王慧敏，楊陽，逯陣毫，閆淼，王玉堂

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450000）

體外診斷試劑是指用于人體血清或血漿樣本檢測的試劑，其中包含試劑盒、校準品等產(chǎn)品，與儀器、設備或系統(tǒng)配合使用，也可單獨使用，最終對疾病預防、診斷、治療檢測、預后觀察［1］。體外診斷試劑穩(wěn)定性是指產(chǎn)品在生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的條件下儲存，在規(guī)定的時間內保持其性能特性的能力［2］。穩(wěn)定性作為評價體外診斷試劑保持產(chǎn)品性能的重要指標，對產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)、運輸、保存和使用等環(huán)節(jié)具有重要意義。在診斷試劑研發(fā)過程中，試劑的穩(wěn)定性是制約該類產(chǎn)品市場化的關鍵。國外已經(jīng)有多想有關穩(wěn)定劑的專利，而國內在診斷試劑穩(wěn)定性方面還在探索階段，其中包被抗原的穩(wěn)定劑是我國診斷試劑研發(fā)過程匯總必須克服的瓶頸技術。體外診斷試劑組成成分中包含化學及生物活性物質，保持這些成分物理、化學、生物特性是實現(xiàn)產(chǎn)品穩(wěn)定性的關鍵，任何影響產(chǎn)品組成成分特性的因素均有可能對產(chǎn)品穩(wěn)定性造成影響［3］。為此，本研究對診斷試劑盒穩(wěn)定性問題進行了剖析，篩選了一種包被抗原保護劑，以期為同類研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

表面羧基磁性納米微粒購自德國Merk 公司；磁微粒包被抗體、磁微粒酶標抗抗體，單克隆抗原購自鄭州伊美諾生物技術有限公司；牛血清白蛋白（BSA）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉（純度分析純）購自美國sigma 公司；2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）購自美國sigma 公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購自美國sigma 公司；N-羥基琥珀酰亞（NHS）購自美國sigma 公司；PVA80（聚乙烯醇）、聚氧乙烯-聚丙乙烯-聚氧乙烯（PEO-PPO-PEO）三嵌段共聚物購自美國sigma 公司；聚乙二醇（PEG）購自美國sigma 公司；磁微粒檢測混懸液，自制；

1.2 設備

化學發(fā)光免疫分析儀A2000 Plus（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；垂直混勻器（寧波新芝生物科技有限公司，型號：HS-3）；星星陳列柜（星星制冷設備有限公司，型號：LSC-518Y）；Sepmag A200 磁分離器；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司，型號：HH-B11·360-BS-II）

1.3 穩(wěn)定性考核實驗

采用EDC+NHS 活化磁微粒表面的羧基，后加入包被抗體通過與磁珠上活化后的羧基進行偶聯(lián)反應，具體步驟如下：抽取30 μL 磁微粒原液，用PBS 緩沖液（pH 7.0）洗滌4 次，每次5 min。洗滌結束后，去除上清，加入50 μL 20 mg/mL EDC MES 緩沖液和50 μL 20 mg/mL NHS MES 緩沖液，混勻并震蕩反應1 h，磁吸去除上清加入300 μL MES 緩沖液洗滌2 次，加入7.5 μL 包被抗體，震蕩反應2 h，去上清后加入300 μL 1% BSA 磷酸鹽緩沖液封洗10 min，重復洗滌3 次，磁吸去除上清。最后用1% BSA 磷酸鹽緩沖液定容至3 mL，2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 穩(wěn)定性考核實驗——酶、抗原

將包被好的磁微粒混懸液，酶標抗體單組份，抗原單組份分別放置于4℃、37℃，放置天數(shù)為4 d。放置結束后，將磁微粒混懸液放置于垂直混勻器上，混勻30 min，觀察是否混勻，并用移液槍吹打直至混勻。將37℃加速后的磁微?；鞈乙?、酶、抗原整套組合后，拆解酶和抗原，組合3 套試劑進行A2000 Plus 上機實驗。

1.5 抗原穩(wěn)定性影響因素——離子強度及pH

抗原溶液配置：配置不同摩爾濃度的磷酸鹽緩沖液，并調節(jié)至所需的pH 值，將抗原稀釋至緩沖液中，攪拌均勻。將不同摩爾濃度、不同pH 值的抗原溶液，分別放置4℃、37℃，放置天數(shù)為3 d。放置結束，將不同的抗原溶液放置與垂直混勻器上，混勻30 min，與4℃磁微?；鞈乙汉兔附M合成一整套試劑后，進行A2000 Plus 上機實驗。

1.6 抗原穩(wěn)定性影響因素——抗吸附

實驗中用的試劑瓶為普通的塑料瓶，表面具有疏水性，抗原是兩親自性的一種蛋白，一段具有親水端，一段為疏水鏈。在37℃加速過程中，溫度升高，布朗運動加速，抗原分子疏水端以疏水作用力吸附于瓶壁上，溶液中抗原濃度降低，可能造成37℃加速后，與4℃相比，整套試劑發(fā)光值降低。

本實驗選用硅化瓶，與普通的試劑瓶相比，其表面進行特殊的硅化處理，其疏水性低，親水性增加。兩種瓶（硅化瓶和試劑瓶-對照）分別分裝抗原溶液，分別放置4℃、37℃，放置天數(shù)為3 d、7 d。放置結束后，將不同瓶的抗原溶液連瓶取出，放置混勻器上混勻30 min，與4℃磁微?；鞈乙汉兔附M合成一整套試劑，在A2000 Plus 上進行測試。

與此同時，也可嘗試在抗原溶液中的試劑瓶中，先加入親水性的阻斷劑如0.5%PVA、1%BSA和1%Casien，阻斷其在試劑瓶內壁上的吸附，過夜處理瓶子。將三種抗原溶液瓶子和對照（1%PBS）抗原溶液處理的瓶子，分別分裝抗原溶液，放置4℃、37℃，放置3 d。放置結束后，與4℃磁微粒混懸液和酶組合成一整套試劑，與對照整套試劑進行A2000 Plus 上機實驗。

1.7 抗原穩(wěn)定性影響因素——防聚集

聚合物分子通過吸附可有效的阻止顆粒間的聚集，是一種良好的分散劑，減少顆粒的團聚和沉積［4］，基于此理論基礎，通過加入醇類聚合物分子，少量吸附試劑瓶內部，大量吸附于抗原表面，探究對穩(wěn)定性的影響。納米顆粒的團聚和沉積

將三類聚合物分子PVA、PEO-PPO-PEO、聚乙二醇醇入抗原溶液中，分別分裝抗原溶液，放置4℃、37℃，放置3 d。放置結束后，與4℃磁微?；鞈乙汉兔附M合成一整套試劑，與對照整套試劑進行A2000 Plus 上機實驗。

2 結果

2.1 穩(wěn)定性考核實驗——酶、抗原

試劑組分：磁微粒、酶、抗原37℃加速4 d后，將三組分全部加速后組合上機檢測，與4℃全套試劑組分（磁微粒、酶、抗原）對比，發(fā)現(xiàn)發(fā)光值偏差降幅在55%左右。將37℃的磁微粒和抗原組分替換為4℃的磁微粒和抗原，即只將酶進行37℃加速4 d，與4℃全套試劑對比，發(fā)光值降幅明顯降低為6%。繼而將抗原單組份進行37℃加速4 d，發(fā)光值降幅為49%。由此可見，整套試劑加速后降幅較大（55%），穩(wěn)定性較差的主要原因是抗原單組份引起的，其加速后不穩(wěn)定，引起整套發(fā)光值降幅顯著升高。見表1。

表1 試劑組三組分加速后拆分穩(wěn)定性

2.2 抗原穩(wěn)定性影響因素——離子強度及PH

不同摩爾濃度及pH 值的磷酸鹽緩沖液稀釋抗原，制備成抗原溶液，37℃加速3 d 后發(fā)現(xiàn)：同樣摩爾濃度不同pH 值磷酸鹽緩沖液配置的抗原溶液，37℃加速后，穩(wěn)定性無明顯差異；同一pH 不同磷酸緩沖鹽溶液配置的抗原溶液，37℃加速后，穩(wěn)定性無明顯差異。由此可見，抗原緩沖液的離子強度和pH 對抗原穩(wěn)定性的影響不大。見表2。

表2 不同摩爾濃度及pH 抗原溶液穩(wěn)定性

2.3 抗原穩(wěn)定性影響因素——抗吸附

抗吸附分析包括硅化瓶比較實驗和熱封實驗，見表3、表4。將硅化瓶和試劑瓶（對照）進行37℃加速3 d、7 d 后，與4℃整套試劑對比，其整套試劑的發(fā)光值降幅較大；阻斷劑0.5%PVA、1%BSA、1%Casein 預處理瓶內壁后，抗原溶液37℃加速3 d 后，分別與4℃的全套試劑對比，發(fā)光值均降幅較大，無任何改善。

表3 硅化瓶處理后抗原溶液穩(wěn)定性

表4 熱封實驗后抗原溶液穩(wěn)定性

由此得出，抗原穩(wěn)定性的降低并不是由于吸附到瓶身內壁抗原溶液濃度降低造成的，可能存在微量的抗原吸附于瓶內壁，但并不足以顯著的引起發(fā)光值降低。

2.4 抗原穩(wěn)定性影響因素——防聚集

如表5 所示，PVA，PEO-PPO-PEO、PEG 加入到抗原溶液中（添加比例0.1%），分別放置37℃進行加速3 d 后，與對照相比，發(fā)現(xiàn)抗原溶液中加入PVA、PEG，發(fā)光值降幅仍然較大；抗原溶液中加入PEO-PPO-PEO，加速3 d 后，與對照比，其發(fā)光值降幅得到明顯的提升。將抗原溶液放置37℃加速7 d，其中泊洛沙姆12600、泊洛沙姆14600 發(fā)光值幾乎不再降低，對照降幅在50%左右，而泊洛沙姆8400 穩(wěn)定性較差，發(fā)光值降幅較大；將泊洛沙姆12600、泊洛沙姆14600 繼續(xù)加速考核至10 d，其發(fā)光值降幅依然沒有明顯增加，而對照則降幅持續(xù)升高至60%；重復泊洛沙姆12600、泊洛沙姆14600 考核穩(wěn)定性，37℃ 3 d，其穩(wěn)定性依然較對照有顯著提升。

表5 不同聚合物分子對抗原穩(wěn)定性的影響

取出試劑瓶觀察發(fā)現(xiàn)，如圖1 所示：放置10 d 后，4℃放置的試劑瓶瓶內的抗原溶液均為透明無色的溶液；37℃放置10 d，對照組瓶內溶液顏色透明度發(fā)生明顯變化，對照組抗原溶液成渾濁狀態(tài)，而加入泊洛沙姆12600、泊洛沙姆14600的抗原溶液仍為透明的液體。筆者猜測：高分子聚合物具有兩親性，疏水端吸附于抗原的疏水端，增加抗原的親水性，提高抗原的穩(wěn)定性。

圖1 抗原溶液透明度對照

3 討論

本研究通過拆分實驗，得出抗原單組份不穩(wěn)定，并從pH、離子強度，瓶身吸附，聚集等幾個方面分別分析了抗原溶液不穩(wěn)定的因素。實驗結果表明，抗原溶液熱加速后不穩(wěn)定，通過改變抗原溶液粒子濃度、pH，更換不同廠家的BSA 及試劑瓶的親水預處理，抗原溶液的穩(wěn)定性均未的到解決。通過抗原溶液中加入聚醚類高分子，其穩(wěn)定性得到明顯改善提升。聚合物分子具有良好的可溶解性，溶解于抗原溶液中。高分子聚合物PEO-PPO-PEO 具有生物相容性，被廣泛應用于藥物遞送［4-5］、基因載體［4］介孔材料制備［6-7］、酶修飾［8-9］等領域。其具有兩親性，其疏水基通過疏水作用力與抗原的疏水部分結合，親水基暴露與外側，增加了抗原的溶解性，提升抗原在溶液中的穩(wěn)定性。與此同時，聚合物分子吸附于抗原表面，增加了抗原分子空間位阻，降低抗原自聚，提高抗原的分散性，提升抗原穩(wěn)定性。