β-catenin， Vimentin protein and mRNA （P<0.05， P<0.01）， down-regulate the expression of miR-210 mRNA （P＜0.05） and up-regulate the expression of E-cadherin protein （P<0.01）. Compared with the LV-miR-210 NC group， LV-anti-miR-210 group showed lower HIF-1α， β-catenin， Vimentin protein and mRNA （P<0.05， P<0.01）， and LV-miR-210 group showed higher HIF-α， β-catenin， Vimentin protein and mRNA （P＜0.05， P＜0.01）. After LWDHD administration to each group of lentivirus transfection， HIF-1α， β-catenin， Vimentin protein and mRNA expression decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The anti-fibrosis mechanism of LWDHD is related to its down-regulation of miR-210/HIF-1α signaling pathway， which is related to the inhibition of renal tubular EMT.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 renal fibrosis; Liuwei Dihuang Decoction; epithelial-mesenchymal transition; miR-210; hypoxia inducible factor-1α; HK-2 cells; HK-2 cells

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease， CKD）是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[1]。CKD的主要病理特征是腎纖維化（renal fibrosis， RF）。腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transdifferentiation， EMT）是RF的重要機(jī)制之一。由于治療方法有限，CKD患者的長期生存率和生活質(zhì)量都很低。因此，如何有效預(yù)防EMT是腎臟疾病研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一[2]。CKD早期普遍存在低氧，慢性低氧是導(dǎo)致RF的關(guān)鍵因素[3]。目前研究已證實(shí)，低氧通過表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor， HIF-1α）信號途徑引起RF，參與EMT過程[4]。微小RNA（micro RNA， miRNA）是一種功能性非編碼RNA，長度約22個核苷酸。低氧可誘導(dǎo)大量miRNA表達(dá)的變化，其中miR-210與HIF-1α的關(guān)系最為密切[5]。HIF-1α的累積促進(jìn)miR-210表達(dá)的增加，而miR-210反過來可以通過抑制HIF-1α的降解來增強(qiáng)其分子的穩(wěn)定性[6]。miR-210可以參與體內(nèi)各種生理和病理過程，例如細(xì)胞增殖[7]、炎癥損傷[8]、EMT[9]等。已經(jīng)證實(shí)，miR-210廣泛存在于各種惡性腫瘤如乳腺癌、肝癌等，并參與EMT發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。miR-210/HIF-1α通路促進(jìn)EMT的發(fā)生可能是RF的重要發(fā)病機(jī)制。六味地黃湯（Liuwei Dihuang Decoction， LWDHD）是臨床治療CKD的有效方劑，但其有效機(jī)制尚未完全闡明[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該方具有抗氧化、抗缺氧、抗纖維化的藥理作用[12]。本研究以CoCl2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞為研究對象，探討LWDHD通過miR-210/HIF-1α信號通路調(diào)控EMT的作用機(jī)制，以期為臨床防治CKD提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?動物及細(xì)胞

雄性SD大鼠34只，體質(zhì)量（200±20） g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SYXK（湘）2019-0009，所有動物飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心。HK-2（人腎皮質(zhì)近曲腎小管上皮細(xì)胞）細(xì)胞株（批號：CL-0109，武漢普諾賽生命科技有限公司）。本研究由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過，審查批號：LLBH-202105100002。

1.2 ?主要試劑與儀器

CoCl2（批號：C118624，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；LV-hsa-miR-210慢病毒、LV-hsa-miR-210-inhibition慢病毒、陰性對照病毒CON137、嘌呤霉素（批號分別為：13462E6、13462E4、1343EAA、134635C，上海吉凱基因科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（批號：E-BC-K318，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；HIF-1α抗體、β-聯(lián)蛋白（β-catenin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體、GAPDH抗體（批號分別為：10002313、00069064、00103236、20000258、B2202101，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；PAGE蛋白預(yù)制膠（批號：J67319002S，南京艾思易生物科技有限公司）；總RNA快速抽提試劑盒（貨號：Cat#220011，上海飛捷生物技術(shù)有限公司）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR擴(kuò)增試劑盒（批號分別為：05231416、05227808，蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）。miR-210正向引物（貨號：Cat#HmiRQP0317，廣州復(fù)能基因有限公司）。

酶標(biāo)儀（型號：Spark 20M，瑞士Tecan公司）；化學(xué)發(fā)光成像分析儀（型號：721BR17573，美國Bio-Rad公司）；正置熒光顯微鏡（型號：Axioscope，德國Carl·Zeiss公司）；實(shí)時熒光定量RCR儀（型號：LightCycler 96，瑞士Roche公司）。

1.3 ?藥物與含藥血清制備

中藥LWDHD配方：熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮（批號分別為：2012213、TH21092703、SX20180904、SX21093006、CK21092703、CK21100804）按照8∶4∶4∶3∶3∶3比例配制，所有藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。按照隨機(jī)數(shù)字表將34只雄性SD大鼠分為2組：空白對照組、LWDHD組，各17只。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，LWDHD組以每日33.75 g/kg六味地黃煎液灌胃（相當(dāng)于70 kg成人劑量的5倍）[13]，空白對照組以每日10 mL/kg蒸餾水灌胃。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，灌胃7 d后，收集血清，血清分裝儲存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 ?細(xì)胞分組

HK-2細(xì)胞系，分為對照組（N組）、模型組（M組）、LWDHD血清組（LW組）、空白血清+miR-210過表達(dá)組（LV-miR-210組）、空白血清+miR-210沉默組（LV-anti-miR-210組）、空白血清+miR-210陰性對照組（LV-miR-210 NC組）、LWDHD血清+miR-210過表達(dá)組（LW+LV-miR-210組）、LWDHD血清+miR-210沉默組（LW+LV-anti-miR-210組）、LWDHD血清+miR-210陰性對照組（LW+LV-miR-210 NC組）。除N組外，其他組加入CoCl2模擬腎內(nèi)缺氧環(huán)境，同時加入空白或含藥血清，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.5 ?細(xì)胞轉(zhuǎn)染

接種體積：用完全培養(yǎng)基（10% FBS DMEM）制備密度5×104個/mL細(xì)胞懸液，接種5 mL至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，至細(xì)胞匯合度為20%～30%。感染體積：用完全培養(yǎng)基5 mL，按說明書加入相應(yīng)病毒量。病毒體積＝（感染復(fù)數(shù)×細(xì)胞數(shù)目）/病毒滴度，感染復(fù)數(shù)=10。37 ℃培養(yǎng)12～16 h，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；中途可對細(xì)胞換液，保持細(xì)胞活性；感染后約72 h，觀察感染效率；將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含有1 ？滋g/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行穩(wěn)定株篩選。

1.6 ?CCK-8法篩選最佳血清及CoCl2干預(yù)濃度

細(xì)胞懸液密度5×104個/mL、100 μL/孔接種在96孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)基，每孔分別加入100 μL含有0、2.5%、5%、10%、20%濃度藥物血清的培養(yǎng)基或0、100、200、300、400、800 μmol/L CoCl2，干預(yù)24 h后取出96孔板；去舊培養(yǎng)液，加入CCK-8工作液，37 ℃繼續(xù)孵育2 h；450 nm處測量光密度值，通過細(xì)胞存活率選擇最佳的血清濃度和缺氧時間。

1.7 ?Western blot法檢測各組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin、E-cadherin的蛋白水平

給藥24 h后，收集蛋白，測定蛋白濃度；用PAGE預(yù)制膠分離并轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜；3%～5%牛奶封閉2 h；一抗4 ℃孵育過夜[HIF-1α（1∶8000）、β-catenin（1∶5000）、Vimentin（1∶5000）、E-cadherin（1∶10000）、GAPDH（1∶15000）]；次日，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗（1∶15000）孵育2 h；ECL檢測蛋白條帶；Image J軟件分析。

1.8 ?qPCR法檢測各組HK-2細(xì)胞中miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin mRNA表達(dá)

給藥24 h后，用總RNA快速抽提試劑盒提取總RNA。根據(jù)試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。miR-210正向引物購自廣州復(fù)能基因有限公司，反向引物來自試劑盒，引物序列均未知。其余引物均購自擎科生物有限公司，序列詳見表1。相對定量采用2-ΔΔCt法，U6或β-actin作為內(nèi)參。

1.9 ?免疫熒光法檢測各組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平

將細(xì)胞以5×104個/mL、1 mL/孔密度接種于24孔板爬片中；培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長至80%后進(jìn)行分組造模；每孔加適量4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定15 min；0.1%曲拉通通透10 min；5% BSA 封閉30 min；一抗4 ℃孵育過夜[HIF-1α（1∶500）、β-catenin（1∶500）、Vimentin（1∶400）、E-cadherin（1∶200）]；次日，室溫靜置30 min；熒光二抗（1∶200） 37 ℃避光孵育1 h；DAPI染核2 min，以上每個步驟間使用TBST清洗3次，5 min/次；抗熒光淬滅劑封片；正置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.10 ?統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性時，采用單因素方差分析，組間比較若方差齊時采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?LWDHD可減弱CoCl2對HK-2細(xì)胞的影響

培養(yǎng)24 h后，隨著CoCl2刺激劑量增加后，細(xì)胞從鋪路石到長梭形的形態(tài)學(xué)變化明顯，甚至大量死亡。詳見圖1。與0 μmol/L CoCl2組比較，200、300、400、800 μmol/L CoCl2組顯著降低了細(xì)胞活力（P＜0.01），而100 μmol/L CoCl2組無明顯變化（P＞0.05）。因此，在隨后實(shí)驗(yàn)中，CoCl2的劑量為200 μmol/L。增加LWDHD劑量作用于HK-2細(xì)胞后，與0 LWDHD組相比，20% LWDHD組細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01），2.5%、5%、10% LWDHD組無明顯變化（P＞0.05）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)LWDHD濃度選用10%。詳見圖2。與N組比較，M組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)增加（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），CoCl2成功誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT；與M組比較，LW組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）。詳見圖3、表2—3。免疫熒光結(jié)果證實(shí)CoCl2誘導(dǎo)缺氧24 h后HK-2細(xì)胞HIF-1α、β-catenin、Vimentin高表達(dá)，陽性信號分別定位于細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞膜；E-cadherin低表達(dá)，陽性信號定位于細(xì)胞質(zhì)。詳見圖4。

2.2 ?LWDHD下調(diào)CoCl2處理的HK-2細(xì)胞中miR-210的表達(dá)

與N組比較，M組HK-2細(xì)胞中miRNA-210表達(dá)水平增加（P＜0.01）；與M組比較，LW組HK-2細(xì)胞中miR-210表達(dá)水平降低（P＜0.05）。詳見圖5。

2.3 ?LWDHD通過下調(diào)miR-210減輕HK-2細(xì)胞EMT

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，LV-miR-210組HK-2細(xì)胞中miR-210水平高于LV-miR-210 NC組（P＜0.05），而LV-anti-miR-210組miR-210水平顯著低于LV-miR-210 NC組（P＜0.01），慢病毒轉(zhuǎn)染成功。詳見圖6。與LV-miR-210 NC組比較，LV-miR-210組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01）；與LV-miR-210 NC組比較，LV-miR-210組HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），抑制miR-210的表達(dá)可抑制EMT。與上述3組比較，在此基礎(chǔ)上加LWDHD的3組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01），LWDHD可通過下調(diào)miR-210/HIF-1α表達(dá)，抑制EMT。免疫熒光結(jié)果顯示：與LV-miR-210 NC組比較，LV-miR-210組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin高表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)；反之，LV-anti-miR-210組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin低表達(dá)，E-cadherin高表達(dá)。與上述3組比較，在此基礎(chǔ)上加LWDHD的3組HK-2細(xì)胞中HIF-1α、β-catenin、Vimentin低表達(dá)，E-cadherin高表達(dá)。詳見圖7—8，表4—5。

3 討論

LWDHD為北宋時期錢乙所創(chuàng)制，收錄于《小兒藥證直訣》，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓組成，具有三補(bǔ)三瀉的特點(diǎn)。熟地黃滋陰補(bǔ)腎，山茱萸補(bǔ)養(yǎng)肝腎，山藥補(bǔ)益脾陰，為“三補(bǔ)”；澤瀉利濕泄腎濁，牡丹皮清瀉虛熱，茯苓淡滲脾濕，為“三瀉”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣和血關(guān)系密切，氣行則血行，氣滯則血瘀，因此，腎氣虛可導(dǎo)致血瘀，進(jìn)而引致腎內(nèi)缺氧。熟地黃、山茱萸、山藥能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，提高機(jī)體抗氧化能力，改善腎氣虛，糾正腎內(nèi)缺氧。澤瀉、牡丹皮、茯苓具有活血散瘀、滲濕利水瀉熱功效。LWDHD是目前臨床治療CKD的有效方劑[14]。

近期研究證實(shí)，miR-210是一種重要的低氧相關(guān)miRNA，其莖-環(huán)結(jié)構(gòu)位于染色體11p15.5上AK123483基因轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子中，受缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)，后者參與EMT的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15-16]。反過來，miR-210表達(dá)增加也可以促進(jìn)HIF-1α表達(dá)。Vimentin是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，參與形成和維護(hù)細(xì)胞間的連接。HIF-1α的下游調(diào)控因子β-catenin在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。在正常情況下，β-catenin參與E-cadherin與肌動蛋白的連接，促進(jìn)誘導(dǎo)EMT的基因轉(zhuǎn)錄。HIF-1α對EMT的調(diào)節(jié)作用部分受β-catenin的調(diào)控[17]。

EMT引起腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎損傷。CoCl2是一種常用的化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑，已廣泛用作EMT和缺氧損傷誘導(dǎo)劑[18-20]。本研究使用CoCl2在HK-2細(xì)胞中構(gòu)建EMT模型，模擬RF的病理過程。結(jié)果顯示，CoCl2降低了細(xì)胞活力，誘導(dǎo)EMT間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)升高（P＜0.01），上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低（P＜0.01），HIF-1α、β-catenin表達(dá)降低（P＜0.01），表明EMT模型構(gòu)建成功。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究LWDHD對CoCl2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT的影響。以往主要通過TGF-β/Smad途徑研究LWDHD對RF的影響。例如，有研究表明在糖尿病腎病大鼠中，六味地黃丸通過抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad2磷酸化和α-SMA的表達(dá)來保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞并預(yù)防RF[21]。本課題組前期研究已證實(shí)，LWDHD可以上調(diào)5/6腎切除大鼠腎組織中E-cadherin的表達(dá)，并下調(diào)HIF-1α和Twist的表達(dá)，從而延緩RF[22]。本研究結(jié)果顯示：LWDHD可減輕CoCl2對HK-2細(xì)胞的影響，表現(xiàn)為EMT間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），HIF-1α、β-catenin表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。隨后檢測miR-210在HK-2細(xì)胞中的表達(dá)水平，CoCl2誘導(dǎo)條件下miR-210表達(dá)水平升高（P＜0.01），經(jīng)LWDHD處理后，miR-210表達(dá)水平降低（P＜0.05）。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染miR-210抑制、過表達(dá)、空載體慢病毒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制miR-210可降低CoCl2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT，反之，過表達(dá)miR-210則加重EMT。在慢病毒轉(zhuǎn)染各組的基礎(chǔ)上，加入LWDHD處理后，LWDHD可降低各組HIF-1α、β-catenin、Vimentin表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。上述結(jié)果說明，miR-210/HIF-1α信號通路可促進(jìn)EMT的發(fā)生發(fā)展，而LWDHD可抑制miR-210的表達(dá)，提示LWDHD可能通過調(diào)節(jié)miR-210調(diào)控EMT。

綜上所述，LWDHD能顯著提高CoCl2處理的HK-2細(xì)胞的存活率，并改善EMT；在CoCl2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中，miR-210高表達(dá)，LWDHD可下調(diào)miR-210/HIF-1α信號通路，進(jìn)而抑制腎小管EMT，從而延緩RF。

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〔收稿日期〕2022-09-02

〔基金項(xiàng)目〕湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021JJ30506）；湖南省教育廳項(xiàng)目（21A0242，20C1398）；長沙市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（kq2014089）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（2021CX32）。

〔第一作者〕張海英，女，碩士研究生，研究方向：腎纖維化病理機(jī)制及防治。

〔通信作者〕*劉春燕，女，博士，副教授，E-mail：liuchunyan0221@126.com；唐 ?群，男，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：tangqun460@126.com。