謝榮榮 史婷婷 信 中 曹 曦 楊金奎,*

(1. 北京市糖尿病研究所/北京市糖尿病防治辦公室,北京 100730; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 102600)

Graves眼病(Graves’ ophthalmopathy, GO)是一種器官特異性自身免疫疾病,發(fā)病率居成年人眼眶病的首位。其病理生理機(jī)制是眼眶組織糖胺聚糖的堆積導(dǎo)致球后結(jié)締組織增生及眼外肌水腫,從而引起眼球突出、復(fù)視、斜視及視神經(jīng)受壓等臨床表現(xiàn)[1-2]。根據(jù)疾病活動性可將GO分為活動期及非活動期。在活動期,病理表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞的活化; 非活動期,病理表現(xiàn)為眼外肌纖維化[3]。根據(jù)疾病的活動性,臨床醫(yī)生采取不同的治療措施。目前臨床上活動性評價(jià)受到患者自身和醫(yī)師工作經(jīng)驗(yàn)等主觀性因素的影響,因此尋找合適的客觀性生物標(biāo)志物評價(jià)GO的活動性尤為重要。

細(xì)胞因子是機(jī)體免疫應(yīng)答過程中細(xì)胞分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的異質(zhì)性調(diào)節(jié)因子[4]。目前,細(xì)胞因子分為五類:干擾素群系(interferons, IFNs)、白細(xì)胞介素群系(interleukins, ILs)、克隆刺激因子群系(colony-stimulating factors,CSFs)、轉(zhuǎn)化因子群系(transforming growth factors, TGFs)和腫瘤壞死因子群系(tumor necrosis factors, TNFs)[5-6]。研究[4]表明,細(xì)胞因子在GO的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究通過檢測活動期及非活動期GO患者血漿中的12項(xiàng)細(xì)胞因子[包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12P70、IFN-α、IFN-γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α]濃度,分析這些因子與疾病活動度等指標(biāo)的相關(guān)性,為GO的治療提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2021年1月至2023年1月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科門診就診的GO患者27例。GO患者入組標(biāo)準(zhǔn):①結(jié)合臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查,所有患者均按照Bartley標(biāo)準(zhǔn)診斷明確;②所有患者均應(yīng)用甲巰咪唑片(德國默克公司,國藥準(zhǔn)字J20171078,規(guī)格10 mg/片)治療;③所有患者均未接受過眼部疾病治療,包括糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、放射治療及手術(shù)治療;④18歲≤年齡<70歲;⑤神志清楚,配合隨訪。GO排除標(biāo)準(zhǔn):①甲狀腺功能異常者;②既往對抗甲狀腺藥物過敏,有放射性碘或甲狀腺手術(shù)治療史;③1個(gè)月前抗生素及免疫抑制劑或激素類藥物使用史;④合并其他自身免疫性疾病;⑤妊娠期或哺乳期女性;⑥合并其他嚴(yán)重原發(fā)性疾病,包括糖尿病、高血壓、高血脂等;合并惡性腫瘤以及酒精及其他藥物依賴史,伴有精神障礙及認(rèn)知障礙。根據(jù)臨床活動性評分(Clinical Activity Score,CAS)及美國甲狀腺學(xué)會頒布的分級標(biāo)準(zhǔn)(0: no signs or symptoms;1:only signs, no symptoms;2:soft tissue involvement;3:proptosis;4:expraocular muscle involvement;5:cornea involvement;6:sightloss, NOSPECS)對患者進(jìn)行疾病活動期分期,將其中CAS≥3分的14例患者為活動期組(病例組),CAS<3分的13例患者為非活動期組(對照組)。研究方案符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),并得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號TRECKY2016-003);所有納入本研究的患者均簽署了知情同意書。

1.2 資料收集

內(nèi)容包括性別、年齡、吸煙史、肝腎功能、甲狀腺功能檢查、甲狀腺自身抗體及患者用藥史。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測

1.3.1 血清甲狀腺激素測定

血清甲狀腺激素[游離三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine,FT4)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、四碘甲腺原氨酸(tetraiodothyronine,T4)]和促甲狀腺激素 (thyroid stimulating hormone,TSH)的檢測在 ADVIA Centaur XP Immunoassay系統(tǒng)平臺中進(jìn)行(西門子公司,德國)。促甲狀腺素受體抗體(thyrotropin receptor antibody,TRAb)滴度的測定采用電化學(xué)發(fā)光法(Roche公司, 德國)。參考范圍(FT3:3.50～6.50 pmol/L,FT4:11.50～22.70 pmol/L,T3: 0.92～2.97 nmol/L,T4:57.9～140.3 nmol/L,TSH:0.55～4.78 μIU/mL,TRAb: 0.00～1.75 IU/L)。

1.3.2 血漿細(xì)胞因子的測定

應(yīng)用乙二胺四乙酸二鉀(ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium salt, EDTA-K2)抗凝采血管采集兩組患者的清晨空腹靜脈血標(biāo)本。1 000g離心10 min, 取分離出的血漿進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。全血充分混勻后在全自動血液分析儀上機(jī),采用細(xì)胞因子檢測試劑盒(CytoFLEX:貝克曼庫爾特公司,美國)、多重微球流式免疫熒光發(fā)光法檢測12種血漿細(xì)胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12P70、IFN-α、IFN-γ、TNF-α)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本臨床特征比較

本研究對14例活動期及13例非活動期GO患者的臨床資料進(jìn)行了對比分析,結(jié)果顯示,兩組患者在年齡、性別、腎功能(尿素氮及肌酐)、肝功能(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶及門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)及甲狀腺功能水平方面,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；顒悠贕O組患者的TRAb濃度明顯高于非活動期組患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 活動期及非活動期GO患者的一般臨床特征比較Tab.1 Baseline characteristics of patients with inactive and active GO

2.2 活動期與非活動期GO患者9種血漿白細(xì)胞介素濃度比較

兩組患者血漿9種白細(xì)胞介素濃度比較結(jié)果顯示,與非活動期相比,活動期患者的血漿IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17濃度明顯升高,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余3種白細(xì)胞介素(IL-2、IL-6及IL-12P70)濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 活動期與非活動期GO患者血漿白細(xì)胞介素濃度Fig.1 Levels of interleukins in active and inactive GO patients

2.3 活動期與非活動期GO患者3種細(xì)胞因子濃度比較

兩組患者的血漿IFN-α、IFN-γ及TNF-α比較結(jié)果顯示,與非活動期相比,活動期患者的TNF-α及IFN-γ濃度顯著升高,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而兩組患者血漿 IFN-α濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 活動期與非活動期GO患者血漿TNF-α、IFN-α、IFN-γ濃度Fig.2 Levels of TNF-α, IFN-α and IFN-γ in active and inactive GO patients

2.4 血漿細(xì)胞因子與GO患者CAS評分的相關(guān)性分析

血漿細(xì)胞因子與CAS評分相關(guān)性分析結(jié)果表明,IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α與CAS評分呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.05)(表2)。

表2 血漿細(xì)胞因子與GO患者CAS評分的相關(guān)性Tab.2 Correlation between cytokines and CAS scores in patients with GO

2.5 活動期的單因素Logistic回歸分析

考慮到樣本量較小,對活動期與非活動期組間顯著的指標(biāo),包括TRAb、IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10和IL-17進(jìn)行單因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高會增加活動期風(fēng)險(xiǎn)(表3)。

表3 活動期的單因素Logistic回歸分析Tab.3 Single factor Logistic regression analysis

3 討論

GO是一種可威脅視力的自身免疫性疾病,臨床表現(xiàn)為眼球突出、復(fù)視或斜視,嚴(yán)重者可能會有視神經(jīng)受壓及角膜潰瘍,甚至導(dǎo)致失明。在臨床工作中,內(nèi)分泌醫(yī)師根據(jù)疾病的活動性,采取不同的治療措施:如GO處于活動期階段,患者可能接受糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等治療抑制免疫反應(yīng);在疾病非活動期,醫(yī)生將更多選擇矯正手術(shù)等改善患者的斜視及復(fù)視。目前臨床上活動性評價(jià)受到患者自身和醫(yī)師工作經(jīng)驗(yàn)等主觀性因素的影響,因此尋找合適的客觀性生物標(biāo)志物來評價(jià)GO的活動性尤為重要。細(xì)胞因子在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)及宿主防御等機(jī)制中扮演重要角色,例如IL-6廣泛表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中[7-8],IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及IL-17主要由淋巴細(xì)胞分泌[9-10],IL-1β、IL-8及IL-12主要由單核/巨噬細(xì)胞分泌[11],IFN-α及IFN-γ作為IFN家族成員代表由淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等分泌[12-13]。是否能夠找到與GO活動度密切相關(guān)的細(xì)胞因子是本文研究目的。在本文研究中,納入了初始治療的活動期及非活動期GO患者,這兩組患者在甲狀腺功能上無明顯差異。本研究結(jié)果顯示,活動期GO患者的IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17濃度明顯高于非活動期組,TNF-α及IFN-γ濃度明顯升高,兩組濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,預(yù)示這8種細(xì)胞因子可能是GO相關(guān)細(xì)胞因子。進(jìn)一步單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高會增加活動期風(fēng)險(xiǎn), 提示該四種因子有可能作為評判GO活動性的指標(biāo)。

在GO患者中白細(xì)胞介素的濃度變化方面,Kishazi等[14]發(fā)現(xiàn)GO患者中IL-10、IL-12P70、IL-13、IL-6和TNF-α濃度明顯高于健康受試者, 而活動期GO患者中的IL-13、IL-6和TNF-α濃度顯著升高;Song等[15]發(fā)現(xiàn),GO患者淚液中IL-12P70、IL-1β、IL-2、IL-21及IL-6等13種蛋白濃度顯著升高,而白介素1可溶性受體Ⅰ及IL-13等蛋白濃度下調(diào)。本文研究發(fā)現(xiàn),在上調(diào)的細(xì)胞因子中,IL-17濃度在活動期及非活動組中差異最為明顯,并且與臨床活動度評分具有正相關(guān)性。IL-17因子是由分化決定族抗原4(cluster of differentiation 4,CD4) T細(xì)胞亞群中輔助性T 細(xì)胞17(T helper cell 17, Th17)細(xì)胞分泌,目前已經(jīng)證明可能在自體免疫疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著著重要角色[16]。IL-17作為促炎癥因子可誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和增加集落刺激因子[17]。研究[18-19]表明,血清中IL-17濃度在自身免疫性疾病(包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)中高表達(dá),而且血清中IL-17滴度與病情嚴(yán)重程度具有正相關(guān)性。研究[20-21]表明,活動期GO患者進(jìn)行糖皮質(zhì)激素治療伴隨IL-17濃度的顯著下降,這提示IL-17在GO發(fā)病及轉(zhuǎn)歸中的重要作用,可作為評價(jià)GO病情活動度的指標(biāo)之一。

綜上所述,活動期GO患者血漿中IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17濃度明顯高于非活動期組, 其中IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高會增加活動期風(fēng)險(xiǎn)。但在本項(xiàng)研究中,課題組未對GO患者治療前后的細(xì)胞因子濃度進(jìn)行研究,無法明確治療過程中臨床活動度的變化與細(xì)胞因子的關(guān)聯(lián)性。并且此研究樣本量小,缺乏長期隨訪跟蹤研究,未能排除藥物對細(xì)胞因子的影響,在后續(xù)的研究中需要擴(kuò)大樣本量,對GO患者治療前后的細(xì)胞因子進(jìn)行分析,并設(shè)置治療后不同療效組,分析不同治療方案的治療效果與細(xì)胞因子的相關(guān)性,進(jìn)一步探討細(xì)胞因子與GO的關(guān)系。鑒于此,分析不同的細(xì)胞因子在GO患者中的表達(dá)情況及其對GO的影響可為GO的臨床治療提供新的思路及免疫治療新的靶點(diǎn),以便尋找新的安全有效的治療方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明謝榮榮:提出研究思路,設(shè)計(jì)研究方案,數(shù)據(jù)分析,撰寫論文;史婷婷,信中: 采集數(shù)據(jù);曹曦:分析數(shù)據(jù);楊金奎:審定論文,總體把關(guān)。