王雪亮,胡曉波(上海市臨床檢驗中心質控品研發(fā)室/分子生物學室,上海 200126)

腫瘤嚴重危害人類健康,是導致人類死亡的主要原因之一[1]。早期診斷并及時治療對于提高腫瘤治療效果和患者生存率至關重要。目前,組織活檢仍是腫瘤檢測的重要方式,但其仍存在諸多局限性,例如有創(chuàng)且易導致并發(fā)癥以及腫瘤組織存在異質性等[2]。液態(tài)活檢可通過檢測體液樣本中的核酸和蛋白質等標志物,從而反映腫瘤分子特征和動態(tài)變化,因其具有無創(chuàng)便捷、可反復取樣和依從性高等優(yōu)點而受到廣泛關注[2]。然而,目前用于液態(tài)活檢的檢測方法普遍具有成本高、耗時長和需要復雜設備等缺點,這限制了其在臨床上的廣泛應用。因此,急需一種低成本、簡單快速且高效準確的腫瘤診斷新方法。

成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相關蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)系統(tǒng)是一種原核生物抵御外源核酸入侵的適應性免疫防御系統(tǒng),其已被廣泛用于基因編輯和核酸檢測中[3-6]。當前CRISPR核酸檢測平臺中Cas9、Cas12、Cas13是最常用的效應蛋白[3-4,6]。與其他Cas蛋白不同,Cas12具有靶標DNA激發(fā)的針對單鏈DNA的非特異性反式切割活性,基于其持續(xù)信號放大和單堿基分辨能力,已被用于高效且特異地檢測多種腫瘤標志物[3,6]。筆者就CRISPR/Cas12系統(tǒng)在腫瘤檢測中的應用進行綜述,以期為CRISPR/Cas系統(tǒng)更好地應用于腫瘤篩查和診斷提供參考及借鑒。

1 CRISPR/Cas12系統(tǒng)簡介

CRISPR/Cas系統(tǒng)依據(jù)Cas蛋白組成及其發(fā)揮作用方式不同分為兩大類:第一類主要特征為效應復合物,由多個Cas蛋白組成;第二類則只有1個大分子量、多結構域的Cas效應蛋白單體,包括Cas9、Cas12和Cas13,因其操作方便且簡潔高效,因而更適用于基因編輯應用[7]。

與Cas9蛋白不同,Cas12(又稱Cpf1)缺乏HNH結構域,但可單獨利用其RuvC結構域實現(xiàn)對靶標DNA的切割(圖1)[8]。Cas12a可在CRISPR RNA(crRNA)引導下識別位于靶標核酸5′端富含胸腺嘧啶(T)的前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM),從而啟動對靶標DNA的切割(順式切割),同時它還可不加選擇地切割反應體系中的非靶標單鏈DNA(反式切割)[3,6]。隨后,V型Cas蛋白的其他亞型也相繼被證實具有反式切割活性,如Cas12b[9-10]、Cas12c[11]、Cas12f(Cas14)[5]等?；诖颂匦?已有多種基于CRISPR/Cas12的性能優(yōu)良的核酸檢測平臺被開發(fā)出,并廣泛用于病原體、腫瘤和轉基因作物等領域[3,5-6,9-11]。

圖1 CRISPR/Cas12a系統(tǒng)靶向識別切割和反式切割示意圖

2 CRISPR/Cas12系統(tǒng)在腫瘤核酸檢測中的應用

2.1循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)檢測 ctDNA含有腫瘤相關遺傳信息,可代替腫瘤組織用于用藥指導、耐藥監(jiān)測和預后評估等,是一種具有良好應用前景的液態(tài)活檢標志物[12]。但ctDNA含量稀少,呈高度碎片化且半衰期極短,這對檢測方法帶來了極大挑戰(zhàn)。當前ctDNA檢測方法操作復雜、價格昂貴,不能有效滿足臨床需求[12]。隨著CRISPR技術快速拓展,可利用Cas13和Cas12開發(fā)操作簡單、成本便宜且靈敏特異的檢測平臺。雖然Cas13a更早被用于ctDNA樣本檢測[4]。但當檢測靶標DNA時,CRISPR/Cas13需增加DNA到RNA的體外轉錄環(huán)節(jié),這造成操作上的不便,因此CRISPR/Cas12更適用于ctDNA檢測。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變檢測對于肺癌患者用藥指導和療效監(jiān)測等具有重要作用。Feng等[12]將CRISPR/Cas12a和滾環(huán)擴增技術相結合開發(fā)了一種新的EGFR19del檢測方法,其檢測靈敏度可低至20 fmol/L,并可通過裸眼觀察判定反應結果。Liu等[13]構建了基于CRISPR/Cas12a和Fe3O4磁性納米復合材料的電化學傳感器,證實其對EGFRL858突變位點檢測具有高度的特異性、穩(wěn)定性和選擇性。該方法檢出限可低至3.3 amol/L,并成功用于臨床樣本檢測。筆者利用重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)引物引入PAM位點解決了Cas12a檢測靶標序列無PAM位點問題,并通過單雙堿基錯配方式提高其檢測的特異性[14]。并進一步證實改良的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)具有極高的靈敏度和選擇性(0.02%),可在50 min內精準鑒定EGFRT790M和L858R突變。此外,BRCA1基因突變與女性乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切關系。Choi等[15]將Cas12a反式切割活性和DNA功能化金納米顆粒結合開發(fā)了一種無擴增策略的生物傳感器,可在30 min內實現(xiàn)BRCA1基因的比色檢測,檢出限可低至0.34 fmol/L。

2.2循環(huán)腫瘤微小RNA(miRNA)檢測 miRNA是一類長度只有20～23個核苷酸的小RNA,在腫瘤組織中異常表達[16]。相對于組織樣本,體液中更易實現(xiàn)miRNA的識別與分離,可作為腫瘤診斷和監(jiān)測的重要途徑。因此,開發(fā)基于CRISPR的快速、廉價、敏感、特異的miRNA檢測方法對于腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早治療具有重要意義。

miR-17和miR-155在多種腫瘤細胞中高表達,如乳腺癌和肺癌等。Jia等[17]將雜交鏈式反應和CRISPR/Cas12a結合構建成1個多功能的miRNA檢測平臺,可用于miR-17和miR-155的檢測,且其檢出限可低至0.29 fmol/L。miR-21在多種腫瘤中高表達,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。Wang等[18]利用滾環(huán)轉錄將miRNA轉變?yōu)?條帶上有多個pre-crRNA重復序列的長單鏈RNA,其可被Cas12a主動招募剪切并激活其反向切割活性,從而釋放熒光信號。該方法具有靈敏度高和通用性強等優(yōu)點,且可實現(xiàn)在真實樣本中用于miR-21檢測。miRNA let-7a是一種腫瘤抑制因子,其表達下調與某些腫瘤相關,如卵巢癌、胃癌等。Wang等[19]將莖環(huán)適配器與let-7末端結合后,利用反轉錄PCR對其進行擴增,擴增產物被Cas12a識別切割后激活Cas12a的反式切割活性,非特異性地切割熒光報告DNA,從而釋放熒光信號。

2.3DNA甲基化檢測 DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾,DNA甲基化異常被發(fā)現(xiàn)與腫瘤等疾病有關[20]。因此,建立靈敏且可靠的甲基化檢測方法對于研究腫瘤發(fā)生機制并建立有效的診療策略具有重要意義。

膠原蛋白α2(I)啟動子區(qū)DNA高度甲基化情況存在于多種腫瘤中。Li等[9]將基于CRISPR/Cas12b開發(fā)的系統(tǒng)用于膠原蛋白α2(I)啟動子區(qū)M3甲基化位點檢測,證實其可對靶標DNA甲基化程度進行快速且準確地定量。SEPT9基因甲基化(mSEPT9)可作為一種診斷宮頸癌的特異性生物學標志物。Xu等[21]將RPA和CRISPR/Cas12a聯(lián)用開發(fā)出一種高靈敏和特異性檢測mSEPT9的新方法,其檢出限約為1 copy/μL,且可從高濃度背景基因組中檢出0.01%的mSEPT9。RASSF1A啟動子區(qū)域高度甲基化可作為乳腺癌診斷和治療的生物學標志物。Zhou等[22]開發(fā)了一種基于內切酶輔助且無PAM依賴的RPA與CRISPR/Cas12a耦合的新型策略。受益于酶切的特異性、Lambda輔助的RPA高效擴增及CRISPR/Cas系統(tǒng)的自我擴增能力,該方法具有極優(yōu)的靈敏度和選擇性,可檢測低至0.05%的RASSF1A甲基化DNA。此外,該方法不僅可通過熒光法進行檢測,還可通過側流層析試紙條滿足即時檢測(point-of-care testing,POCT)需求。

2.4病毒核酸檢測 病毒感染與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相關。持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是導致宮頸癌發(fā)生的主要原因,及時準確地進行早期 HPV 診斷和分型對于宮頸癌的防控具有重要意義。HPV很難用傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及血清學技術檢測,目前主要采用核酸檢測方法?；贑RISPR/Cas12獨特的反式切割能力,Chen等[3]首次將CRISPR/Cas12a和RPA結合開發(fā)出快速靈敏的DETECTR方法,可在1 h內對HPV16和HPV18進行準確基因分型。Teng等[10]證實CRISPR/Cas12b也可用于HPV16和HPV18的檢測與分型,且比CRISPR/Cas12a具有更高的檢測靈敏度。為滿足POCT需求,Tsou等[23]構建了金納米顆粒輔助的CRISPR/Cas12a檢測平臺,可通過裸眼直接觀察HPV16和HPV18核酸檢測結果,不僅方便快捷,且成本低廉。

此外,乙肝病毒感染可導致肝癌,核酸檢測是鑒別其感染、判斷預后和監(jiān)測療效的重要手段。Ding等[24]將CRISPR/Cas12a和環(huán)介導等溫擴增技術聯(lián)用,開發(fā)出用于乙肝病毒感染的快速檢測系統(tǒng),其可通過熒光法在13 min內完成實時高敏檢測,還可利用試紙條在20 min內完成可視化檢測,且檢測靈敏度可達1 copy/μL。同樣,因EB病毒能導致淋巴瘤及鼻咽癌,Yuan等[25]將PCR和CRISPR/Cas12a聯(lián)用,所開發(fā)的側流層析試紙條可方便、快速地完成EB病毒的POCT檢測。

3 CRISPR/Cas12系統(tǒng)在腫瘤蛋白標志物檢測中的應用

3.1常規(guī)腫瘤蛋白標志物檢測 腫瘤蛋白標志物主要是由腫瘤細胞分泌釋放到體液中的抗原、酶和激素等物質,其常在腫瘤患者中呈過量表達。因此,檢測其含量對于腫瘤的早期診斷、病情監(jiān)測和預后判斷等具有重要意義[26]。ELISA法是檢測腫瘤蛋白標志物的最常用方法,但其存在檢測靈敏度低等問題,因此需要開發(fā)更為靈敏的檢測方法。

轉化生長因子β1是肝癌發(fā)生的重要細胞因子,可作為肝癌診斷的特異生物學標志物之一。Dai等[27]首次構建了基于CRISPR/Cas12a的蛋白檢測平臺,該平臺將核酸適配體與靶標蛋白結合后,適配體作為Cas12a的識別底物啟動其反式切割活性。該方法可成功用于轉化生長因子β1檢測,且具有良好的靈敏度和特異性。甲胎蛋白是診斷原發(fā)性肝癌重要的輔助指標之一。Zhao等[28]開發(fā)了1個基于CRISPR/Cas12a的可用于檢測蛋白質分析物的檢測新平臺。該平臺可利用適配體/帶有PAM位點的雙鏈DNA/生物素標記的單鏈DNA復合物用于臨床樣本中甲胎蛋白檢測,其檢出限為0.07 fmol/L。此外,癌胚抗原對于多種腫瘤的早期診斷、療效監(jiān)測和預后判定都具有重要臨床意義。Li等[29]將具有多個識別區(qū)域的環(huán)狀DNA Walker和CRISPR/Cas12a結合,開發(fā)出可用于多種靶標物質檢測的技術平臺,這進一步拓展了CRISPR/Cas12的應用場景。

3.2外泌體中蛋白質標志物檢測 外泌體是表面呈凹半球狀的類囊泡小體,可從血液、尿液及腦脊液等體液中分離得到,其內部包含核酸、蛋白質和脂質等多種物質,可反映母體細胞狀態(tài)[30]。外泌體在腫瘤形成、生長、轉移和耐藥中起關鍵作用,因此可作為腫瘤個體化診療的有效生物學標志物[30]。因外泌體在體液中含量極低,故需要使用高靈敏度檢測方法進行檢測。

CRISPR技術的快速發(fā)展為外泌體檢測提供了新的思路和手段。Li等[31]開發(fā)了基于CRISPR/Cas12a的高靈敏鼻咽癌CD109+外泌體檢測平臺。該方法檢測靈敏度可達100 particles/mL,但其涉及ELISA和PCR等環(huán)節(jié),操作復雜且所需時間較長。因此,直接使用適配體分離純化外泌體可簡化相關操作。如Zhao等[32]利用帶有阻斷器的適配體捕獲CD63+外泌體,兩者結合后適配體構象發(fā)生改變而釋放阻斷器,上清中的游離阻斷器可激活Cas12a的反式切割活性,進而釋放熒光信號,從而實現(xiàn)靶標外泌體的檢測。該法無需預擴增,可有效簡化操作,縮短反應時長。此外,CRISPR/Cas12還可用于外泌體相關物質檢測,如蛋白質等。Xing等[33]使用抗體包被磁珠捕獲外泌體,與適配體結合后經擴增產生可被Cas12a識別切割的長重復片段,然后非特異性切割體系中的熒光探針釋放熒光信號。該平臺可成功用于臨床樣本中外泌體表面蛋白nucleolin和程序性死亡配體1的定量檢測。

4 總結與展望

作為新一代可拓展性檢測技術,CRISPR/Cas系統(tǒng)開創(chuàng)了核酸檢測新時代。本文對CRISPR/Cas12的結構及作用機制進行了簡介,并對基于CRISPR/Cas12所開發(fā)的多種腫瘤標志物檢測平臺進行了詳細闡述。該系統(tǒng)表現(xiàn)出靈敏度高、特異性好、操作簡單和成本低廉等優(yōu)勢,并可實現(xiàn)快速POCT的目的,這突破了傳統(tǒng)腫瘤檢測技術的局限性,在腫瘤檢測領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力和前景。

但目前基于CRISPR/Cas12的腫瘤標志物檢測技術仍面臨不少挑戰(zhàn):(1)大多數(shù)方法需與核酸擴增技術(如RPA)相結合以提高檢測靈敏度。但該過程仍需分步進行,這極大增加了檢測時間和工作量。雖已有研究開發(fā)了無擴增核酸檢測平臺,但仍存在檢出限較低問題。應進一步探索可整合等溫擴增及信號輸出的一體化設備以改進其臨床應用。(2)PAM序列限制。絕大多數(shù)Cas12識別靶標序列高度依賴PAM序列,這限制了其檢測的通用性。除通過擴增引物引入PAM序列外,今后還需尋找更多非嚴格依賴PAM位點的Cas蛋白,以增加其檢測的靈活性。(3)脫靶效應。即由于crRNA與非靶標序列結合而發(fā)生脫靶切割,從而導致出現(xiàn)假陽性結果?？赏ㄟ^crRNA的精心設計以提高靶向切割效應,從而保證檢測結果的準確性。(4)高通量檢測。大多數(shù)基于CRISPR/Cas12的檢測平臺只能實現(xiàn)對單一腫瘤標志物的定性檢測。因腫瘤與多種生物學標志物濃度變化情況緊密相關,故需進一步開發(fā)可完成高通量快速檢測與定量檢測的通用平臺。綜上所述,通過對基于CRISPR/Cas12的腫瘤標志物檢測平臺的不斷優(yōu)化完善,特別是隨著材料學及交叉學科的迅速發(fā)展,CRISPR/Cas12系統(tǒng)在腫瘤檢測領域將會展現(xiàn)出良好的應用前景和開發(fā)價值,有望在腫瘤早期診斷、療效監(jiān)測、用藥指導和預后判斷等方面發(fā)揮重要作用。