黃上書，羅宇琴，宋葉，范耀耀，雷欣荷，2，李國衛(wèi)，陳向東

（1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室/廣東（省）教育廳高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

牛膝和川牛膝為我國常用中藥，均有補益肝腎和行瘀達下的功效，其中牛膝以補益肝腎為主，而川牛膝以行瘀達下為主，臨床上需區(qū)別使用[1-2]。兩者藥材差異明顯，均能通過性狀、顯微鑒別[3-5]、理化鑒別[6]、指紋圖譜如紅外光譜法或X 射線衍射法[7]等進行區(qū)分。牛膝、川牛膝配方顆粒分別由牛膝Achyranthes bidentataBl.、川牛膝Cyathula of‐ficinalisKuan[3]飲片經(jīng)水提、濃縮、制粒等現(xiàn)代工藝制成，已不具備中藥飲片性狀、顯微特征[8-9]等，加之兩者化學(xué)成分類似，均以三萜皂苷類、甾酮類、糖類等成分為主，其紫外光譜和蛋白質(zhì)指紋圖譜也相似[7]，難以通過傳統(tǒng)鑒別方法進行區(qū)分。據(jù)文獻報道，尚風琴等[10]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）建立了兩者的指紋圖譜，通過圖譜的含量、結(jié)構(gòu)信息能夠區(qū)別牛膝和川牛膝藥材。孟虎彪等[11]報道了適用于配方顆粒的牛膝、川牛膝特異性PCR 鑒別方法，能進行牛膝和川牛膝配方顆粒的特異性鑒別，但該法未能解決牛膝和川牛膝互相摻偽的問題。因牛膝和川牛膝的臨床適用差異較大，且兩者在外觀形態(tài)上相似，易被誤用[12]，特別是制成配方顆粒后，鑒別難度進一步加大。因此，為進一步完善質(zhì)量控制體系，需建立一種能夠快速同時鑒別牛膝和川牛膝配方顆粒的方法。

多重PCR 可同時擴增和檢測多個目標片段，可鑒別多個物種是否存在相互摻雜。該法已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如對石斛[13]、九里香[14]、海馬[15]等多基原中藥的鑒別，對蒼耳子[16]、重樓[17]、金錢白花蛇[18]、地龍[19]及其偽品的鑒別，以及對人參、三七、西洋參[20]等的摻雜檢測。本研究旨在建立一種能夠同時鑒別牛膝和川牛膝原料及配方顆粒的多重位點特異性PCR 鑒別方法，通過一次PCR 反應(yīng)即可對牛膝、川牛膝及其互相摻偽進行鑒別。

1 材料

1.1 儀器

BioSpec-nano 紫外分光光度計（島津公司）；StepOne Real-time PCR 儀（Thermo Scientific公司）；ABI MiniAmp Plus 型PCR 儀（Thermo Scientific 公司），T100 PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.2 試劑和試藥

2×Pfu PCR Master Mix DNA（批號：KP201）、2 ×Taq PCR Master Mix（批號：KT201）聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司，2×M5 Supper Fast‐Taq PCR Master Mix（批號：MF164）購自北京聚合美生物科技有限公司，Multiplex PCR 5×Master Mix（批號：M0284S）購自NEU ENGLAND Biolabs 公司；DNA Marker DL1000（批號：3591A）購自Takara公司；高效植物基因組DNA 提取試劑盒（批號：DP350）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 供試品

牛膝和川牛膝藥材各10批，來自河南、內(nèi)蒙古、河北、四川、重慶、湖北等不同地區(qū)；牛膝和川牛膝配方顆粒各10 批，均來自廣東一方制藥有限公司。藥材樣本經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任鑒定。樣本信息見表1。

表1 牛膝和川牛膝樣本信息表Table 1 Sample information of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2 方法與結(jié)果

2.1 引物設(shè)計

參考文獻[11]所選牛膝引物進行研究，并下載NCBI數(shù)據(jù)庫的牛膝和川牛膝ITS序列，比對并篩選出兩者的SNP 位點，使用Primer Premier 5 軟件設(shè)計了川牛膝特異性鑒別引物。引物信息見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 牛膝和川牛膝特異性引物Table 2 Specific primers of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.2 DNA提取

2.2.1 牛膝和川牛膝藥材 取藥材細粉0.1 g，使用改良CTAB 法[11]提取總DNA，使用BioSpec-nano 測定DNA，調(diào)整濃度至100 ～300 ng/μL。

2.2.2 牛膝和川牛膝配方顆粒 取配方顆粒細粉0.3 g 于15 mL 離心管中，加入預(yù)熱的CTAB 沉淀液（2.0% 十六烷基三甲基溴化銨，100 mmol/L Tris-鹽酸pH 8.0，20 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉pH 8.0)5 mL，混勻，65 ℃水浴加熱1 h（期間混勻2～4次），離心，12 000 r/min，5 min，棄去上清液；再加入CTAB沉淀液5 mL，重復(fù)操作1次；沉淀置于新的2 mL離心管中，再使用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。

2.3 單重引物特異性驗證

分別對牛膝及川牛膝配方顆粒的特異性引物進行驗證，其中牛膝參考文獻[11]條件，川牛膝PCR擴增體系25 μL：2×MightyAmp Buffer 12.5 μL，引物F/R 各0.3 μL，Mighty Amp（1.25 U/μL）0.3 μL，DNA 模板（100～300 ng）1 μL，去離子水補足至25 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。待PCR 擴增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR 產(chǎn)物6 μL 經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)GelRed 顯色，最后于凝膠成像儀觀察記錄結(jié)果。其中牛膝特異性PCR 結(jié)果見圖1，川牛膝特異性PCR結(jié)果見圖2。可見，牛膝及川牛膝特異性PCR 均在目標條帶有單一的DNA目標條帶，說明該方法特異性較好。

圖1 牛膝位點特異性PCR法樣品電泳圖Figure 1 Electropherograms of the allele-specific PCR assay of Achyranthes bidentata

圖2 川牛膝位點特異性PCR法樣品電泳圖Figure 2 Electropherograms of the allele-specific PCR assay of Cyathula officinalis

2.4 多重PCR條件考察

將牛膝及川牛膝確定的特異性PCR 引物組合進行調(diào)試，通過單因素試驗分別考察不同退火溫度、不同循環(huán)次數(shù)、不同引物量、不同PCR 儀及不同DNA 聚合酶對多重PCR 鑒別的影響。反應(yīng)體系25 μL：2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μL，牛膝上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，川牛膝上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板（100～300 ng）1 μL，滅菌超純水9.5 μL。PCR 擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)反應(yīng)31次（95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s），最后72 ℃再延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)GelRed 預(yù)染的3%的瓊脂糖凝膠電泳，于成像儀觀察結(jié)果。

2.4.1 退火溫度 分別考察退火溫度為56、58、60 ℃時，對牛膝和川牛膝配方顆粒的鑒別影響，結(jié)果見圖3，牛膝和川牛膝分別獲得187 bp 和164 bp 的條帶，且陰性及空白無干擾，為保證方法的穩(wěn)定性，確定多重PCR退火溫度為58 ℃。

圖3 退火溫度及循環(huán)次數(shù)對牛膝和川牛膝多重PCR鑒別的影響Figure 3 Effect of annealing temperature and cycles on identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis by multiplex PCR

2.4.2 循環(huán)次數(shù) 當循環(huán)次數(shù)為29～33 次時，牛膝及川牛膝均可獲得相應(yīng)的目標條帶，見圖3，為保證方法的穩(wěn)定性，選擇31次循環(huán)。

2.4.3 引物量 分別考察牛膝和川牛膝引物量均為0.8、1.0、1.2 μL 時對多重PCR 的影響，結(jié)果見圖4，牛膝及川牛膝均可獲得相應(yīng)的目標條帶，因此確定牛膝和川牛膝引物用量均為1.0 μL。

圖4 不同引物量及不同儀器對牛膝和川牛膝多重PCR鑒別的影響Figure 4 Effect of different primers and instruments on multiplex PCR identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.4.4 PCR 儀 使用上述確定的PCR 方法在不同PCR 儀上考察方法的耐用性。結(jié)果見圖4，使用不同型號的PCR 儀，均能獲得正確的鑒別結(jié)果，由于多重PCR 對退火溫度較為敏感，應(yīng)對PCR 儀進行溫度校正[19]。

2.4.5 DNA聚合酶體系 使用上述確定的PCR方法考察不同酶（2×Pfu PCR Master Mix、2×Taq PCR Master Mix、2×M5 Supper FastTaq PCR Master Mix、Multiplex PCR 5×Master Mix）對結(jié)果的影響。結(jié)果見圖5，使用2×Pfu 酶能夠獲得正確的結(jié)果，因此選擇2×Pfu PCR Master Mix DNA聚合酶體系。

圖5 不同DNA聚合酶對牛膝和川牛膝多重PCR鑒別的影響Figure 5 Effect of different DNA polymerases on multiplex PCR identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.5 適用性與靈敏度試驗

2.5.1 適用性考察 采用建立的方法對上述牛膝和川牛膝藥材及配方顆粒樣品進行多重位點特異性鑒別，結(jié)果見圖6，牛膝供試品均可獲得187 bp 的特異性條帶，川牛膝供試品均可獲得164 bp 的特異性條帶，陰性及空白無干擾。

圖6 牛膝和川牛膝多重PCR鑒別適用性試驗Figure 6 Applicability test of multiplex PCR for identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.5.2 靈敏度考察 為考察方法的靈敏度，分別取牛膝及川牛膝藥材、牛膝及川牛膝配方顆粒DNA樣品以99∶1、95∶5、90∶10、80∶20、50∶50、20∶80、10∶90、5∶95、1∶99 比例混合，按“3.1”項下確定的方法進行多重PCR 鑒定，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，在牛膝藥材中摻入1%川牛膝藥材，在川牛膝藥材中摻入5%牛膝藥材，均能明顯檢出；在牛膝配方顆粒中摻入50%川牛膝配方顆粒，在川牛膝配方顆粒中摻入10%牛膝配方顆粒，均能明顯檢出。

圖7 牛膝和川牛膝多重PCR鑒別摻偽檢測限考察Figure 7 Detection limit for adulteration of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis by multiplex PCR

3 討論

本研究以配方顆粒的摻偽或混偽鑒別為目的，通過多重PCR 法建立了牛膝和川牛膝配方顆粒的鑒別體系，能有效地從藥材-配方顆粒進行傳遞，保證從源頭到成品基原的準確性。在DNA 提取考察中，牛膝和川牛膝配方顆粒均含有大量多糖，其水提取物黏性較大，且DNA提取過程中殘留的輔料可能對PCR 擴增存在一定影響。本研究使用CTAB沉淀液進行樣品的預(yù)處理，降低輔料干擾，再通過試劑盒或其他方法純化DNA，獲得的DNA 質(zhì)量較好。說明該方法適用于含多糖較高樣品的DNA提取。

建立的多重PCR 鑒別方法中牛膝和川牛膝分別可擴增出187 bp 和164 bp 的特異性條帶，說明該方法的鑒定準確率為100%，對牛膝藥材以及川牛膝藥材的最低檢測限為均為5%（6 ng），且在牛膝藥材中摻入1%川牛膝藥材，在川牛膝藥材中摻入5%牛膝藥材，均能明顯檢出，說明該方法能有效用于原料的控制。

此外，在牛膝配方顆粒中摻入50%川牛膝配方顆粒，在川牛膝配方顆粒中摻入10%牛膝配方顆粒，也均能明顯檢出。表明該方法對于牛膝或川牛膝配方顆粒的摻雜鑒定靈敏度均較低，可能與配方顆粒經(jīng)過加熱提取后大部分DNA 被破壞有關(guān)。此外，川牛膝藥材多重PCR 鑒別結(jié)果在400～700 bp 存在非特異性擴增條帶，而單重特異性鑒別中僅164 bp 存在目標條帶，說明兩者藥材多重PCR 方法中存在非特異性擴增，但在配方顆粒中非特異性擴增干擾較小，因此該法對配方顆粒的鑒別較好。本研究建立的牛膝和川牛膝配方顆粒多重PCR 鑒別方法能夠通過一次PCR 反應(yīng)即可對牛膝、川牛膝及其互相摻雜進行鑒別，為牛膝和川牛膝配方顆粒的質(zhì)量控制提供了參考。