張雪麗，楊長(zhǎng)福，李瑋，楊菁，劉杰英，楊濤，林昶，2*（. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 林下中藥材研究中心，貴陽(yáng) 550025）

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖[1]，主要化學(xué)成分為生物堿類、有機(jī)酸類、多糖、黃酮類、揮發(fā)油、半夏蛋白、氨基酸以及微量元素等[2-3]，具有鎮(zhèn)咳祛痰、鎮(zhèn)吐、抗早孕、抗?jié)儭⒖鼓[瘤、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[4-5]。此外，半夏還具有抗氧化活性，研究發(fā)現(xiàn)其與心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化[6]、腫瘤及炎癥[7]等的發(fā)生密切相關(guān)。在半夏抗氧化能力研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)以 DPPH 和羥基自由基（·OH）為抗氧化指標(biāo)，半夏多糖均有清除效果，且對(duì)DPPH的清除能力大于·OH[8]；半夏生物堿同樣具有抗氧化能力[9]，分別以DPPH自由基、超氧陰離子自由基（O2－·）、·OH進(jìn)行研究，其清除率呈減小趨勢(shì)，對(duì)DPPH自由基的清除能力最大。此外半夏中β-谷甾醇、半夏水提液[10]、醇提液[11]同樣具有抗氧化能力，但半夏水提液及醇提液中抗氧化活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)及半夏中其他成分是否具有抗氧化活性，目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本文通過灰色關(guān)聯(lián)度及偏最小二乘回歸分析研究半夏HPLC指紋圖譜與抗氧化活性的譜效關(guān)系，初步篩選出與抗氧化活性相關(guān)的色譜峰，可為進(jìn)一步揭示半夏水提液抗氧化活性成分提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000高效液相色譜儀、1530型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]，LCLX-L408型臺(tái)式低速離心機(jī)（上海力辰邦西儀器科技有限公司），AUW220D型分析天平（蘇州島津儀器有限公司），SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（上海亞榮生化儀器廠），YQ-1000A超聲波清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司），WP-UP-WF-20微量分析型超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品鳥苷（純度：93.6%，批號(hào)：111977-201501）、腺苷（純度：99.7%，批號(hào)：110879-201703）、尿苷（純度：99.5%，批號(hào)：110887-201803）、腺嘌呤（純度：99.4%，批號(hào)：110886-201102）、尿嘧啶（純度：99.6%，批號(hào)：100469-201302）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；對(duì)照品β-胸苷（純度：98.0%，批號(hào)：C100897-211107，貴州迪大科技有限責(zé)任公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，批號(hào)：C13383711）、硝基四氮唑藍(lán)（NBT，批號(hào)：C13692681）（上海麥克林生化科技有限公司）；吩嗪硫酸甲酯（PMS，批號(hào)：H2131077）、還原性輔酶Ⅰ二鈉鹽（β-NADH，批號(hào)：L2115726）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ，批號(hào)：T819085）、2，2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS，批號(hào)A109612）（美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司）；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

市售的不同批次半夏藥材均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，詳見表1。

表1 半夏樣品產(chǎn)地信息Tab 1 Origin information for Pinelliae Rhizoma sample

2 方法與結(jié)果

2.1 半夏HPLC指紋圖譜研究

2.1.1 供試品溶液的制備 取半夏粉末（過四號(hào)篩）2.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入20 mL蒸餾水，稱重，超聲60 min（500 W，50 Hz），冷卻后，補(bǔ)重，4000 r·min－1離心5 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即可。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、β-胸苷、腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，以蒸餾水溶解后定容至10 mL，再分別取1 mL以蒸餾水定容至10 mL，配制成含有19.4 μg·mL－1尿嘧啶、12.2 μg·mL－1尿苷、11.1 μg·mL－1腺嘌呤、12.1 μg·mL－1鳥苷、10.7 μg·mL－1β-胸苷、11.6 μg·mL－1腺苷的混合對(duì)照品溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，備用。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate AQC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，1%A，10～25 min，1%～2%A，25～45 min，2%～15%A，45～50 min，15%～20%A，50～60 min，20%～10%A）；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；流速0.8 mL·min－1；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，將5號(hào)尿苷色譜峰定為參照峰（S）。計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD值均＜3%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次半夏粉末（S12）2.0 g，精密稱定，按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均＜3%，表明該法重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取半夏供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均＜3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

分別取30批次的半夏粉末2.0 g，精密稱定，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012版）[12]，以S5樣品色譜圖為參照指紋圖譜，確定了15個(gè)共有峰，建立半夏HPLC共有模式生成對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見圖1、2。30批半夏指紋圖譜相似度在0.749～0.989，其中除S24、S25兩個(gè)產(chǎn)地外，其他產(chǎn)地相似度均大于0.850，相似度結(jié)果見表2。通過混合對(duì)照品溶液HPLC色譜峰對(duì)比，指認(rèn)了其中6個(gè)成分，分別是3號(hào)峰尿嘧啶、5號(hào)峰尿苷、6號(hào)峰腺嘌呤、7號(hào)峰鳥苷、9號(hào)峰β-胸苷、11號(hào)峰腺苷，見圖3。

圖1 半夏的對(duì)照指紋圖譜（R）及指紋圖譜Fig 1 Control fingerprint（R）and fingerprint of Pinelliae Rhizoma

圖2 半夏HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 Control fingerprint of Pinelliae Rhizoma

圖3 混合對(duì)照品HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of mixed reference substance

表2 30批半夏指紋圖譜相似度分析結(jié)果Tab 2 Fingerprint similarity of 30 batches of Pinelliae Rhizoma

2.4 體外抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 ABTS自由基清除率 參考文獻(xiàn)方法[13]，并稍作修改，制備ABTS儲(chǔ)備液，臨用時(shí)以蒸餾水稀釋，即得ABTS工作液。另取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液31.3、62.5、125、250、500、1000 μL于2 mL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，即得不同濃度半夏水提液，分別設(shè)置空白組（蒸餾水20 μL＋ABTS工作液180 μL，測(cè)定吸光度記為A0），樣品組（半夏水提液20 μL＋ABTS工作液180 μL，測(cè)定吸光度記為A1），對(duì)照組（半夏水提液20 μL＋蒸餾水180 μL，置于96孔板中混勻，避光室溫下靜置5 min，酶標(biāo)儀中振蕩1 min，測(cè)定吸光度記為A2），重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。按公式（1）計(jì)算不同濃度樣品液清除率，導(dǎo)入SPSS 26.0計(jì)算不同產(chǎn)地樣品IC50值（以生藥濃度計(jì)算），結(jié)果見表3。

表3 30批半夏體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果Tab 3 In vitro antioxidant activity of 30 batches of Pinelliae Rhizoma

2.4.2 O2－·清除率 參考文獻(xiàn)方法[14-15]，以16 mmol·L－1的Tris-HCl緩沖液分別配制150 μmol·L－1NBT、234 μmol·L－1NADH和30 μmol·L－1PMS溶液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。另取?.4.1”項(xiàng)下稀釋的不同濃度的半夏水提液，分別設(shè)置空白組（蒸餾水10 μL＋100 μL NBT溶液＋100 μL NADH溶液＋100 μL PMS溶液，測(cè)定吸光度記為A0），樣品組（半夏水提液代替空白組中蒸餾水，測(cè)定吸光度記為A1），對(duì)照組（半夏水提液10 μL＋300 μL Tris-HCl緩沖液，于96孔板中混勻，室溫下反應(yīng)5 min，測(cè)定吸光度記為A2），重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。按公式（1）計(jì)算清除率，導(dǎo)入SPSS 26.0計(jì)算不同產(chǎn)地樣品IC50值（以生藥濃度計(jì)算），結(jié)果見表3。

2.4.3 總抗氧化能力（FRAP）法 參考文獻(xiàn)方法[16]，制備FRAP工作液。分別設(shè)置空白組（蒸餾水20 μL＋FRAP工作液180 μL，測(cè)定吸光度記為A0），樣品組[半夏水提液代替空白組中蒸餾水，于96孔板中混勻，酶標(biāo)儀（37℃）下靜置10 min，測(cè)定吸光度記為A1]。另參考文獻(xiàn)方法[17]，配制濃度分別為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80以及1.00 mmol·L－1的FeSO4溶液，同上測(cè)定A值，以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)，（A1－A0）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別計(jì)算半夏水提液總抗氧化能力（FeSO4值）。重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果見表3。

2.5 譜效關(guān)系研究

2.5.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 由灰色系統(tǒng)理論，分別以“2.4”項(xiàng)下3種方法測(cè)得半夏抗氧化活性為參考序列，30批供試品半夏藥材的共有峰峰面積為比較序列，參考文獻(xiàn)方法[16]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果見表4，ABTS法測(cè)定的抗氧化活性與各峰關(guān)聯(lián)度排名為色譜峰1＞5＞11＞14＞10＞12＞7＞2＞4＞9＞6＞15＞3＞8＞13，關(guān)聯(lián)度均大于0.75；FRAP法測(cè)定的抗氧化活性與各峰關(guān)聯(lián)度排名為色譜峰6＞7＞9＞15＞14＞4＞5＞1＞13＞12＞8＞10＞2＞11＞3，關(guān)聯(lián)度均大于0.80；O2－·法測(cè)定的抗氧化活性與各峰關(guān)聯(lián)度排名為色譜峰5＞6＞7＞14＞1＞12＞9＞3＞8＞11＞4＞15＞2＞10＞13，關(guān)聯(lián)度均大于0.75，峰5、6、7、14在兩個(gè)抗氧化指標(biāo)中關(guān)聯(lián)度居于前五位，其與抗氧化活性關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。

表4 抗氧化活性與各峰之間關(guān)聯(lián)度Tab 4 Correlation between antioxidant activity and chromatographic peaks

2.5.2 偏最小二乘回歸分析 參考文獻(xiàn)方法[17-18]，利用 SIMCA 14.1 軟件，以30批半夏水提物的ABTS、O2－·清除率的IC50、FeSO4值為因變量x，共有峰峰面積為自變量y，運(yùn)用偏最小二乘回歸分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)和VIP值，評(píng)價(jià)半夏水提物與抗氧化活性之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果以ABTS為指標(biāo)，與之成正相關(guān)的峰，貢獻(xiàn)程度由大到小為峰14、5、4、12；與之成負(fù)相關(guān)的峰，貢獻(xiàn)程度由大到小為峰6、8、3、10、11、15、2、7、1、13、9。以FRAP為指標(biāo)，與之成正相關(guān)的峰，貢獻(xiàn)程度由大到小為峰1、13、8、2、6、14、12、10、4；與之成負(fù)相關(guān)的峰，貢獻(xiàn)程度由大到小為峰5、11、9、3、15、7。以·為指標(biāo)，與之成正相關(guān)的峰，貢獻(xiàn)程度由大到小為峰10、3、7、2、14、5、9；與之成負(fù)相關(guān)的峰，貢獻(xiàn)程度由大到小為峰4、1、13、12、15、11、6、8（見圖4）。VIP值被稱為變量投影重要性指標(biāo)[19]，在統(tǒng)計(jì)分析中用其表示x對(duì)y的解釋能力，當(dāng)VIP值（＞1）越大，其相對(duì)解釋能力則越強(qiáng)，以ABTS為指標(biāo)，VIP＞1的峰由大到小為峰5、14、6、7、8；以FRAP為指標(biāo)，VIP＞1的峰由大到小為峰5、11、6、13、15；以O(shè)2－·為指標(biāo)，VIP＞1的峰由大到小為峰11、7、1、4、10、2、13，以上3個(gè)指標(biāo)中VIP＞1的峰5、6、7、11均出現(xiàn)兩次（不同指標(biāo)中排名前五），峰14雖然只出現(xiàn)一次，但其偏回歸系數(shù)在ABTS中正相關(guān)程度最高，且結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法的分析結(jié)果，得到與半夏抗氧化活性相關(guān)聯(lián)性最密切的幾個(gè)峰為5（尿苷）、6（腺嘌呤）、7（鳥苷）、11（腺苷）、14號(hào)峰（見圖5）。

圖4 半夏提取物各共有峰與抗氧化指標(biāo)間偏回歸系數(shù)Fig 4 Partial regression coefficient between common peaks of Pinelliae Rhizoma extract and antioxidant indexes

圖5 半夏提取物各共有峰與抗氧化指標(biāo)間VIP值Fig 5 VIP value between common peaks of Pinelliae Rhizoma extract and antioxidant indexes

3 討論

本研究前期建立指紋圖譜時(shí)，考察了不同的流動(dòng)相（乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-水、甲醇-水）對(duì)樣品的洗脫效果，結(jié)果乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，基線較平穩(wěn)，分離效果較好；對(duì)210、260、310 nm 3個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，在260 nm波長(zhǎng)下，色譜圖的整體效果較好，大多數(shù)成分均有吸收，色譜峰較多，因此選擇了檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；考察流速分別為0.6、0.8、1.0 mL·min－1時(shí)色譜峰分離度，結(jié)果流速在0.8 mL·min－1時(shí)色譜峰的峰形及分離效果均較好，故選擇了流速為0.8 mL·min－1。此外對(duì)提取條件進(jìn)行了考察，分別考察了不同提取方法（超聲及回流法），不同提取溶劑（蒸餾水、5%甲醇、10%甲醇），不同提取時(shí)間（30、60、90 min）及不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15），結(jié)果以文中提取條件最佳。

體外抗氧化的研究方法較多，諸如化學(xué)分析法及細(xì)胞抗氧化活性法等[20]，在化學(xué)分析法中又分為基于還原能力測(cè)定的鐵離子還原能力（FRAP），銅離子還原能力及普魯士藍(lán)法，基于自由基清除能力測(cè)定的ABTS法[12]、DPPH法[13]、·OH法及O2－·等[20]方法，其中FRAP法在天然植物的抗氧化能力研究中應(yīng)用較多，但局限于測(cè)定結(jié)果僅能表明抗氧化劑的還原能力，在體外抗氧化研究中往往與自由基清除能力的測(cè)定方法結(jié)合應(yīng)用，更好地說明測(cè)定成分的抗氧化能力，本研究發(fā)現(xiàn)半夏水提物中含有多糖類成分，以DPPH法進(jìn)行測(cè)定，會(huì)產(chǎn)生白色絮狀沉淀，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此選擇ABTS法結(jié)合O2－·及FRAP法為指標(biāo)進(jìn)行體外抗氧化研究。中藥指紋圖譜因其影響因素多、圖譜復(fù)雜等特點(diǎn)，分析時(shí)通常需要闡明其不同成分之間的互作關(guān)系，灰色關(guān)聯(lián)度法在一定程度上能較為客觀地體現(xiàn)各變量間的相互影響[21]；而偏最小二乘回歸分析在多元統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)上還能建立兩變量間的回歸模型，從而進(jìn)行變量關(guān)系的預(yù)測(cè)分析[22]，本文綜合灰色關(guān)聯(lián)度法與偏最小二乘回歸分析，分析得到半夏HPLC指紋圖譜中與抗氧化活性關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的幾個(gè)峰為5（尿苷）、6（腺嘌呤）、7（鳥苷）、11（腺苷）、14號(hào)峰。體外抗氧化的研究報(bào)道中尿苷[23]、鳥苷、腺苷[24]均具有抗氧化作用，王惠等[25]在蟬花抑菌抗氧化譜效關(guān)系的研究中篩選出與抗氧化密切相關(guān)的成分中同樣含有鳥苷、腺苷。李兵[26]的研究提示一定劑量的蛹蟲草腺苷可通過調(diào)節(jié)小鼠腎臟抗氧化酶的活力，從而減輕腎臟氧化應(yīng)激所造成的損傷。文中并未指認(rèn)出14號(hào)峰，后續(xù)可通過液質(zhì)聯(lián)用等手段繼續(xù)研究。

研究報(bào)道半夏可以降低動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)膜增生大鼠的血脂水平[27]，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，但其作用機(jī)制尚未完全清楚。有學(xué)者以氧化應(yīng)激為切入點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)氧自由基及其產(chǎn)物的增加與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，其中被氧化的低密度脂蛋白會(huì)干擾血管合成釋放一氧化氮（NO），使正常的血管舒縮功能受到影響，還能參與調(diào)控相關(guān)因子的表達(dá)，從而影響血管內(nèi)皮功能及機(jī)體凝血功能，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[28]，而抗氧化劑可以防止低密度脂蛋白氧化[29]，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激。本研究中尿苷、鳥苷、腺苷等核苷類成分可在體外發(fā)揮抗氧化作用，體內(nèi)研究表明腺苷A2B受體在機(jī)體內(nèi)也可以參與調(diào)節(jié)血管氧自由基[30]，但該核苷類成分是否為半夏機(jī)體內(nèi)抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，能否減輕機(jī)體氧化損傷還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本文對(duì)半夏HPLC指紋圖譜與抗氧化活性的譜效關(guān)系進(jìn)行初步研究，其水溶性成分抗氧化活性為多成分協(xié)同發(fā)揮作用，為半夏體外抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。