趙雪杰,李曉娜,張璐,荊浩,種麗莉,呂毅(河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,鄭州 450018)

他汀類藥物作為主要的調(diào)脂類及心腦血管疾病預(yù)防的藥物,已被臨床上廣泛應(yīng)用,但其對患者的降脂效果和不良反應(yīng)存在較大的個(gè)體差異,部分人群會出現(xiàn)肌肉毒性,嚴(yán)重者出現(xiàn)橫紋肌溶解癥,這種差異的部分原因可能與遺傳因素相關(guān)[1]。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑,其分子作用機(jī)制是通過阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸的代謝途徑,減少血清和細(xì)胞內(nèi)的膽固醇的合成,從而使低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)的合成下降[2]。SLCO1B1的突變基因型會導(dǎo)致編碼的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1(OATP1B1)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性減弱,造成肝臟攝取藥物的能力下降,引起體內(nèi)他汀類的血藥濃度上升,從而增加了橫紋肌溶解癥或肌病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3]。載脂蛋白E(APOE)通過多種途徑參與機(jī)體的脂代謝過程,是影響機(jī)體血脂水平主要的內(nèi)在因素,APOE基因多態(tài)性被認(rèn)為是高脂蛋白血癥、心腦血管疾病、老年癡呆癥和動脈粥樣硬化等疾病的易感候選基因。研究表明,APOE2、APOE3和APOE4 載脂蛋白對不同的脂質(zhì)顆粒存在偏好性結(jié)合,其中APOE2和APOE3傾向于結(jié)合小顆粒脂蛋白(HDL),而APOE4傾向于結(jié)合大顆粒脂蛋白(VLDL和LDL),從而造成不同基因型攜帶者的血脂水平存在一定的差異[4]。

為探討SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性在脂代謝異?；颊咧械谋硇颓闆r,本研究擬選擇154例脂代謝異常患者作為研究對象,113例健康志愿者作為健康人對照組,采用PCR-熒光探針技術(shù)檢測各組人群的SLCO1B1和APOE基因型,分析基因頻率分布特征并比較不同基因型組間各項(xiàng)血脂水平的差異,以及探討SLCO1B1和APOE基因型與各項(xiàng)血脂水平的相關(guān)性,以期達(dá)到指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用他汀類藥物的目的。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2019年1月至2021年12月鄭州頤和醫(yī)院收治的154例脂代謝異?；颊咦鳛榧膊〗M,其中男71例,女83例,年齡(49.2±13.4)歲。納入與排除標(biāo)準(zhǔn): (1)滿足三酰甘油(TG)≥1.70 mmol/L、總膽固醇(TC)≥5.72 mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)≥3.40 mmol/L和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)≤1.00 mmol/L中的任意一項(xiàng);(2)排除甲狀腺、糖尿病、冠心病及肝腎功能不全等疾病的病例;(3)排除正在服用他汀類以及其他降脂藥物治療的患者。同期選取體檢健康者113例作為健康人對照組,其中男51例,女62例,年齡(48.4±11.8)歲。所有納入的研究對象均為鄭州市籍貫漢族人群,本研究通過鄭州頤和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn),免除患者知情同意。

1.2儀器和試劑 AU5821型生化自動分析儀及配套的TC、TG、LDL-C和HDL-C試劑盒(貝克曼庫爾特公司),SLANP-96全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(上海宏石醫(yī)療科技公司),Biospin全血基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技公司,浙杭械備20150184),人類SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性檢測試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技公司)。

1.3SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性檢測

1.3.1基因組DNA提取 采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管采集受檢者晨起空腹靜脈血2～3 mL,使用Biospin全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系按照人類SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性檢測試劑盒說明書操作。根據(jù)SLCO1B1和APOE基因各SNP位點(diǎn)的不同多態(tài)性設(shè)計(jì)了4套特異性引物和探針組合,在1個(gè)反應(yīng)體系中通過兩種不同通道檢測1個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性。熒光信號采集通道:(1)SLCO1B1*1b 388A、SLCO1B1*5 521T、APOE2526C和APOE4388T通過FAM通道采集熒光信號;(2)SLCO1B1*1b 388G、SLCO1B1*5 521C、APOE2 526T和APOE4 388C通過VIC通道采集熒光信號;(3)內(nèi)標(biāo)基因通過ROX通道采集熒光信號。PCR反應(yīng)條件: (1)UNG處理,37 ℃ 10 min;(2)預(yù)變性95 ℃ 5 min;(3) 95 ℃ 15 s,共40個(gè)循環(huán)。

1.4血脂測定 采集受檢者清晨空腹靜脈血3～5 mL于促凝管中,1 500 r/min離心5 min,分離血清,采用AU5821型生化自動分析儀及其配套試劑檢測TC、TG、LDL-C和HDL-C等血脂水平指標(biāo)。 TC參考區(qū)間:2.85～5.70 mmol/L,TG參考區(qū)間:0.00～1.70 mmol/L,LDL-C參考區(qū)間:2.07～3.37 mmol/L,HDL-C參考區(qū)間:1.00～2.10 mmol/L。

2 結(jié)果

2.1SLCO1B1等位基因表型和等位基因頻率分布情況 疾病組和健康人對照組SLC01B1基因正常代謝型基因型均占比最高,分別為79.87%和85.84%,中間代謝型次之,分別為16.23%和13.27%,弱代謝型占比最低,分別為3.90%和0.88%。各基因表型頻率組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中疾病組各單體型頻率分布以*1b占比最高,為64.29%,*1a與*15分別為23.71%和11.70%,*5為0.31%。見表1。

表1 疾病組與健康人對照組SLCO1B1基因多態(tài)性分布比較[n(%)]

2.2APOE等位基因表型和等位基因頻率分布情況 疾病組和健康人對照組APOE基因表型E3占比均為最高,分別為66.88%和78.76%;疾病組E3基因表型明顯低于健康人對照組,疾病組E4基因表型明顯高于健康人對照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。疾病組APOE基因各等位基因頻率分布以E3型占比最高,為76.62%,E2型占12.01%,E4型占11.37%。見表2。

表2 疾病組與健康人對照組APOE基因多態(tài)性分布比較[n(%)]

2.3SLCO1B1和APOE基因各表型間血脂水平比較 高脂血癥患者的SLCO1B1基因表型正常代謝型組TG、TC和HDL-C的濃度均高于其余兩組基因表型,LDL-C濃度低于其余兩組基因表型;SLCO1B1基因各表型間的TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高脂血癥患者APOE基因表型E4組TC水平顯著高于E2組和E3組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);E2、E3和E4組TG、LDL-C和HDL-C水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 SLCO1B1和APOE基因各表型與血脂的關(guān)系

3 討論

近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,藥物治療處于傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)用藥向個(gè)性化用藥轉(zhuǎn)變的階段。他汀類降脂藥物為臨床上首選,可快速降低TC及LDL-C水平,還可降低TG水平并使HDL-C水平升高,是一種較為全面的降脂藥物[5]。根據(jù)基因檢測結(jié)果對患者實(shí)施個(gè)體化用藥治療,能夠有效提高藥物的臨床效果,并降低不良反應(yīng)的發(fā)生,以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。

本研究選擇了154例脂代謝異?；颊吆?13例健康志愿者,并對其進(jìn)行SLCO1B1和APOE基因表型的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂代謝異常患者和健康人對照組的SLCO1B1基因均以*1a/*1a、*1a/*1b及*1b/*1b正常代謝基因型為主,APOE基因主要以E3/E3和E2/E4表型為主,疾病組E3基因表型明顯低于健康人對照組,疾病組E4基因表型明顯高于健康人對照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而E4基因表型屬于腦梗死、冠心病及老年癡呆發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高的類型,臨床需要重點(diǎn)關(guān)注此類患者,同時(shí)需密切監(jiān)測可能出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)。本研究結(jié)果表明,SLCO1B1基因各表型與TG、TC、LDL-C、HDL-C等血脂水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;APOE基因各表型除TC水平存在明顯差異外(P<0.05),其余基因表型與TG、LDL-C、HDL-C等血脂水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究顯示[6-7],SLCO1B1在人群中以4號外顯子的388A>G位點(diǎn)和5號外顯子521T>C位點(diǎn)突變率最高,其中521T>C突變位點(diǎn)與他汀類藥物的療效有一定的相關(guān)性,521T>C突變導(dǎo)致的OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低已被公認(rèn),并證實(shí)與其嚴(yán)重不良反應(yīng)肌病相關(guān),但388A>G突變對他汀類藥物影響尚未明確,還需進(jìn)一步研究。另有研究表明[8],APOE基因編碼的蛋白質(zhì)為血漿蛋白,能與LDL受體和VLDL受體結(jié)合,參與脂質(zhì)代謝及膽固醇、TG的轉(zhuǎn)運(yùn)。APOE基因E4表型攜帶者發(fā)生老年性癡呆、動腦粥樣硬化、冠心病、腦梗死等疾病的風(fēng)險(xiǎn)增高,且臨床上他汀類藥物降脂效果差,E3/E4雜合基因型提示存在風(fēng)險(xiǎn),而E4/E4純合基因型則提示高危風(fēng)險(xiǎn),對此類高血脂患者應(yīng)使用小劑量他汀類藥物聯(lián)合其他降脂藥物才能達(dá)到更好的降脂效果[9-10]。

綜上所述,SLCO1B1基因頻率分布存在種族、地域差異性,高脂血癥患者的SLCO1B1基因多態(tài)性與血脂水平不相關(guān),而APOE基因多態(tài)性與各項(xiàng)血脂水平有一定的相關(guān)性趨勢;檢測SLCO1B1和APOE基因分型可提示高脂血癥患者使用他汀類藥物降脂的合理用藥劑量,以降低藥物不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。對考慮使用他汀類藥物進(jìn)行治療的脂代謝異常患者進(jìn)行SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性檢測,可實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥和安全用藥指導(dǎo)。

本研究的不足之處在于收集的血脂異?；颊呃龜?shù)較少,結(jié)果可能存在偶然性;此外,部分研究對象血脂存在明顯異常的數(shù)據(jù),并不能完全排除飲食干擾,這一部分的血脂數(shù)據(jù)會對SLCO1B1和APOE基因血脂水平相關(guān)性的結(jié)果造成影響;第三,本研究中納入的154例患者中有很多人并無明顯臨床癥狀,病因尚不明確,目前尚不能對其病因進(jìn)行分組,后續(xù)筆者會繼續(xù)追蹤,進(jìn)而完善研究內(nèi)容。