王玉堂，逯陣毫，馬明，閆淼，陳永奇，渠海

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

近年來，化學發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA）發(fā)展如火如荼，該分析方法是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術。在化學發(fā)光免疫分析平臺中，有辣根過氧化物酶-魯米諾體系、堿性磷酸酶-3-（2'-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-（3"-磷酰氧基）苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷體系［1-2］、吖啶酯-H2O2體系等，其中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）是一種水解酶，在堿性環(huán)境中能水解很多磷酸單酯化合物。該酶的用途廣泛，它可以作為某些疾病的標志物，也經(jīng)常用于在酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）中標記抗體或抗原，進而幫助檢測相應的抗原或抗體的含量［1］。然而堿性磷酸酶來源于多種渠道，比如大腸桿菌、小牛腸等，而不同廠家的提取工藝又千差萬別，這就導致市場上堿性磷酸酶的活性魚龍混雜，能應用于化學發(fā)光免疫分析領域的堿性磷酸酶需要仔細甄別和評價。為此，我們通過化學發(fā)光免疫分析的方法評估了商業(yè)化的不同廠家的AP，甄選出廠家S 的堿性磷酸酶能夠較好地應用于化學發(fā)光免疫分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

堿性磷酸酶A01B03-X（廠家C）、堿性磷酸酶A01B03-X1（廠家C）、堿性磷酸酶S1（廠家S）、4-（N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（SMCC，sigma）、2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽（aladdin 生產(chǎn)）、磁微粒促甲狀腺激素混懸液（廠家A）、磁微粒促甲狀腺激素酶稀釋液（廠家A）、全自動免疫檢驗系統(tǒng)用底物液（廠家M），磁微粒促甲狀腺激素校準品（廠家A），內(nèi)分泌質(zhì)控（廠家A），促甲狀腺激素（TSH）抗體（廠家A）；磁微粒促甲狀腺激素檢測試劑盒（廠家M）。全自動化學發(fā)光分析儀（CL-2000i，廠家M）；全自動化學發(fā)光分析儀（型號A2000PLUS，廠家A）。

1.2 方法

堿性磷酸酶-抗體標記物的制備：目前常用的用于蛋白質(zhì)交聯(lián)的交聯(lián)劑種類繁多，比如同端雙功能交聯(lián)劑有：戊二醛、雙琥珀酰亞胺辛二酸酯鈉鹽、雙琥珀酰亞胺戊二酸酯、3,3'-二硫代二丙酸二（N-羥基丁二酰亞胺酯）、二（N-琥珀酰亞胺）乙烯乙二醇二琥珀酸酯；異端雙功能交聯(lián)劑有：3-馬來酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯、6-（馬來酰亞胺基）己酸琥珀酰亞胺酯、4-（N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯等。但被成熟應用的主要有戊二醛、馬來酰亞胺-琥珀酰亞胺系列交聯(lián)劑。這兩種交聯(lián)劑都屬于雙功能交聯(lián)劑，在交聯(lián)過程中可避免破壞蛋白質(zhì)的自身結構，不影響其生物活性。本實驗室重點對琥珀酰亞胺基-［4-（N-馬來酰亞胺甲基）］-環(huán)己烷-1-甲酸-（6-氨基己酸酯）（LC-SMCC）的交聯(lián)方法［3］做了探索，并優(yōu)化出了一套較為成熟的AP 標記工藝，其過程如下（以下稱為LC-SMCC 法）：①AP的馬來酰胺化。取1.9 mg，溶于190 μL DMSO 中；用PBS 溶解AP，并調(diào)整濃度至5 mg/mL；將5 μL LC-SMCC 溶液和10 μL AP 溶液相混合，在25℃下孵育2 h；再將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在pH 7.0 的PBS 透析6 h，期間更換一次透析液；取出透析物，備用。②促甲狀腺素抗體的巰基化。將單抗用pH 7.0 的PB 調(diào)整至2.5 mg/mL；將2 μL 的ITL水溶液（10 mg/mL）加入到100 μL 的促甲狀腺激素單抗PBS 溶液中（2.5 mg/mL），混勻后調(diào)節(jié)pH 8.0，在室溫25℃下振蕩反應2 h；再將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在pH7.0 的PBS 透析6 h，期間更換一次透析液；取出透析物，備用。③標記和純化。將馬來酰胺化的AP 和巰基化的單抗混合，在室溫25℃振蕩反應2 h；取出加入等體積甘油，存放2～8℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 幾種堿性磷酸酶標記物性能評價

將3 種堿性磷酸酶標記的TSH 抗體搭配磁珠試劑制備成3 套工作試劑，分別在廠家A 全自動化學發(fā)光測定上按樣本100 μL、磁珠試劑20 μL、酶試劑50 μL 的加樣量，以一步法測試磁微粒TSH項目。

1.3.1 校準品梯度以及信號值評價 將廠家A 磁微粒TSH 試劑的校準品分別用上述3 套工作試劑進行檢測，可得到三種堿性磷酸酶用同一種工藝進行抗體標記后的校準品梯度和信號值，其中抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物用廠家A 酶稀釋液稀釋2 000 倍。

1.3.2 靈敏度考核 連續(xù)測定20 次濃度值為0 的校準品S0，計算發(fā)光值的平均值（average,AV）和標準差（standard deviation,SD），在校準曲線上回算出信號值M+2SD 的濃度值，即為最低檢測限。最低檢測限是一個試劑盒靈敏度最關鍵的指標。

1.3.3 精密性考核 將廠家A 內(nèi)分泌質(zhì)控成品（其中包含高值約1 000 mIU/mL、中值約100 mIU/mL、低值約10 mIU/mL），用自制的磁微粒TSH 堿性磷酸酶檢測試劑進行測試，測試方案為：第一天分別高中低值質(zhì)控品各5 孔，第二天、第三天、第四天、第五天分別測試高中低值質(zhì)控品各兩孔，計算第一天各個濃度值5 個信號值的變異系數(shù)（coefficient of variation,CV），即得到試劑盒的分析內(nèi)精密性，然后計算每個濃度值13 個信號值的變異系數(shù)，即為試劑盒的分析間精密性。

1.3.4 不同試劑盒臨床對比 ①取10 份臨床樣本按照標準處理，無溶血或脂血現(xiàn)象，在-20℃保存不超過三周；②經(jīng)廠家M 公司促甲狀腺激素檢測試劑盒（堿性磷酸酶促發(fā)光法）測定；③在0～30 mIU/mL 范圍內(nèi)均勻分布。

2 結果

2.1 不同堿性磷酸酶所建試劑盒的信號值以及校準品梯度

將不同堿性磷酸酶標記TSH 抗體，制成三個磁微粒TSH 檢測試劑盒，并進行校準品信號值以及梯度對比，見表1。

表1 不同AP 標記抗體后試劑盒發(fā)光值對比

從表1 中可知：廠家S 堿性磷酸酶制備的試劑盒不僅本底較低，靈敏度較高，且信號值最高達到五百萬；而廠家C 堿性磷酸酶試劑盒本底均較高，且靈敏度較低，信號值均不超過三百萬，顯然，這兩個試劑盒是不足以應用的。接下來，只評價廠家S 堿性磷酸酶試劑盒。

2.2 靈敏度考核

分別由廠家S 的堿性磷酸酶S1 和廠家C 的堿性磷酸酶A01B03-X、A01B03-X1 標記TSH 抗體而得的酶試劑測定所得的最低檢測限為0.01 mIU/mL、0.16 mIU/mL、0.06 mIU/mL。因此本指標中廠家S 的堿性磷酸酶S1 最優(yōu)，而與廠家C的A01B03-X1 次之，廠家C 的堿性磷酸酶A01B03-X 最差。

2.3 精密性考核

通過以上兩個性能指標的考核，確定廠家S的堿性磷酸酶S1 標記TSH 抗體得到的酶試劑最優(yōu)，故精密性只進行該酶試劑的考核。進行精密性考核后得到該磁微粒TSH 檢測試劑盒的高中低質(zhì)控分析內(nèi)精密性分別為2.64%、1.75%、1.68%，分析間精密性分別為2.70%、1.96%、1.32%。該試劑盒的精密性性能滿足體外診斷試劑的國家要求。見表2。

表2 廠家S 堿性磷酸酶試劑的精密性考核（%）

2.4 臨床相關性

征集10 例按照樣本處理要求處理的血清樣本，分別用廠家A 磁微粒TSH 檢測試劑、廠家M磁微粒TSH 檢測試劑、由廠家S 堿性磷酸酶S1 標記TSH 抗體制成的磁微粒TSH 檢測試劑測定，計算結果后比較彼此之間臨床相關性，見圖1～3、圖1 以廠家A 磁微粒TSH 試劑測定結果為橫坐標，廠家M 磁微粒TSH 試劑測定結果為縱坐標；圖2 以廠家A 磁微粒TSH 試劑測定結果為橫坐標，自制堿性磷酸酶磁微粒TSH 試劑測定結果為縱坐標；圖3 以自制堿性磷酸酶磁微粒TSH 試劑檢測結果為橫坐標，廠家M 磁微粒TSH 試劑檢測結果為總坐標，分別作兩組結果的相關性方程，并計算相關性系數(shù)R2。

圖1 廠家A 磁微粒TSH 試劑與廠家M 磁微粒TSH 試劑臨床相關性

圖2 廠家A 磁微粒TSH 試劑與廠家S 堿性磷酸酶自制磁微粒TSH 試劑臨床相關性

圖3 廠家M 磁微粒TSH 試劑與廠家S 堿性磷酸酶自制磁微粒TSH 試劑臨床相關性

通過對比三個試劑盒的臨床相關性可以得知，自制磁微粒TSH 檢測試劑與另外兩個市售的磁微粒TSH 檢測試劑盒在臨床相關系數(shù)R2上均能達到0.9 以上，初步說明自制磁微粒TSH 檢測試是可以在臨床上應用的。

3 討論

綜合以上評價結果，可以初步看出廠家S 的堿性磷酸酶活性較高，其來源于小牛腸膜［4］，較適合用于化學發(fā)光診斷試劑，廠家C 的兩批次堿性磷酸酶活性較低，信號值不能滿足化學發(fā)光試劑的臨床需求。而用廠家S 的堿性磷酸酶標記TSH 活材制得的磁微粒TSH 檢測試劑在各個方面的性能均表現(xiàn)較好并得到驗證，該堿性磷酸酶可用于臨床用化學發(fā)光診斷試劑的開發(fā)。

堿性磷酸酶已被廣泛用于化學發(fā)光診斷試劑，其是一種水解酶［5］，它的酶學性質(zhì)已經(jīng)被廣泛的研究，特別是對于從不同的來源中提取的堿性磷酸酶，在Km、Vmax、最適pH 和最適反應溫度等基本性質(zhì)方面進行了不同程度的深入研究。不同來源的堿性磷酸酶，其蛋白質(zhì)空間結構，活性等有很大不同，目前初步推測以上三種堿性磷酸酶之所以表現(xiàn)出較大的差別，是不同結構導致的，還需進一步更加詳細的研究。