耿春賢，張祉思，陳志釗，李志強，陳曌，江濤

（1.廣州白云山花城藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510555；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué)實驗動物中心，廣東 廣州 510006）

哮喘是一種常見的慢性疾病，威脅全球3.34 億人的健康[1]，2019 年我國成年人哮喘患病率為4.2%，且發(fā)病率逐年增高[2]。過敏性哮喘為最常見的哮喘亞型，主要以2型T 輔助細(xì)胞（T helper cell 2,Th2）免疫應(yīng)答引起嗜酸性粒細(xì)胞（eosnophils,EOS）氣道炎癥以及IgE 介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒為特征[3]，Th1/Th2 失衡是造成Th2 型炎癥反應(yīng)的主要原因[4-5]。因此，維持Th1/Th2 為主的不同亞群的T細(xì)胞功能平衡是控制哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。

中醫(yī)認(rèn)為，哮喘屬于“哮病”范疇，哮喘病位在肺和脾，其根在腎。往往先天腎虧或久病及腎，引發(fā)腎陽虧虛，氣化攝納功能異常，是引起哮喘屢發(fā)不愈的“夙根”[6]，故可采用溫補腎陽法治療哮喘[7]。龜鹿補腎丸是收載于2020 版《中國藥典》的壯陽補腎類中藥復(fù)方，主要由淫羊藿、鹿角膠、龜甲膠、黃芪、山藥等藥味組成，具有補腎陽、壯筋骨和益氣血的功效，臨床用于身體虛弱、精神疲乏、腰腿酸軟、頭暈?zāi)垦?、夜多小便、健忘失眠等癥。相關(guān)研究表明，方藥中的主要藥味淫羊藿可顯著減輕哮喘大鼠氣道炎癥及改善氣道重塑，調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞失衡[8]，并能上調(diào)下丘腦-垂體-腎上腺軸功能[9]。另外，黃芪能調(diào)節(jié)IL-2、IL-4 水平，改變輔助性T 淋巴細(xì)胞1 與2（Th1/Th2）的比值，緩解哮喘癥狀，具有預(yù)防和治療哮喘的作用[10]。但未見龜鹿補腎丸對過敏性哮喘氣道炎癥和Th1/Th2細(xì)胞失衡的研究報道。

本文通過測定卵蛋白（OVA）致敏大鼠哮喘模型的引喘潛伏期、BALF 總白細(xì)胞數(shù)、外周血總白細(xì)胞數(shù)及其分類百分比、外周血IgE 水平、肺組織炎癥改變和氣道黏液分泌變化、Th1、Th2 代表性的細(xì)胞因子含量和Th細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平等多個指標(biāo)，探究龜鹿補腎丸對哮喘大鼠氣道炎癥的干預(yù)作用以及對Th1/Th2 細(xì)胞失衡的影響，為龜鹿補腎丸治療過敏性哮喘提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠，48 只，體質(zhì)量240～260 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：廣東藥科大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物房（SYXK（粵）2017-0125），室溫20～25 ℃，相對濕度為40%～70%，12 h/12 h明暗交替。本動物實驗方案已獲得廣東藥科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號gdpulacspf2017319）。

1.2 藥物與主要試劑

龜鹿補腎丸（廣州白云山花城藥業(yè)有限公司，批號：20200203，按中國藥典2015 版含量測定項下以淫羊藿苷計每克水蜜丸不少于0.2 mg）；地塞米松片（天津力生制藥股份有限公司，批號：20200507）；卵清蛋白，購自美倫生物（批號MO228A）；瑞氏-吉姆薩染色液，購自Baso 公司（批號CZ01003）；AB-PAS 染色試劑盒，購自森貝伽生物科技（批號20200511）；大鼠白細(xì)胞介素-4（IL-4）ELISA 試劑盒（MM-0191R1）、大鼠γ 干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（MM-0785R2）、大鼠白細(xì)胞介素-5（IL-5）ELISA 試劑盒（MM-0094R1）、大鼠白細(xì)胞介素-13（IL-13）ELISA 試劑盒（MM-0085R1）和大鼠免疫球蛋白E（Ig E）ELISA試劑盒（MM-0563R2）均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；SYBR Premix EX TaqⅡKit（2130）、Prime ScriptTMRT reagent Kit（2043）均購自日本TaKaRa公司。

1.3 實驗儀器

YLS-8A 多功能誘咳引喘儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；URIT-2981 型全自動血細(xì)胞分析儀（廣西優(yōu)利特科技有限公司）；VarioskanLUX 多功能酶標(biāo)儀（Termo Fisher Scientific）；BA310-1 生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；TC-120型智能程控生物組織自動脫水機、TK-48 恒溫推片烤片機、TB-718D 生物組織自動包埋機和TB-180I 生物組織全自動染色機均購自湖北泰維科技實業(yè)有限公司；7300 熒光定量儀（美國ABI 公司）；C1000 Thermal cycler PCR 擴增儀（美國BIO-RAD 公司）；Q6000UV超微量紫外分析儀（美國Quawell Technology公司）。

2 方法

2.1 大鼠過敏性哮喘模型的制備與給藥

將48 只雄性SD 大鼠，按體質(zhì)量隨機分為正常對照組，模型組，地塞米松陽性藥物組，龜鹿補腎丸低、中、高劑量組，每組8只。除正常對照組外，其余各組于第1、8 天腹腔注射10%卵蛋白抗原液1 mL致敏，正常對照組腹腔注射等量生理鹽水。從造模第15 天開始，除了正常對照組外，其余各組均超聲霧化1%卵蛋白激發(fā)，每天1 次，每次30 min。連續(xù)霧化激發(fā)3 周后，以2%卵蛋白持續(xù)霧化1 周，正常對照組超聲霧化等量生理鹽水。從造模第15 天開始，每次霧化激發(fā)前1 h，灌胃給予高、中、低劑量的龜鹿補腎丸（高、中、低劑量分別為臨床劑量的4、2、1 倍，即7.2 g/kg、3.6 g/kg、1.8 g/kg）和地塞米松（0.5 mg/kg），正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 行為學(xué)觀察和引喘潛伏期測定

第43 天霧化激發(fā)時，觀察10 min 內(nèi)大鼠抓鼻、撓癢以及哮喘發(fā)作癥狀等哮喘行為學(xué)特征并評分：無抓鼻或撓癢動作計0 分，抓鼻或撓癢出現(xiàn)1～2 次計1 分，3～4 次計2 分，5 次及以上的計3 分[11]。此外，觀察并記錄引喘潛伏期，即從卵蛋白開始激發(fā)到出現(xiàn)抓耳撓腮、腹式呼吸等特征較明顯過敏性哮喘癥狀的時間。

2.3 樣本采集與指標(biāo)檢測

2.3.1 樣本采集 大鼠末次霧化激發(fā)24 h 后，腹腔注射3%（φ）戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉動物，腹主動脈先采血0.5 mL（EDTA 抗凝），然后再采血約4 mL，靜置30 min 后，2 ～8 ℃下冷凍離心10 min（3 500 r/min），分離血清，放入-80 ℃保存?zhèn)溆?。取血后，于頸部氣管下端作T 形切口，行氣管插管，用注射器緩緩注入2 mL 生理鹽水，反復(fù)3 次進行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液（BALF），4 °C ，1 000 r/min離心10 min，取上清液-80°C 保存。然后取出右肺組織，將右肺上葉放于預(yù)先標(biāo)號的凍存管中，液氮速凍保存?zhèn)溆茫溆喾谓M織用0.9%生理鹽水清洗3次，4%多聚甲醛固定液中固定保存。

2.3.2 外周血和肺泡灌洗液（BALF）中總白細(xì)胞計數(shù) 采用全自動血細(xì)胞分析儀，對抗凝的外周全血檢測白細(xì)胞總數(shù)。BALF 離心后，將余下細(xì)胞碎片用0.1 mL 生理鹽水混勻，取其中20 μL 加入到細(xì)胞計數(shù)板，室溫靜置2～3 min。待白細(xì)胞完全下沉，在低倍鏡下計數(shù)4 個大方格內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。每毫升BALF 中含白細(xì)胞總數(shù)=4 大格的細(xì)胞總數(shù)/4×10 000。

2.3.3 外周血白細(xì)胞分類計數(shù) 吸取抗凝管5～7 μL血，滴在載玻片的一端，然后用左手持載玻片，用右手持玻片，勻速將血液向載玻片的另一端快速推動，待血涂片自然晾干后進行瑞氏姬姆薩染色，鏡下計數(shù)100 個白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)，并計算其百分比。

2.3.4 肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IL-5、IL-13 以及IFN-γ含量檢測 將BALF 上清液從-80°C 取出，于室溫下放置15 min，按照ELISA 法試劑盒說明書，檢測各組大鼠BALF 的IL-4 IL-5、IL-13 和IFN-γ水平。

2.3.5 血清總IgE 含量檢測 將血清從-80 ℃中取出，室溫放置15 min，采用ELISA法測定IgE濃度。2.3.6 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 肺組織于4%（φ）多聚甲醛固定48 h 后，常規(guī)濃度梯度酒精及石蠟中進行脫水浸蠟處理，石蠟包埋，切成厚度為4 μm 的切片，HE 染色，鏡下觀察肺組織的病理變化并拍照記錄。按照PAS 染色試劑盒說明書進行操作，觀察肺組織中黏液性物質(zhì)的分泌，應(yīng)用ImagePro Plus6.0 圖像分析軟件，以氣道壁黏液染色陽性面積進行定量分析[12]。

2.3.7 過敏性哮喘模型大鼠肺組織T-bet、GATA-3的基因表達水平檢測 T-bet、GATA-3 的mRNA 基因引物從Genebank 中查閱相關(guān)cDNA 序列，根據(jù)引物設(shè)計原則，用Primer Premier 6.0 輔助設(shè)計，引物由上海生工生物有限公司合成。以β-actin 為內(nèi)參照，β-actin：上游引物5′-CCGTAAAGACCTCTATGC CAA-3′，下游引物5′-CGGACTCATCGTACTCCT GCT-3′；T-bet：上游引物5′-TCTGTCGAACCAGTA TCCTGT-3′，下游引物5′-CTTCACGCTCACTGC TCG GAA-3′；GATA-3′：上游引物5′-TCTGGAGG AGGAACGCTAAC-3′，下游引物5′- CTTACGGTT TCGGGTCTGGAT-3′。

將適量凍存肺組織研磨，按照TRIzol 法提取肺組織中總RNA。以1 μg 總RNA 為模板，按照Prime Script TMRT reagent Kit 說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin 為內(nèi)參基因，應(yīng)用ABI Real Time PCR 儀進行熒光定量PCR。Real time PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個循環(huán)。融解曲線分析：94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，94 ℃延伸30 s。每個樣品重復(fù)3 次。按照2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。

2.3.8 統(tǒng)計方法 使用軟件SPSS25.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)均用表示，多組間比較采用單因素方差分析。方差齊者，組間比較采用LSD法進行分析；方差不齊者，選用Tamhane's T2 法進行分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用Mann-Whineyu 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龜鹿補腎丸對過敏性哮喘大鼠的癥狀評分和引喘潛伏期的影響

與正常對照組相比，模型組在霧化過程中表現(xiàn)出明顯抓鼻、撓癢等癥狀，癥狀評分明顯增加，而哮喘潛伏期明顯縮短（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組和龜鹿補腎丸低、中、高劑量組均能顯著降低哮喘癥狀評分，并顯著延長引喘潛伏期（P＜0.01）。見表1。

表1 龜鹿補腎丸對哮喘模型大鼠的癥狀評分及潛伏期的影響Table 1 Effect of Guilubushen pill on symptom score and incubation period of asthmatic rats(±s,n=8)

表1 龜鹿補腎丸對哮喘模型大鼠的癥狀評分及潛伏期的影響Table 1 Effect of Guilubushen pill on symptom score and incubation period of asthmatic rats(±s,n=8)

與正常對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

癥狀評分0.75±0.46 2.50±0.53##0.88±0.35**2.13±0.35*1.25±0.46**1.13±0.35**組別__________________________正常對照組模型組地塞米松組龜鹿補腎丸低劑量組中劑量組高劑量組_________________劑量/（g·kg-1）______________--0.5 mg 1.80 3.60 7.20________________潛伏期/s 236.75±32.29 61.25±24.33##129.50±34.63**123.63±23.12**152.00±47.68**143.50±23.32**

3.2 龜鹿補腎丸對過敏性哮喘大鼠外周血和BALF中總白細(xì)胞計數(shù)的影響

與正常對照組相比，模型組外周血和BALF 中總白細(xì)胞數(shù)顯著增高（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組相比，地塞米組、龜鹿補腎丸低、中、高劑量組均能顯著降低過敏性哮喘大鼠外周血和BALF中的總白細(xì)胞數(shù)（P＜0.01或P＜0.05）。見表2。

表2 龜鹿補腎丸對哮喘模型大鼠BALF和外周血中總白細(xì)胞數(shù)的影響Table 2 Effect of Guilubushen pill on the total white cell counts in BALF and peripheral blood of asthmatic rats(±s,n=8)

與正常對照組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常對照組模型組地塞米松組龜鹿補腎丸低劑量組中劑量組_______________高劑量組劑量/（g·kg-1）總白細(xì)胞數(shù)外周血（×109/L）7.88±1.38 10.33±2.59#2.35±1.36**7.33±2.67**6.61±1.29**7.40±2.94*--0.5 mg 1.80 3.60 7.20___________________BALF（×104/mL）26.32±2.24 42.91±3.53##24.28±1.15**35.34±1.68**33.25±2.04**38.53±1.58**

3.3 龜鹿補腎丸對OVA 致過敏性哮喘大鼠外周血白細(xì)胞分類百分比的影響

與正常對照組相比，模型組外周血淋巴細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比以及中性粒細(xì)胞百分比均顯著增大（P＜0.01）。與模型組相比，地塞米松組的淋巴細(xì)胞百分比和嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯降低（P＜0.01），而中性粒細(xì)胞百分比顯著增大（P＜0.01）；龜鹿補腎丸組的淋巴細(xì)胞百分比和嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），中性粒細(xì)胞百分比則顯著增大（P＜0.01）。見表3。

表3 龜鹿補腎丸對哮喘大鼠的外周血白細(xì)胞分類百分比影響Table 3 Effect of Guilubushen pill on the percentage of leukocyte classification in peripheral blood of asthmatic rats(±s,n=8)

表3 龜鹿補腎丸對哮喘大鼠的外周血白細(xì)胞分類百分比影響Table 3 Effect of Guilubushen pill on the percentage of leukocyte classification in peripheral blood of asthmatic rats(±s,n=8)

與正常對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

中性粒細(xì)胞/%12.75±4.65 23.13±6.40##84.50±3.34**33.25±5.44**37.25±4.46**40.00±7.31**組別________________________正常對照組模型組地塞米松組龜鹿補腎丸低劑量組中劑量組高劑量組___________淋巴細(xì)胞/%________44.25±6.36 66.50±6.52##11.25±3.20**59.50±5.48*53.38±4.69**46.63±8.28**嗜酸性粒細(xì)/%______0.38±0.52 8.00±1.20##1.13±0.35**4.25±0.71**1.13±0.99**1.00±0.76**單核細(xì)胞/%42.63±5.18 2.38±1.19##3.13±1.73 3.00±1.51 8.25±2.12**12.38±3.20**

3.4 龜鹿補腎丸對OVA 致過敏性哮喘大鼠外周血IgE含量的影響

與正常對照組相比，模型組大鼠外周血IgE 水平顯著增高（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米組、龜鹿補腎丸低劑量、中劑量、高劑量組均能極顯著降低過敏性哮喘大鼠外周血IgE水平（P＜0.01）。見表4。

表4 龜鹿補腎丸對哮喘大鼠外周血IgE含量的影響Table 4 Effect of Guilubushen pill on IgE content in peripheral blood of asthmatic rats (±s,n=8)

表4 龜鹿補腎丸對哮喘大鼠外周血IgE含量的影響Table 4 Effect of Guilubushen pill on IgE content in peripheral blood of asthmatic rats (±s,n=8)

與正常對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：**P＜0.01。

IgE/（μg·mL-1）0.52±0.03 0.55±0.02#0.49±0.02**0.46±0.02**0.42±0.03**0.47±0.03**組別________________________________________正常對照組模型組地塞米松組龜鹿補腎丸低劑量組中劑量組高劑量組______________________________劑量/（g·kg-1）--0.5 mg 1.80 3.60 7.20

3.5 龜鹿補腎丸對OVA 致過敏性哮喘大鼠肺組織病理態(tài)學(xué)的影響

如圖1 所示，HE 染色結(jié)果顯示，正常對照組支氣管管壁光滑，支氣管上皮細(xì)胞未見增生，管壁無明顯增厚，支氣管及血管周圍無明顯炎性細(xì)胞浸潤。模型組支氣管上皮細(xì)胞增生，管腔峽窄，支氣管及血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤。地塞米松組支氣管及血管周圍有少量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌輕度增厚，未見明顯管腔縮窄。龜鹿補腎丸低、中、高劑量組支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤逐漸減少，支氣管平滑肌輕度增厚，未見明顯管腔縮窄。

圖1 龜鹿補腎丸對哮喘大鼠肺組織病理變化的影響（100×）Figure 1 Effect of Guilubushen pill on pathological change of lung tissue in asthmatic rats（100×）

AB-PAS 染色結(jié)果（圖1）顯示，正常對照組的大鼠氣道組織無明顯的杯狀細(xì)胞和黏液分泌；模型組氣道組織可見大量杯狀細(xì)胞增生，氣道黏液分泌增加，酸性黏液物質(zhì)陽性面積顯著高于正常對照組（P＜0.01）；地塞米松組和龜鹿補腎丸中劑量組大鼠氣道組織杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，地塞米松組和龜鹿補腎丸低劑量、中劑量、高劑量組的大鼠酸性黏液物質(zhì)陽性面積較模型組顯著降低（P＜0.01）。龜鹿補腎丸對哮喘大鼠酸性黏液物質(zhì)陽性面積的影響見表5。

表5 龜鹿補腎丸對哮喘大鼠氣道組織黏液物質(zhì)陽性面積的影響Table 5 Effect of Guilubushen pill on the positive area of acidic mucous substances in the airway wall of asthmatic rats(±s,n=8)

表5 龜鹿補腎丸對哮喘大鼠氣道組織黏液物質(zhì)陽性面積的影響Table 5 Effect of Guilubushen pill on the positive area of acidic mucous substances in the airway wall of asthmatic rats(±s,n=8)

與正常對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01。

酸性黏液物質(zhì)陽性面積/%2.32±1.29 12.25±1.93##4.50±2.08**7.36±0.92**3.61±2.20**5.85±1.52**組別________________________________________正常對照組模型組地塞米松組龜鹿補腎丸低劑量組中劑量組高劑量組____________________________劑量/（g·kg-1）--0.5 mg 1.80 3.60 7.20

3.6 龜鹿補腎丸對哮喘模型大鼠BALF 中趨化因子、細(xì)胞因子水平影響

與正常對照組相比，模型組大鼠的BALF 中的IL-4、IL-5和IL-13水平顯著升高（P＜0.01），IFN-γ水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，龜鹿補腎丸低、中、高劑量組和地塞米松組的BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13 水平均顯著下降（P＜0.01 或P＜0.05），龜鹿補腎丸高劑量組IFN-γ水平明顯升高（P＜0.01）。見表6。

表6 龜鹿補腎丸對哮喘模型大鼠BALF中趨化因子、細(xì)胞因子水平的影響Table 6 Effect of Guilubushen pill on chemokines and cytokines in BALF of asthmatic rats(±s,n=8)

表6 龜鹿補腎丸對哮喘模型大鼠BALF中趨化因子、細(xì)胞因子水平的影響Table 6 Effect of Guilubushen pill on chemokines and cytokines in BALF of asthmatic rats(±s,n=8)

與正常對照組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

IFN-γ/（pg·mL-1）352.57±56.44 315.62±38.84#348.16±22.47 340.26±39.88 347.59±15.14 372.92±24.35**組別_______________________正常對照組模型組地塞米松組龜鹿補腎丸低劑量組中劑量組高劑量組IL-4/（pg·mL-1）______20.95±2.32 28.12±5.16##18.30±3.06**21.99±4.82**17.81±1.99**18.73±2.24**IL-5/（ng·mL-1）_____4.87±0.90 6.48±0.98##4.33±0.56**5.21±0.79**4.06±0.27**3.68±0.43**_________________IL-13/（ng·mL-1）4.34±0.73 6.40±1.36##4.06±0.38**5.27±1.18*4.19±0.79**4.69±0.40**

3.7 龜鹿補腎丸對OVA 致哮喘模型大鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組的大鼠肺組織T-bet mRNA 表達顯著減少（P＜0.01），GATA-3 mRNA 表達顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組的大鼠肺組織T-bet mRNA 表達顯著增加（P＜0.05），GATA-3 mRNA 表達顯著減少（P＜0.01），龜鹿補腎丸各組的大鼠肺組織T-bet mRNA 表達增加（P＜0.05），GATA-3 mRNA 表達均顯著減少（P＜0.01）。見表7。

表7 龜鹿補腎丸對哮喘模型大鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA表達的影響Table 7 Effect of Guilubushen pill on T-bet and GATA-3 mRNA in lung tissue of asthmatic rats(±s,n=8)

表7 龜鹿補腎丸對哮喘模型大鼠肺組織T-bet、GATA-3 mRNA表達的影響Table 7 Effect of Guilubushen pill on T-bet and GATA-3 mRNA in lung tissue of asthmatic rats(±s,n=8)

與正常對照組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

GATA-3相對表達量0.96±0.04 1.35±0.25#0.45±0.07**0.58±0.06**0.78±0.17**0.69±0.24**組別_______________________正常對照組模型組地塞米松組龜鹿補腎丸低劑量組中劑量組高劑量組劑量/（g·kg-1）____________--0.5 mg 1.8 3.6 7.2 T-bet相對表達量1.05±0.25 0.10±0.02##0.47±0.12*0.49±0.26*0.61±0.28**0.82±0.14**

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過敏性哮喘是由多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、2 型固有淋巴細(xì)胞）共同參與的慢性氣道炎癥。研究表明，氣道炎癥是引起過敏性哮喘的基本病理變化和反復(fù)發(fā)作的主要機制，而不同功能的T 細(xì)胞在氣道炎癥的始動和調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用，其中輔助T 淋巴細(xì)胞（T helper cell，Th）兩種亞型Th1 和Th2 的失衡是哮喘發(fā)病的重要機制[13]。在哮喘的發(fā)病中，Th2 亢進是哮喘形成及進展的關(guān)鍵性機制，Th2 細(xì)胞分泌的高水平致炎因子作用于呼吸道，炎癥介質(zhì)聯(lián)合并導(dǎo)致平滑肌收縮、杯狀細(xì)胞增生、黏液分泌增加、血管通透性增高以及EOS 浸潤，慢性炎癥持續(xù)進展會破壞氣道上皮完整性[14]。哮喘患者氣道炎癥不僅與血清總IgE含量密切相關(guān)，T細(xì)胞的免疫失衡也是導(dǎo)致過敏性哮喘患者體內(nèi)IgE 合成增多，EOS 滅活減少的重要原因[15]。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，龜鹿補腎丸能顯著降低過敏性哮喘大鼠BALF和外周血的總白細(xì)胞數(shù)，并且其淋巴細(xì)胞百分比和嗜酸性粒細(xì)胞百分比也明顯減少，外周血的IgE 水平明顯下降，改善支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤，減少黏液分泌，提示龜鹿補腎丸能緩解OVA 誘導(dǎo)的過敏性哮喘大鼠的氣道炎癥。

研究表明Th2型細(xì)胞因子增高在過敏性哮喘發(fā)病機制中起著重要的作用。Th2細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，其中IL-4、IL-5 和IL-13 不僅在過敏性哮喘病理生理中起著核心作用，還可進一步促進Th2 型細(xì)胞的發(fā)育[16]。IL-4 為Th2 細(xì)胞分泌的代表因子，不僅能促進Th2 分泌IL-5 及其他促炎細(xì)胞因子，同時還能抑制Th1 分泌IFN-γ等抗炎細(xì)胞因子，促使Th1/Th2 平衡向Th2 轉(zhuǎn)化；另外，IL-4 能促進B 細(xì)胞分化、增殖和活化，刺激B 細(xì)胞合成IgE。IL-13 與IL-4 均可與IL-4 受體a（IL-4 receptor,IL-4Ra）結(jié)合，兩者均可誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞化生，促進黏液的產(chǎn)生。IL-5 作為EOS 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)EOS 從血液進入肺實質(zhì)，并促進EOS 的成熟、活化[17]。相關(guān)研究也表明Th1分泌的細(xì)胞因子對哮喘的發(fā)生發(fā)展存在一定的抑制作用。IFN-γ為Thl 型細(xì)胞因子的代表，通過抑制IL-4、IL-5 合成阻斷IgE 的生成，同時在Th0 的分化過程中，可以誘導(dǎo)其向Th1 細(xì)胞的方向分化[18]。

Th1/Th2 失衡是哮喘發(fā)病的重要基礎(chǔ)，而決定Th0細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵調(diào)控因素為轉(zhuǎn)錄因子的選擇性表達。轉(zhuǎn)錄因子中T-bet 是Th1 細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，促進Th1細(xì)胞分化和Th1型細(xì)胞因子（如IFN-γ）分泌，并具有逆轉(zhuǎn)Th2 為Th1 的作用［18］。GATA-3 是Th2 細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，GATA-3 能激活I(lǐng)L-4、IL-5、IL-13等所有Th2型細(xì)胞因子的啟動子，誘導(dǎo)IL-4、IL-5、IL-13等的表達，在T細(xì)胞的發(fā)育和Th2 細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，并可將Th1 逆轉(zhuǎn)為Th2[19]。因此，促進T-bet 表達和抑制GATA-3 表達，可逆轉(zhuǎn)Th2漂移，促進Th1型細(xì)胞因子的合成，抑制Th2 型細(xì)胞因子的合成，有利于控制氣道炎癥[20]。

本文在明確龜鹿補腎丸能減輕過敏性哮喘大鼠氣道炎癥作用的基礎(chǔ)上，選取哮喘免疫調(diào)節(jié)機制中經(jīng)典的Th1/Th2 失衡作為主要研究對象，通過觀察龜鹿補腎丸對哮喘大鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平的干預(yù)以及肺組織T-bet、GATA-3 mRNA表達的影響，探討其對防治哮喘的作用機制。研究結(jié)果顯示，OVA 刺激后模型組大鼠BALF 中的IL-4、IL-5、IL-13 含量顯著上升，IFN-γ含量明顯降低，大鼠肺組織的T-bet mRNA 表達量明顯減少，GATA-3 mRNA 表達量顯著增加。經(jīng)龜鹿補腎丸干預(yù)后BALF 中IL-4、IL-5、IL-13 含量明顯下降，IFN-γ含量明顯升高，大鼠肺組織的T-bet mRNA 表達量顯著增加，而GATA-3 mRNA 表達量明顯減少，提示龜鹿補腎丸可能通過抑制Th2 分化，糾正Th1/Th2的平衡，改善由OVA 造成的氣道炎癥損傷。

綜上所述，龜鹿補腎丸能減輕OVA 致過敏性哮喘模型大鼠氣道炎癥，其機制可能是通過促進T-bet mRNA表達和IFN-γ分泌，抑制GATA-3 mRNA表達和IL-4、IL-5 和IL-13 產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2 失衡，調(diào)節(jié)炎性因子水平以發(fā)揮抑制哮喘性氣道炎癥的作用。