段先莉 賈子民 許炎芬 龍同 王硯妮 李文靜 趙錦芳

摘要：白僵菌屬是一類重要的真菌，球孢白僵菌為該屬典型蟲生真菌，因其寄主范圍廣、適應性強、致病性高、對環(huán)境無污染的特點，成為農(nóng)林害蟲生物防治中應用最廣泛的蟲生真菌之一。本文綜述了白僵菌的致病機理、產(chǎn)酶特性及其應用方面的研究進展，旨在為白僵菌的開發(fā)應用提供一定參考。

關鍵詞：白僵菌；球孢白僵菌；酶；生物防治

中圖分類號：S476.12文獻識別碼：A文獻編號：1005-6114（2023）02-013-06

1白僵菌的分類及侵染過程

1.1白僵菌的分類

白僵菌（Beauveria spp）的發(fā)現(xiàn)始于意大利學者Agostino Bassi，直到1912年被Vuillemin正式命名為白僵菌屬［1］。白僵菌屬自建立以來，對于種水平的分類沒有統(tǒng)一的認識，甚至存在很大的分歧。傳統(tǒng)的分類是以分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)作為分類的依據(jù)，主要為分生孢子、分生孢子梗、產(chǎn)孢軸、產(chǎn)孢細胞的形狀和大小以及菌落的形態(tài)。截至2018年初，全球報道的白僵菌已有18種，其中我國發(fā)現(xiàn)了4種白僵菌，分別是球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）、多形白僵菌（Beauveria amorpha）和蘇格蘭白僵菌（Beauveria caledonica）。其中球孢白僵菌和布氏白僵菌是重要的應用于害蟲生物防治的蟲生真菌。

1.2球孢白僵菌的侵染過程

球孢白僵菌可以通過昆蟲體壁、消化道、氣管和傷口侵入蟲體。最初分生孢子附著于蟲體表面；在適宜的溫度與濕度下，分生孢子萌發(fā)；隨后對蟲體角質(zhì)層產(chǎn)生機械壓力，白僵菌產(chǎn)酶溶解表皮并進入體內(nèi)；菌絲繁殖并進入蟲體的血淋巴產(chǎn)生菌絲體，其次級代謝產(chǎn)物破壞蟲體的生理過程［2-3］，攻擊宿主的防御系統(tǒng)，然后開始旺盛地生長，最終導致蟲體的死亡，隨后菌絲穿出表皮產(chǎn)生分生孢子并擴散［4］。劉忱等以玉米螟為研究對象，用電鏡觀察了白僵菌在蟲體內(nèi)的生長循環(huán)：接種白僵菌24 h后，分生孢子萌發(fā)并侵入昆蟲體內(nèi)，它們可以穿透體壁，進入體腔，進行普遍感染；接種48 h后，菌絲侵入血腔，出芽繁殖，直至腔體內(nèi)充滿菌絲，再突出體表向外生長；接種72 h后大量菌絲相互纏繞，覆蓋蟲體，同時存在菌絲消解現(xiàn)象，部分菌絲只?？涨唬?］。

2球孢白僵菌侵染過程誘導產(chǎn)酶特性2.1細胞壁降解酶

球孢白僵菌感染蟲體時，孢子附著在昆蟲表皮上形成附生菌。附生菌首先產(chǎn)生脂肪酶，脂肪酶水解蟲體體壁內(nèi)脂蛋白、脂肪和蠟的酯鍵，促進孢子滲透蟲體角質(zhì)層［6］。研究表明，脂肪酶通過增加真菌和角質(zhì)層表面之間的疏水相互作用來支持發(fā)芽孢子與昆蟲角質(zhì)層的粘附［3］。此外，脂肪酶的作用不僅消除了孢子入侵的屏障，其降解昆蟲的表皮成分也可為白僵菌的萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)［6］。

其次附生菌產(chǎn)生蛋白酶。蛋白酶在感染過程中起著雙重作用。蛋白酶主要功能是水解表皮蛋白，但在昆蟲表皮中抗真菌蛋白的失活中也發(fā)揮作用［3］。蛋白酶的底物為類枯草桿菌蛋白酶（Prl）和絲氨酸類胰蛋白酶（Pr2）。Pr1具有重要意義，其基因的表達產(chǎn)物能夠引起蟲體免疫系統(tǒng)的紊亂，并激活蟲體內(nèi)多酚氧化酶系發(fā)生氧化反應，最終導致蟲體中毒死亡。Pr2的作用機理尚不明，需要進一步研究，猜測為Pr2對Pr1可能存在誘導作用，能調(diào)節(jié)Pr1產(chǎn)生的快慢［7］。

最后附生菌產(chǎn)生的酶是幾丁質(zhì)酶，可水解由β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖組成的甲殼素線性聚合物（幾丁質(zhì)）。幾丁質(zhì)酶根據(jù)對幾丁質(zhì)分子的作用位置分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（水解幾丁質(zhì)分子內(nèi)的β-1，4-糖苷鍵）和外切幾丁質(zhì)酶（水解內(nèi)切幾丁質(zhì)酶作用形成的N-乙酰谷氨酸-可溶性寡聚體）。昆蟲幾丁質(zhì)的完全降解需要內(nèi)切酶和外切酶的聯(lián)合作用［3］。

2.2核毒素

白僵菌在抑制蟲體的免疫力時會分泌核毒素（Rib）。核毒素是細胞外分泌的核糖核酸酶（RNase），可使生物體的核糖體失活。核糖核酸酶通過切割核糖體sarcin/ricin loop（SRL）的單個磷酸二酯鍵，導致核糖體完全失活，并因細胞凋亡而死亡。Rib通過抑制宿主的免疫力、阻斷宿主翻譯而促進感染，有助于白僵菌的致病性。Yi Yuan等發(fā)現(xiàn)Rib基因的缺失會導致感染過程中毒力的減弱；將Rib進行重組純化后與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌共同注射可以顯著增強細菌的致病性［8］。白僵菌核毒素是抑制蟲體免疫的關鍵毒力因子?，F(xiàn)階段對于核毒素是如何進入昆蟲宿主細胞以及對真菌本身是否會有不利影響、真菌如何保護自己的核糖體難以確定，需要進一步的研究證實。

2.3蟲體解毒和防御相關酶

昆蟲在受到白僵菌或其他真菌感染時，會觸發(fā)自身的防御和解毒機制。谷胱肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）、乙酰膽堿脂酶（AChE）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）是此過程中最常見的酶［9］。GST在對氧化應激的解毒和細胞抗氧化防御中起著關鍵作用，它與天然和合成的外源性異生物素的親電中心結(jié)合；AChE是一種絲氨酸水解酶，通過參與乙酰膽堿（神經(jīng)遞質(zhì)）的快速水解終止神經(jīng)沖動；CAT通過參與H2O2的清除來保護宿主免受氧化損傷；SOD可以迅速上調(diào)以應對外來生物的威脅。昆蟲以上酶活性的變化受感染真菌的影響。

白僵菌孢子與植物醇聯(lián)合使用感染宿主，感染前期時宿主的GST、CAT、SOD活性增加，AChE與處理濃度呈反比關系。感染后期四種酶的活性降低。綠僵菌與殺蟲劑聯(lián)合使用感染宿主：感染初期各種酶的活性增加，后期活性降低。昆蟲體內(nèi)酶的變化破壞了內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［10-12］。了解每種酶單獨或組合的響應規(guī)律和活性將為設計新穎且更有效的害蟲防治手段提供幫助。

球孢白僵菌Gas3β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶有助于真菌適應極端堿性條件。真菌β-1，3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是一種與脅迫反應、細胞壁完整性和毒力有關的細胞壁重塑酶［13］。聚酮化合物合酶BbpksP的產(chǎn)物有助于增加白僵菌分生孢子細胞壁的完整性、紫外線耐受性和殺蟲活性［3］。

2.4海藻糖酶

昆蟲體內(nèi)的能量物質(zhì)主要以海藻糖（trehalose）的形式貯存，海藻糖是一種非還原性的二糖，能提供昆蟲攝食、尋偶、遷飛等生命活動所需的能量，同時也是一種重要的壓力保護劑，可幫助昆蟲抵抗非生物脅迫，包括氧化、高滲透壓、營養(yǎng)饑餓等［6］。病原真菌在蟲體內(nèi)能利用的糖類物質(zhì)主要是葡萄糖，因此，病菌需要將海藻糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖才能吸收利用。病原真菌分泌海藻糖酶的能力越強，其對蟲體內(nèi)海藻糖的水解和轉(zhuǎn)化速度就越快，越有利于病原真菌的繁殖和感染，同時也能破壞昆蟲體內(nèi)的血糖平衡，加速昆蟲的死亡［3］。

白僵菌產(chǎn)生酸性海藻糖酶，是多數(shù)真菌利用胞外海藻糖的主要酶類，其水解海藻糖轉(zhuǎn)變成葡萄糖分子，為白僵菌提供營養(yǎng)。白僵菌海藻糖酶不直接參與角質(zhì)層的消化，但其活性可作為反映菌種致病力的一個重要因子［3］。

3白僵菌的應用

3.1害蟲生物防治

球孢白僵菌因宿主范圍廣、致病性強、適應性強、針對性強、使用方便、無污染等特點被廣泛用于農(nóng)林害蟲的生物防治。白僵菌最初的使用是由綠僵菌防治奧地利金龜子引發(fā)的，隨后開始用于防治松毛蟲、蚜蟲和粉虱。鄭惠成研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌可有效防治油桐鷹尺蠖，且白僵菌對鷹尺蠖的殺蟲活性與高劑量的滅多蟲和氯氰菊酯相當［14］。

隨著對生物防治劑了解的不斷深入，研究者不再把目光集中在單獨使用某種藥劑上，開始研究不同生物防治劑、生物防治劑與化學物質(zhì)的聯(lián)合使用。但是聯(lián)合使用會表現(xiàn)出不同的相互作用，如協(xié)同、拮抗作用等。白僵菌與管氏腫腿蜂的聯(lián)合使用能有效地控制桑天牛，兩者的結(jié)合使用比單一的使用有更高的致病力，但是，白僵菌和管氏腫腿蜂之間還存在共同宿主的競爭關系，兩者競爭食物來源，目前關于如何調(diào)節(jié)協(xié)同或拮抗關系的機制還不清楚，有待進一步研究。在綠僵菌與殺蟲劑的聯(lián)合使用中，合適的比例能有效增加飛蝗的死亡率，當殺蟲劑的比例過大時就會產(chǎn)生拮抗作用［12］。Ahmed Mohammed AlJabr等在研究白僵菌孢子與植物醇的聯(lián)合使用時發(fā)現(xiàn)，拮抗作用的出現(xiàn)可能是白僵菌孢子粉比例較高所致［11］。將植物醇和白僵菌孢子粉調(diào)整至合適的配比后混合使用，能產(chǎn)生極強的協(xié)同殺螨作用，同時還能降低蟲體抗藥性。白僵菌作為生物農(nóng)藥單用或者與其他措施聯(lián)合使用在實際生產(chǎn)應用中會受到溫度和濕度等因素的影響［15-16］。近年來，全球變暖影響白僵菌的防治效果，因此篩選具有耐熱性能的球孢白僵菌菌株是目前普遍關注的研究方向。

3.2植物內(nèi)生菌

在所有微生物中，植物內(nèi)生真菌廣受關注。它們使植物具有更好的性能，增強植物對生物和非生物脅迫的抗性。如白僵菌接種到玉米種子中作為內(nèi)生菌，可改善玉米植物的開花時間和耐旱性；內(nèi)生白僵菌能夠提高紅橡樹苗的抗旱能力，并且能刺激根的生長［17-19］。

3.3發(fā)酵產(chǎn)酶

Alves等2020年發(fā)現(xiàn)白僵菌的細胞壁降解酶具有高特異性、高穩(wěn)定性、高效、安全性及環(huán)境友好的特點［20］?？蓪Π捉┚M行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶、然后用超濾膜進行酶濃縮，但是該技術(shù)存在的問題是發(fā)酵期間酶產(chǎn)量低。

幾丁質(zhì)酶可以用于真菌原生質(zhì)體的分離、生物活性殼聚糖的制備、殼回收物中的寡糖以及單細胞蛋白的生產(chǎn)，具有免疫機能活化、抑制癌癥及高血壓、鎮(zhèn)痛止血除菌等特性，在醫(yī)藥、化妝品、食品、農(nóng)業(yè)害蟲防治等方面都有應用。Elawati等研究了白僵菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的活性，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的含量隨著發(fā)酵時間的增加而增加，在對數(shù)期時產(chǎn)酶量最佳［21］。張嘉鋮等在大腸桿菌中實現(xiàn)白僵菌幾丁質(zhì)酶基因的高效表達，使幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量大大提高［22］。Andrea Lovera等發(fā)現(xiàn)，重組幾丁質(zhì)酶明顯增強了白僵菌分生孢子對小蔗螟的毒力，300 g/mL的重組幾丁質(zhì)酶使得白僵菌的殺蟲效率達到96.7%（感染后14 d）［23］。

脂肪酶水解三酰基甘油的酯鍵，從而釋放出游離脂肪酸、二酰基甘油、單酰基甘油和甘油。Enrico Cerioni Spiropulos Gonalves等選擇白僵菌作為生產(chǎn)脂肪酶的菌株，然后在構(gòu)巢曲霉中表達，并調(diào)節(jié)碳源以增強重組脂肪酶的分泌，以固定化手段增強脂肪酶的催化，成功地從常見的食物殘渣中獲得生物柴油［24］。生物柴油更加清潔、更高的含氧量、低含硫量，而且具有高度的生物降解性和無毒性。Malena Martínez Pérez等選用白僵菌產(chǎn)脂肪酶，然后用脂肪酶生產(chǎn)油酸和亞油酸［25］。

3.4生物催化劑

R-2-（4-羥基苯氧基）丙酸（R-HPPA）是合成芳氧苯氧丙酸除草劑的關鍵手性中間體。R-HPPA可通過化學法、生物學法獲得。化學法的成本高昂、獲得率低限制了工業(yè)應用的發(fā)展。生物學法中的全細胞催化法比過氧化物酶催化法更易操作、對映選擇高。為了獲得更高產(chǎn)量的R-HPPA，可將深層發(fā)酵改為固態(tài)發(fā)酵［26］。因為固態(tài)發(fā)酵不僅提高產(chǎn)量、改善產(chǎn)品特性，而且無大量廢水產(chǎn)生、無機械能消耗。研究數(shù)據(jù)顯示，使用固態(tài)發(fā)酵R-HPPA的獲得率可達到77.78%，相比于深層發(fā)酵提高了15.14%。Hu Hai-feng等人的研究結(jié)果顯示，通過聯(lián)合誘變可提高R-HPPA的產(chǎn)量，而且經(jīng)過誘變后的白僵菌菌株具有更好的底物耐受性［27］。為了改進球孢白僵菌的R-HPPA生物合成，Zhou Hai-Yan等提出并優(yōu)化了一種基于氧化劑重鉻酸鉀與R-HPPA產(chǎn)物顯色反應的高通量篩選方法［28］。

具有6、19-環(huán)氧乙烷橋的類固醇化合物具有抗驚厥和止痛特性，而且可以抑制革蘭氏陽性細菌活性和選擇性的抗谷氨酸皮質(zhì)類固醇激素作用。白僵菌經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化能獲得此類固醇新的衍生物［29］。

球孢白僵菌對黃酮類化合物具有O-甲基糖基化作用。Penso等利用球孢白僵菌B. bassianaATCC 7159催化柚皮素和槲皮素糖基化生物合成7-β-O-糖苷。所生成的柚皮素-7-β-O-糖苷和槲皮素-7-β-O-糖苷也具有增加毛細血管的張力，降低血管緊張度的特性。但是，與柚皮素和槲皮素相比，兩種糖苷降低血管舒張度的效果存在差異，推測可能存在不同的作用途徑［29］。

3.5抗腫瘤作用

真菌多糖是真菌中的有效生物活性成分，能夠增強機體的免疫功能，并在抗腫瘤方面發(fā)揮積極作用。宋志強使用不同濃度的白僵菌多糖溶液分別刺激B淋巴細胞和小鼠腸癌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白僵菌多糖對B淋巴細胞有增殖作用，對小鼠腸癌細胞具有抑制作用，說明白僵菌多糖具有保護機體的作用，但是免疫機制與腫瘤機制需要進一步研究［30］。白僵菌素和球孢交酯對腫瘤細胞具有強大的細胞毒性作用，能抑制結(jié)核分枝桿菌或惡性瘧原蟲的活性，并限制膽固醇?；D(zhuǎn)移酶抑制劑的活性［3］。Kim，Ki Hyun利用白僵菌分離得到了兩種新的差向異構(gòu)體磷丙二酮聚酮化合物，具有亞甲基橋連間苯三酚骨架和高度重排的支架；此外，首次從天然來源中分離出兩個苯丙二酮的二聚體，beauvetetraone C，研究發(fā)現(xiàn)beauvetetraones A-C對人體乳腺癌細胞表現(xiàn)出較弱的細胞毒性［31］。

白僵菌侵入蟲體后，造成死亡的僵化蟲體——白僵蠶，具有許多活性成分。如蛋白質(zhì)、維生素、酶、氨基酸、微量元素、有機酸、草酸銨、白僵菌素等活性成分，具有抑癌、抗驚厥、抗腫瘤作用。僵蠶中富含蛋白質(zhì)的提取物（BBPs）在體外具有潛在的抗癲癇作用［32］。該發(fā)現(xiàn)對開發(fā)用于治療癲癇的新藥有一定的幫助。僵蠶對肝細胞癌的作用主要與腫瘤的微環(huán)境有關，它通過調(diào)節(jié)巨噬細胞M1發(fā)揮抗癌作用。目前對于抗癌作用的研究集中在僵蠶的單一療法，未來可以結(jié)合中、西藥研究其作用機理［33］。僵蠶乙醇提取物（BBE）對胃癌、宮頸癌細胞具有凋亡作用，且該作用與基因調(diào)控具有相關性，如bcl-2和bax等。BBE的促凋亡活性與其調(diào)控Bcl-2和Bax基因表達的能力有關［34-35］。這說明僵蠶乙醇提取物在抗癌抗腫瘤方面具有潛在價值。但是在使用僵蠶做藥時要考慮安全性問題，需要進一步確認僵蠶中的成分是否有毒性。

3.6抗蒸騰劑

甘草是醫(yī)藥、食品和化妝品的原料，多分布于干旱和半干旱的荒漠草原、沙漠邊緣、黃土丘陵地區(qū)。水分是甘草在生長過程中的重要影響因素，植物體吸收的水分大部分都通過氣孔散失到大氣中。在研究微生物誘導的氣孔開閉運動時發(fā)現(xiàn)白僵菌可以誘導甘草的氣孔關閉，白僵菌的施用時間與氣孔開度之間有明顯的正相關關系，在處理時間為2 h時，氣孔開度最小［36］。

4總結(jié)與展望

生物防治在農(nóng)作物病蟲害綠色防控與“農(nóng)藥減施”方面發(fā)揮了十分重要的作用，部分白僵菌屬真菌具有重要的生防應用價值，但在生產(chǎn)實踐中，白僵菌屬真菌如球孢白僵菌的防治效果會因高溫、干燥或者陽光照射等不利環(huán)境因素的影響而大大降低，因此需要研究如何提高白僵菌對環(huán)境的耐受性。此外，當前白僵菌的研究已逐漸向多學科方向發(fā)展，如臨床醫(yī)學、林學、酶工業(yè)等方面，特別是白僵菌次級代謝產(chǎn)物對腫瘤的抑制具有潛在的價值。白僵菌發(fā)展?jié)摿薮?，有待深入開展相關理論與應用研究。

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