徐靜,周寶均,徐慶(無錫市中醫(yī)醫(yī)院 .輸血科,.檢驗(yàn)科,江蘇無錫 214001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種多發(fā)于青年女性的自身免疫性疾病,約70%～80%的SLE患者可出現(xiàn)狼瘡性腎炎(lupus nephritis, LN),其病變的嚴(yán)重程度與患者的預(yù)后密切相關(guān)[1-2]。目前,LN的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有以下幾種方法:尿蛋白、尿沉渣、腎小球?yàn)V過率檢測(cè)或者腎臟活檢[3-5]。然而,上述指標(biāo)異常往往發(fā)生在腎臟損害之后。因此,探索LN腎臟結(jié)構(gòu)破壞和腎功能喪失前的生物學(xué)標(biāo)志物顯得非常重要,這對(duì)于患者早期治療和延緩疾病進(jìn)程意義重大。

集落刺激因子-1(colony-stimulating factor-1, CSF-1)是一種在巨噬細(xì)胞分化、存活、增殖和活化過程中起重要作用的主要調(diào)節(jié)因子。研究表明,腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)CSF-1,而且隨著LN進(jìn)展,腎間質(zhì)細(xì)胞中CSF-1的表達(dá)水平明顯增多,并且可以誘發(fā)或加重LN[5]。因此,CSF-1可能作為L(zhǎng)N的檢測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物。本研究旨在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)LN患者血液和尿液中CSF-1水平,計(jì)算尿液中CSF-1與肝酐比值(CSF-1/Cr),并分析其與臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2021年1月至2022年8月于無錫市中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科就診的LN患者30例,女26例,男4例,年齡(34.2±2.7)歲?；颊咴\斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)SLE分類標(biāo)準(zhǔn)[6],均行腎臟穿刺病理檢查,常規(guī)行光鏡、免疫熒光及電鏡染色,且經(jīng)病理活檢證實(shí)為L(zhǎng)N。入選者為初治患者,未接受任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)感染,如肺炎(細(xì)菌、病毒或者真菌),肺結(jié)核,乙型肝炎和丙型肝炎,皮膚感染,中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染;(2)嚴(yán)重器官損害,如心臟衰竭,肝衰竭,腎衰竭,呼吸系統(tǒng)衰竭。應(yīng)用2000版SLEDAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)情況[7]。病理切片按2003年國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)/腎臟病理學(xué)會(huì)(ISN/RPS 2003)分型方案進(jìn)行分型[8]。從初次診治日期起,隨訪第1和第3個(gè)月。收集同期于體檢中心體檢,且性別和年齡匹配的體檢健康者20例作為健康人對(duì)照組,女18例,男2例,年齡(30.3±5.6)歲。

1.2主要儀器及試劑 人CSF-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R&D system公司),補(bǔ)體C3檢測(cè)試劑盒(寧波瑞源生物科技公司),尿蛋白檢測(cè)試劑(北京利德曼生化股份公司),抗dsDNA抗體檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司),肌酐檢測(cè)試劑盒(愛爾蘭貝克曼庫爾特公司)。Thermo Scientific Multiskan 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),Beckman Coulter AU5800生化分析儀(愛爾蘭貝克曼庫爾特公司)。

1.3方法

1.3.1臨床資料及樣本收集 收集所有患者入院后的臨床資料,包括:年齡、性別、病程、病史等。另收集患者住院期間的臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)數(shù)據(jù)。分別采集LN患者住院第1天和體檢健康者體檢時(shí)晨起空腹(禁食8～12 h)靜脈血各5 mL,2 500×g離心15 min,血清樣本置于-80 ℃保存,檢測(cè)前于室溫解凍。所有研究對(duì)象均留取晨起清潔中段尿5 mL,400×g離心15 min,收集上清液,尿液樣本置于-80 ℃保存,檢測(cè)前于室溫解凍。

1.3.2抗dsDNA檢測(cè) 采用ELISA法,按照抗dsDNA抗體檢測(cè)試劑盒說明書操作檢測(cè)。使用Thermo Scientific Multiskan全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度A值。比較并計(jì)算各組之間的A450 nm值。

1.3.3補(bǔ)體C3檢測(cè) 取3 μL血清,按照補(bǔ)體C3檢測(cè)試劑盒檢測(cè)試劑盒說明書操作,用Thermo Scientific Multiskan全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀讀取吸光度(A340 nm)值。通過多點(diǎn)定標(biāo)曲線折線計(jì)算相應(yīng)補(bǔ)體C3含量(參考區(qū)間:0.7～1.4 g/L)。

1.3.424 h尿蛋白檢測(cè) 取5 μL尿液,按照尿蛋白檢測(cè)試劑說明書檢測(cè),以主波長(zhǎng)600 nm、副波長(zhǎng)700 nm讀取吸光度A值。計(jì)算尿蛋白濃度(參考區(qū)間:0～140 mg/L)。計(jì)算公式:尿蛋白濃度=ΔA樣本×校準(zhǔn)液濃度/ΔA校準(zhǔn)(ΔA=ΔA待測(cè)-ΔA空白)。

1.3.5Cr測(cè)定 采用肌氨酸氧化酶法,取5 μL血清,按照肌酐檢測(cè)試劑盒說明書操作進(jìn)行,在Beckman Coulter AU5800生化分析儀上以主波長(zhǎng)600 nm、副波長(zhǎng)700 nm讀取吸光度A值(參考區(qū)間:49～104 μmol/L)。

1.3.6CSF-1檢測(cè) 采用ELISA法,在包被有抗CSF-1抗體的酶標(biāo)孔中分別加入100 μL稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品和血清或尿液,室溫溫育2 h;洗板3次。在標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣品孔中分別加入200 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人CSF-1抗體,再次室溫溫育30 min后每孔加入50 μL終止液。分別于450 nm和570 nm處讀取吸光度A值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本CSF-1濃度(血清參考區(qū)間:180～474 pg/mL;尿液參考區(qū)間:263～4 466 pg/mL)。

2 結(jié)果

2.1LN患者血清CSF-1和尿液CSF/Cr水平 ELISA法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),LN患者血清CSF-1顯著高于體檢健康者 (98.41±4.12 pg/mL vs 10.10±0.31 pg/mL,t=17.41,P<0.001)。LN患者尿液CSF-1/Cr顯著高于體檢健康者 (2.75±0.13 pg/mg.Cr vs 0.89±0.04 pg/mg.Cr,t=11.20,P<0.001)。

2.2CSF-1與LN患者病理分型的相關(guān)性 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型患者血清CSF-1水平及尿液CSF-1/Cr差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為40.93和23.69,P<0.001)。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較結(jié)果表明,與Ⅱ型LN患者(74.47±2.66) pg/mL相比,Ⅲ型及Ⅳ型LN患者血清CSF-1水平明顯升高 (96.23±2.84 pg/mL,125.2±5.99 pg/mL,q分別為6.194,12.19,P<0.01),并且Ⅳ型LN患者血清CSF-1水平較Ⅲ型顯著升高(q=7.707,P<0.01)。此外,與Ⅱ型LN患者(2.07±0.12 pg/mg.Cr)相比,Ⅲ型及Ⅳ型LN患者尿液CSF-1/Cr明顯升高(2.77±0.06 pg/mg.Cr,3.55±0.26 pg/mg.Cr,q分別為5.185,9.728,P<0.01),并且Ⅳ型LN患者尿液CSF-1/Cr也較Ⅲ型LN患者顯著升高(q=5.416,P<0.01)。

2.3CSF-1與患者治療效果的關(guān)系 共計(jì)5例LN患者完成隨訪,分別檢測(cè)了隨訪第1和第3個(gè)月時(shí)的血清CSF-1和尿液CSF-1/Cr,以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(包括補(bǔ)體C3、抗dsDNA和24 h尿蛋白)。結(jié)果表明,隨著患者病情緩解,LN患者血清CSF-1及尿液中CSF-1/Cr明顯下降,抗dsDNA和24 h尿蛋白亦顯著降低,而補(bǔ)體C3水平明顯增加,見表1。

表1 LN患者CSF-1、CSF-1/Cr及各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

LN是SLE患者最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥。LN若得不到有效控制,會(huì)進(jìn)展至終末期腎衰。LN的特征包括持續(xù)存在的蛋白尿、鏡下血尿和進(jìn)行性腎功能下降等特征[9]。迄今為止,腎臟活檢仍然是LN診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[10-11],但LN的進(jìn)展和療效判斷無法采用腎臟活檢等創(chuàng)傷性技術(shù)。因此,探索非創(chuàng)傷性的LN診斷、進(jìn)展和療效評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究通過比較體檢健康者與LN患者血清CSF-1水平、尿液CSF-1/Cr和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)(抗dsDNA、24 h尿蛋白及補(bǔ)體C3)等,并進(jìn)行動(dòng)態(tài)隨訪,以期為L(zhǎng)N患者提供新的生物學(xué)標(biāo)志物。

CSF-1作為能刺激單核細(xì)胞和巨核細(xì)胞分化的一種生長(zhǎng)因子,可激發(fā)和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞和微生物的殺傷作用,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和其他炎癥調(diào)節(jié)因子,并刺激胞飲作用。研究發(fā)現(xiàn),CSF-1在妊娠期間增加,并支持蛻膜和胎盤的植入和生長(zhǎng)[12-13]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)CSF-1,而且隨著LN進(jìn)展,腎間質(zhì)CSF-1的表達(dá)量增高[5]。以上結(jié)果提示CSF-1參與LN的進(jìn)展過程,可能成為L(zhǎng)N的生物學(xué)標(biāo)志物。Menke等[14]證實(shí)腎小球?yàn)V過率等對(duì)尿液CSF-1的表達(dá)水平存在較大的影響。本研究亦發(fā)現(xiàn)LN患者血清和尿液CSF-1水平均顯著高于體檢健康者,且LN患者尿液CSF-1/Cr亦明顯增加。

目前臨床根據(jù)LN患者的腎臟病理嚴(yán)重程度,將LN患者劃分為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型,筆者進(jìn)一步檢測(cè)并比較了各亞型患者血清CSF-1水平及尿液CSF-1/Cr。結(jié)果表明隨著患者的病情加重,Ⅲ型或Ⅳ型LN患者血清CSF-1水平及尿CSF-1/Cr顯著高于Ⅱ型LN患者(P<0.05),且Ⅳ型亦高于Ⅲ型LN患者(P<0.05),這進(jìn)一步證實(shí)了血清CSF-1水平及尿液CSF-1/Cr可以反映LN患者的腎臟病變嚴(yán)重程度。

筆者還檢測(cè)了5例緩解期隨訪LN患者CSF-1水平和尿液CSF-1/Cr以及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著病情緩解, LN患者抗dsDNA和24 h尿蛋白顯著降低,補(bǔ)體C3明顯增加,患者的CSF-1及尿液CSF-1/Cr也顯著降低,提示上述指標(biāo)可用于判斷LN的活動(dòng)性。