鄧博雅，路亞嵐，羽 思，張旖垚，黃婧怡，李 玥*，劉長征*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所國家衛(wèi)生健康委員會人類比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100730

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種局限于結(jié)腸黏膜及黏膜下層的炎性反應(yīng)過程,典型臨床表現(xiàn)為便血、腹瀉和腹痛,癥狀嚴(yán)重時可危及生命[1]。目前治療UC的藥物繁多,但仍有近1/3的患者病情難以控制,給個人和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。鑒于目前治療的局限性,對其發(fā)病機(jī)制和新興治療靶點(diǎn)的探索具有重要意義。NF-κB信號通路是對環(huán)境應(yīng)激、遺傳毒性或感染反應(yīng)的核心[3],很多促炎細(xì)胞因子受其調(diào)節(jié)參與炎性反應(yīng)性腸病的發(fā)生,因此抑制NF-κB可能是治療UC的新策略。

RNF138是一種E3泛素連接酶(E3 ubiquitinase,Ub-E3),其表達(dá)下調(diào)會使NF-κB信號異常轉(zhuǎn)導(dǎo),將結(jié)腸炎轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性惡性腫瘤[4]。而RNF138在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用尚不清楚,因此探究RNF138在潰瘍性結(jié)腸炎的作用至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試者:2014年1月至2019年12月間于北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科住院并臨床診斷為潰瘍性結(jié)腸炎的患者共17例。招募18歲以上的健康志愿者4例作為對照組。UC組入選標(biāo)準(zhǔn):1)年齡>18周歲;2)確認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎;對照組入選標(biāo)準(zhǔn):1)年齡>18周歲;2)確認(rèn)為非潰瘍性結(jié)腸炎等炎性腸病。該研究獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)(倫理審查編號:S-K2092),患者及家屬均同意并簽署知情同意書。

1.1.2 小鼠:C57BL/6J背景 RNF138-KO及RNF138-WT小鼠,8周齡,體質(zhì)量20±5 g(上海南方模式生物科技股份有限公司),本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)學(xué)院倫理審查委員會批準(zhǔn)(倫理審查編號SB2023052)。

1.1.3 主要試劑:葡聚糖硫酸鈣(destran sulfate sodium,DSS)(MP Biomedicals公司);Anti-RNF138 抗體(實(shí)驗(yàn)室自制);Rabbit p-p65 抗體(Cell Signaling公司);BCA蛋白定量分析試劑盒(Pierce公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transgen公司);引物 (北京擎科生物科技有限公司合成, 表1)。

表1 實(shí)時熒光定量 PCR(qPCR)引物序列Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR) primer sequence

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析:GEO數(shù)據(jù)庫(https://ww.ncbinlm.nih.gov/geo/)分析RNF138基因在潰瘍性結(jié)腸炎活動期、緩解期以及經(jīng)免疫抑制劑治療后的表達(dá)水平; STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)對感興趣的聚類和基因進(jìn)行了蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析。

1.2.2 臨床潰瘍性結(jié)腸炎診斷標(biāo)準(zhǔn):1)具有便血、腹瀉和腹痛等典型臨床表現(xiàn);2)癥狀不明顯時,有內(nèi)鏡活檢證實(shí);3)排除克羅恩病、放射性腸炎等結(jié)腸炎癥。

1.2.3 制備人結(jié)腸樣本切片:收集潰瘍性結(jié)腸炎組(17例)和健康對照組(4例),活檢結(jié)腸組織,通過固定、包埋等獲得石蠟切片。

1.2.4 制備潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型:選取狀態(tài)接近的RNF138-WT及RNF138-KO小鼠做好標(biāo)記;使用高壓滅菌過的自來水配置DSS,給藥1周(雄鼠使用2% DSS,雌鼠使用2.5% DSS)后用正常水恢復(fù)14 d。整個循環(huán)重復(fù)兩次,最后一個DSS周期結(jié)束后4周處死小鼠。取結(jié)腸和脾臟,將結(jié)腸縱向切開,用PBS沖洗干凈并測量其長度。取末端結(jié)直腸組織用于蛋白質(zhì)、RNA以及病理的檢測。

1.2.5 動物模型指標(biāo)的評分標(biāo)準(zhǔn):整個實(shí)驗(yàn)過程中注意觀察記錄小鼠的體質(zhì)量、便血情況、糞便性狀、精神狀態(tài)以及生存死亡情況等,臨床評分為類便性狀評分與便血評分總和。

1.2.6 HE組織學(xué)檢測:人及小鼠石蠟組織切片脫蠟,水化,切片煮沸10 min,然后用3% H2O2在室溫下煮沸10 min,以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。血清封閉40 min,用阻斷液稀釋的特異性一抗在4 ℃下孵育過夜。二抗室溫孵育30 min,DAB孵育5 min,加入顯色劑,用蘇木精復(fù)染,脫水,封片。

1.2.7 Western blot 檢測小鼠結(jié)腸組織中RNF138及p-p65蛋白的表達(dá):使用電動研磨器在RIPA裂解液將小鼠結(jié)腸組織研磨為糊狀,隨后12 000 r/min離心10 min,吸取上清使用BCA定量試劑盒進(jìn)行定量,隨后100 ℃變性10 min,將樣品加入制備好的SDS-PAGE凝膠中,使用相應(yīng)一抗,二抗孵育,最后滴加顯影液顯影。

1.2.8 RT-qPCR 檢測小鼠結(jié)腸組織中的 NF-кB靶基因mRNA 表達(dá)水平:將小鼠結(jié)腸組織研磨,加入1 mL Trizol,200 μL氯仿振蕩15 s,靜置10 min,隨后12 000 r/min離心10 min,取上清加入等體積的異丙醇萃取,離心12 000 r/min離心15 min,向沉淀中加入1 mL的75%冰乙醇,洗滌兩遍,晾干沉淀,加入DEPC水對RNA進(jìn)行定量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒70 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,隨后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板在熒光定量PCR儀中檢測進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸組織中RNF138表達(dá)水平下調(diào)

選擇GEO數(shù)據(jù)庫中GDS3119, GDS218738, GDS3268, GDS2181與GDS4365等5個數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析,與正常對照組相比,RNF138在UC患者組織中表達(dá)下調(diào),在活動期表達(dá)下調(diào)更為顯著(圖1A,B)。而經(jīng)過免疫抑制劑治療后RNF138水平有所上升,但依然低于正常對照(圖1C)。臨床21例樣本(17例潰瘍性結(jié)腸炎患者,4例健康對照)的免疫組化結(jié)果顯示,患者結(jié)腸組織中RNF138表達(dá)水平在緩解期略高于活動期,但仍然低于健康對照(圖1D)。

A-C.RNF138 expression level in GEO database (GDS3119/218738,GDS3268/2181,GDS4365/218738), *P<0.05,**P<0.001 compared with normal group, #P<0.05, ##P<0.01 compared with UC-no inflammation group, ΔP<0.001 compared with UC-remission group; D.HE and RNF138 staining in patients’ colon tissue.圖1 潰瘍性結(jié)腸炎中RNF138表達(dá)下調(diào)Fig 1 Down-regulation of RNF138 expression in ulcerative colitis

2.2 動物模型的構(gòu)建

DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型顯示,相同條件下RNF138-KO比RNF138-WT小鼠的臨床評分更高(圖2A),體質(zhì)量下降更為顯著(圖2B),以及死亡率更高(圖2C)。與對照組相比,RNF138-KO小鼠的結(jié)腸長度顯著縮短,并表現(xiàn)出脾腫大(圖2D,E)。在RNF138-KO小鼠中,IHC顯示整個黏膜出現(xiàn)廣泛炎性反應(yīng),淋巴細(xì)胞浸潤增強(qiáng),與上皮結(jié)構(gòu)改變和隱窩丟失同時發(fā)生(圖2F)。而在對照組小鼠中只發(fā)現(xiàn)了炎性病變。

A.clinical scores of RNF138-WT(n=6) and RNF138-KO mice (n=5) on the 9th day after DSS administration;B.body weight changes during chronic colitis with DSS treatment (RNF138-WT, n=10; RNF138-KO, n=7);C.Kaplan-Meier survival analysis of RNF138-WT (n=11) and RNF138-KO (n=20) mice during the course of DSS treatment;D.representative gross morphology and in mock and chronic colitis model mice;E.macroscopic appearance of colons of RNF138-WT and RNF138-KO mice (n=5) cohorts at the end of DSS treatment;F.representative HE images (left) and histological analysis (right) of colon tissues from RNF138-WT and RNF138-KO mice (n=7) after DSS administration; scale bar=500 μm;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with RNF138-WT group.圖2 DSS誘導(dǎo)RNF138-WT和RNF138-KO小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型Fig 2 DSS-induced ulcerative colitis model in RNF138-WT and RNF138-/- mice

2.3 RNF138與NF-κB相關(guān)性分析

利用生物信息學(xué)對RNF138-WT和RNF138-KO UC模型小鼠腸組織進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,發(fā)現(xiàn)兩組在轉(zhuǎn)錄組水平上存在顯著差異(圖3A)。GO富集分析顯示差異基因與腸上皮細(xì)胞分化、增殖、凋亡和細(xì)胞衰老有關(guān)(圖3B)。差異基因的GO的信號通路分析顯示上述功能變化靶向NF-κB信號通路(圖3C)。蛋白質(zhì)相互作用分析顯示了NF-κB信號與不同功能元件相互連接的核心作用(圖3D)。

A.heatmap depiction of differentially expressed genes in RNF138-WT and RNF138-KO colorectal cells;B.enrichment of gene ontology (GO) database of cell growth, apoptosis, cell cycle, differentiation and senescence;C.the top 10 significant signaling pathways in GO database;D.protein-protein interaction analysis of significant GO database in colitis.圖3 RNF138-WT 和RNF138-KO UC組織的GO數(shù)據(jù)庫分析Fig 3 GO database analysis of RNF138-WT and RNF138-KO UC-tissues

2.4 潰瘍性結(jié)腸炎中敲除RNF138后p-p65表達(dá)上調(diào)

p-p65是NF-κB通路重要成員,模型小鼠結(jié)腸組織顯示其在RNF138缺失后表達(dá)顯著上調(diào)(圖4 A),其下游基因CXCL1,PTGS2,ICAM-1和NF-кB1表達(dá)增加(圖4 B),臨床樣本中潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸組織中RNF138表達(dá)下降而p-p65表達(dá)染色增強(qiáng)(圖4C)。

A.p-p65 protein expression levels in the colon tissue of RNF138-KO and RNF138-WT;B.target gene of NF-κB mRNA expression in the colon tissue of RNF138-KO and RNF138-WT, *P<0.05; C.representative HE images in patient’s colon tissue.圖4 潰瘍性結(jié)腸炎中敲除RNF138后p-p65表達(dá)上調(diào)Fig 4 Upregulation of p-p65 expression after knockout of RNF138 in ulcerative colitis

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)GEO數(shù)據(jù)庫和臨床樣本中的潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)RNF138表達(dá)下調(diào),并在活動期表達(dá)下調(diào)顯著。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及遺傳和環(huán)境因素,主要表現(xiàn)為免疫反應(yīng)失調(diào)和上皮屏障缺陷,其中細(xì)胞因子對于疾病的發(fā)展和患者臨床特征起著重要作用。目前多項(xiàng)研究證實(shí)RNF138在不同生理和病理環(huán)境中具有表達(dá)差異,并發(fā)現(xiàn)其與腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性疾病和慢性炎性反應(yīng)有關(guān),越來越多的證據(jù)表明RNF138具有復(fù)雜的功能[5-6],因此RNF138在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用更值得關(guān)注。本文還在DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)RNF138敲除后小鼠死亡率增加,體質(zhì)量變化增加,結(jié)腸變短脾臟腫大。病理組織顯示RNF138敲除后炎性反應(yīng)加重,這些發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果相吻合。通過對小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行整體水平的轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎靶向NF-κB通路。

NF-κB家族由是由含Rel樣結(jié)構(gòu)域的5個相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子組成:p50、p52、p65、c-Rel和RelB。p65也被稱為RelA[7], NF-κB信號具有經(jīng)典途徑和替代途徑這兩種激活方式,在替代途徑中,IкB蛋白首先被IKKβ磷酸化,然后通過指定的E2或E3泛素連接酶泛素化,最終將NF-κB釋放到細(xì)胞核中,開啟靶基因的轉(zhuǎn)錄,因此當(dāng)泛素酶表達(dá)異常時,NF-κB通路將受到異常調(diào)控影響靶基因的轉(zhuǎn)錄[8]。本文證明RNF138下調(diào)會導(dǎo)致p65磷酸化,RNA水平顯示其下游基因NF-κB1, IκBα,CXCL1和ICAM-1表達(dá)的增加,總體上突出了NF-κB信號通路的增強(qiáng)激活。因此本研究發(fā)現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎中RNF138表達(dá)下調(diào),并且負(fù)向調(diào)控NF-κB信號通路,為潰瘍性結(jié)腸炎研究提供新思路。