周如欣,史樹(shù)德

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

1 植物細(xì)胞自噬

自噬是一種普遍存在于真核生物體內(nèi)的進(jìn)化上高度保守的胞內(nèi)物質(zhì)降解途徑,主要用于胞內(nèi)物質(zhì)的更新和營(yíng)養(yǎng)匱乏狀態(tài)下的細(xì)胞存活,同時(shí)也參與個(gè)體衰老和病原體侵染等過(guò)程。自日本科學(xué)家因自噬方面的貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)之后,自噬的研究熱度與日俱增,對(duì)植物的研究也逐漸從模式作物向農(nóng)作物拓展,這些研究發(fā)現(xiàn),自噬在作物抗逆生理中發(fā)揮重要作用。為更好地理解自噬在其中扮演的角色,本文對(duì)自噬的分子機(jī)制、在逆境脅迫中的作用與機(jī)制等進(jìn)行總結(jié)。

1.1 自噬的分類

植物細(xì)胞自噬按內(nèi)容物及運(yùn)輸方式分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和超自噬(mega-autophagy)三種[1-2]。按對(duì)降解底物的選擇性又可分為選擇性自噬和非選擇性自噬。巨自噬最顯著的特征就是存在雙層膜的自噬體(autophagosome),通過(guò)形成自噬體包裹待降解物,隨后自噬體外膜與液泡膜融合,內(nèi)膜釋放入液泡形成自噬小體(autophagic body),最終底物在水解酶的作用下被降解[3-4]。微自噬指的是液泡膜通過(guò)內(nèi)吞作用將待降解物直接包裹進(jìn)液泡[5]。超自噬指通過(guò)液泡膜滲透或破裂,直接向細(xì)胞質(zhì)釋放大量液泡水解酶,實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中降解細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)的一種極端自噬過(guò)程,是植物特有的自噬[6];超自噬通常也降解細(xì)胞壁,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,是發(fā)育性細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)最后階段的典型特征,參與植物發(fā)育和抗病[2]。巨自噬是最主要的自噬降解途徑,也是通常意義上的自噬,無(wú)特殊說(shuō)明時(shí),本文所述自噬即為巨自噬。

1.2 自噬的分子機(jī)制

自噬的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的膜重排,通過(guò)膜的封閉與融合實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)容物的更新。自噬過(guò)程主要包括:自噬的誘導(dǎo)、自噬前體的形成、自噬前體膜的延伸與閉合、自噬體轉(zhuǎn)運(yùn)和降解[7]。

1.2.1自噬的誘導(dǎo)

植物SnRK1(Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 1)在能量供應(yīng)受限時(shí),可以協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以維持細(xì)胞的能量穩(wěn)態(tài)[8]。研究表明,擬南芥(Arabidopsisthaliana)SnRK1在TOR(Target of rapamycin)通路的上游激活自噬[9];生長(zhǎng)正常時(shí),TOR激酶復(fù)合體可磷酸化自噬相關(guān)蛋白Atg13(Autophagy related protein,Atg),高度磷酸化的Atg13與Atg1的結(jié)合能力下降,自噬被抑制;當(dāng)植物遭受脅迫時(shí),TOR激酶失活,去磷酸化的Atg13與Atg1結(jié)合能力增強(qiáng),激活A(yù)tg1激酶并使其自磷酸化,隨后Atg1-Atg13與Atg11、Atg101形成緊密的激酶復(fù)合體,從而啟動(dòng)自噬[10-12]。

1.2.2自噬前體的形成

自噬前體組裝位點(diǎn)(Phagophore assembly site,PAS)是自噬體最開(kāi)始組裝的位置[13-15]。Atg1/Atg13蛋白激酶復(fù)合體首先被募集到PAS,隨后結(jié)合PI3K復(fù)合體與Atg9復(fù)合體促進(jìn)自噬前體形成。

植物PI3K復(fù)合體由VPS(Vacuolar protein sorting)復(fù)合物Ⅰ(VPS34、VPS30/Atg6、VPS15、Atg14);VPS復(fù)合物Ⅱ(VPS34、VPS30/Atg6、VPS15、VPS38)組成[16-17]。VPS復(fù)合物Ⅰ由Atg14直接與VPS30互作被招募到起始膜上,通過(guò)磷酸化自噬前體產(chǎn)生PI3P富集吞噬細(xì)胞膜,作為PI3P結(jié)合效應(yīng)物招募的平臺(tái)招募下游自噬相關(guān)蛋白參與自噬體的組裝[18]。

Atg9復(fù)合體由Atg9、Atg2、Atg18組成。自噬發(fā)生時(shí),跨膜蛋白Atg9在Atg1-Atg13激酶復(fù)合體協(xié)助下將脂質(zhì)傳遞到PAS,與膜蛋白Atg2-Atg18復(fù)合物互作,輔助自噬前體膜的延伸[19-21]。

Atg13被認(rèn)為是起始復(fù)合物的樞紐。首先,Atg13作為激酶活性調(diào)節(jié)劑以Atg1為核心組成Atg1-Atg13復(fù)合物,并通過(guò)與Atg17相互作用連接Atg17-Atg31-Atg29二聚體,最終形成以Atg1為核心的五聚體,稱為Atg1激酶復(fù)合物。該復(fù)合物啟動(dòng)PAS的形成并作為支架蛋白將其他Atg蛋白陸續(xù)組裝到該位置。PAS的穩(wěn)定性亦依賴于Atg13、Atg17和其他蛋白的相互作用[22]。其次,Atg13通過(guò)與液泡蛋白Vac8相互作用將PAS穩(wěn)定地錨定在液泡上,PAS的穩(wěn)定定位是高效自噬的必要條件[23-25]。最后,Atg13又與Atg101通過(guò)HORMA(the Hop1p, Rev7p and MAD2 proteins)結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的空間構(gòu)象[26-27]。Atg101的C末端區(qū)域和WF finger分別在促進(jìn)自噬下游PI3K復(fù)合物和PI3P復(fù)合物的關(guān)鍵組分募集中起到關(guān)鍵作用[28]。

1.2.3自噬前體膜的延伸與閉合

自噬前體膜的延伸需要依靠Atg8-PE(Phosphatidylethanolamine,PE)和Atg12-Atg5。

Atg8-PE系統(tǒng)是自噬體膜的重要組成部分,直接作用于膜的延伸。Atg8在Atg4作用下與具有泛素活化酶E1活性的Atg7連接,最后在具有E2活性的Atg3催化下與PE結(jié)合形成Atg8-PE復(fù)合體[29-32]。這個(gè)過(guò)程稱為Atg8的脂化,脂化的效率依賴于Atg16的存在[33]。

Atg12-Atg5系統(tǒng)包括Atg12、Atg7、Atg10、Atg5、Atg16。Atg12首先與E1酶Atg7結(jié)合,二者結(jié)合后由具有泛素交聯(lián)酶E2活性的Atg10修飾轉(zhuǎn)移并與靶蛋白Atg5結(jié)合,形成Atg12-Atg5復(fù)合體。最后Atg12-Atg5與Atg16結(jié)合,促進(jìn)Atg5膜結(jié)合位點(diǎn)的暴露,進(jìn)而促進(jìn)復(fù)合物與膜結(jié)合。在自噬體形成早期,該復(fù)合物可以促進(jìn)Atg8與PE的脂化并決定Atg8在膜上脂化的位點(diǎn)[34-36]。Atg8的定位依賴于Atg12-Atg5-Atg16,但Atg12-Atg5-Atg16卻能在Atg8缺失的菌株中正常定位[37]。

Atg8-PE復(fù)合物不斷組裝在延伸中的自噬前體膜上,并通過(guò)Atg8家族相互作用基序招募一種植物特有的非Atg適配蛋白SH3P2(SH3 domain-containing protein 2)和其相互作用蛋白FREE1(FYVE domain protein required for endosomal sorting 1)來(lái)封閉囊泡[38-39]。自噬體與液泡融合后,附著在外膜上的Atg8被Atg4從PE上裂解并釋放回胞漿,內(nèi)膜上的Atg8-PE復(fù)合物則在液泡中被降解,Atg9從PAS返回胞質(zhì)中的膜結(jié)構(gòu)[32, 40]。

1.2.4自噬體轉(zhuǎn)運(yùn)和降解

成熟的自噬體通過(guò)微管被運(yùn)送到液泡,外膜與液泡膜融合,內(nèi)膜被釋放入液泡中。在這個(gè)過(guò)程中,Atg11促進(jìn)自噬體向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)[41]。CFS1作為自噬適配器存在于自噬體上,與Atg8作用介導(dǎo)自噬體的成熟與運(yùn)輸,且特異性的調(diào)節(jié)自噬流而不影響其他液泡通路或液泡形態(tài)[42]。融合過(guò)程中SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 復(fù)合體參與并介導(dǎo)[43]。最后,內(nèi)膜在脂酶Atg15的作用下被降解,待降解物被降解并釋放到細(xì)胞質(zhì)回收再利用,以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[44]。

2 細(xì)胞自噬參與植物逆境脅迫

自噬被認(rèn)為是一種基礎(chǔ)的防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制,對(duì)細(xì)胞的修復(fù)、重建和再生有促進(jìn)作用[45]。正常情況下,自噬僅作為一項(xiàng)基本的蛋白質(zhì)量調(diào)控機(jī)制而處于基礎(chǔ)水平。但當(dāng)植物受到特定信號(hào)刺激如營(yíng)養(yǎng)饑餓、溫度脅迫、滲透脅迫、病原體侵染時(shí),自噬被大量誘導(dǎo)以抵抗脅迫。

2.1 自噬參與低氮脅迫

對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō),氮素利用效率(Nitrogen use efficiency,NUE)主要取決于如何吸取無(wú)機(jī)氮,同化硝酸鹽和銨鹽,并循環(huán)有機(jī)氮。自噬在這些過(guò)程中的作用被自噬缺陷突變體所突出表現(xiàn),而相應(yīng)的自噬過(guò)表達(dá)植株則有更好的表現(xiàn)。

自噬通過(guò)參與植物無(wú)機(jī)氮的吸收與同化最終增強(qiáng)脅迫耐受性。蘋(píng)果(Maluspumila)過(guò)表達(dá)MdATG10可增強(qiáng)自噬活性,提高氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量和氮代謝酶活性以應(yīng)對(duì)低氮脅迫[46]。蘋(píng)果過(guò)表達(dá)MdATG9增強(qiáng)了愈傷組織對(duì)氮饑餓的耐受性,且MdNRT1.1、MdNRT2.5、MdNIA1和MdNIA2的表達(dá)量和氨基酸與蔗糖的含量均高于野生株系,表明MdATG9在蘋(píng)果應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)饑餓時(shí)起著重要作用[47]。蘋(píng)果MdATG8i和MdATG18a的過(guò)表達(dá)同樣提高植株在應(yīng)對(duì)氮饑餓時(shí)的耐受性[48-49]。對(duì)番茄(Solanumlycopersicum)自噬基因的研究表明,番茄葉片和根系的自噬受低氮脅迫誘導(dǎo),過(guò)表達(dá)ATG6可提高氮代謝相關(guān)酶活性,促進(jìn)氮吸收,提高氮同化效率和蛋白質(zhì)積累量[50]。水稻(Oryzasativa)過(guò)表達(dá)OsATG8a在氮充足情況下,氮素吸收效率和氮素利用效率均顯著提高,但在氮饑餓情況下僅氮素吸收效率具有顯著提高;OsATG8b基因在低氮情況下被高度誘導(dǎo),過(guò)表達(dá)OsATG8b可顯著提高氮代謝相關(guān)酶活性、氮素吸收效率,氮素利用效率和氮素再動(dòng)員效率;過(guò)表達(dá)OsATG8c在氮充足與氮饑餓情況下的氮素吸收效率和氮素利用效率均顯著提高,認(rèn)為自噬可提高水稻氮素利用率[51-53]。低氮脅迫下,茶(Camelliasinensis)CsATG3a在擬南芥中過(guò)表達(dá)延長(zhǎng)了擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期,促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)并影響氮的分配[54]。平邑甜茶(Malushupehensisvar.mengshanensis)中,通過(guò)適度抑制TOR活性來(lái)增強(qiáng)自噬活性,可以改善低氮脅迫下的生長(zhǎng)狀態(tài),增強(qiáng)對(duì)脅迫的耐受性[55]。

植物生殖生長(zhǎng)階段,氮素吸收能力下降,甚至部分情況下會(huì)被完全抑制,例如歐洲油菜(Brassicanapus)由營(yíng)養(yǎng)階段向生殖階段過(guò)渡,以高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和雙親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)活性的急劇下降為特征[56]。由于氮吸收活性的下降,植物需要另一種氮源。自噬通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和再動(dòng)員參與生殖階段種子的形成并調(diào)控植物衰老。水稻ATG7-1突變體與野生型相比,生物量和NUE明顯降低,葉片衰老過(guò)程中的氮素再動(dòng)員也受到抑制,同時(shí)突變體老葉中殘留的蛋白質(zhì)以可溶性蛋白質(zhì)為主,二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)酶的濃度約為野生型的 2.5 倍,認(rèn)為自噬通過(guò)促進(jìn)衰老葉片中的蛋白質(zhì)降解,從而在全株水平上促進(jìn)氮的高效再循環(huán)[57]。玉米(Zeamays)ATG12突變體幼苗在氮饑餓情況下生長(zhǎng)嚴(yán)重受損,植株成熟后葉片衰老加劇,穗部發(fā)育受阻,且氮素再動(dòng)員降低[58]。大豆(Glycinemax)GmATG8c在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高了細(xì)胞的氮饑餓耐受性,縮短營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期,更早進(jìn)入生殖生長(zhǎng),有更高的種子產(chǎn)量[59]。擬南芥實(shí)驗(yàn)表明,所有自噬缺陷突變體的氮素再動(dòng)員效率均降低且僅與營(yíng)養(yǎng)期葉片衰老程度有關(guān),認(rèn)為自噬是植物高效氮素再動(dòng)員和種子灌漿所必需的[60-61]。

以上針對(duì)不同植物的自噬相關(guān)基因的研究表明植物細(xì)胞自噬與氮素營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)。

2.2 自噬參與高溫脅迫

研究表明,高溫脅迫下植物細(xì)胞自噬相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá),自噬結(jié)構(gòu)大量形成[62]。高溫脅迫下,擬南芥ATG5和ATG7缺陷突變體的耐熱性降低,膜系統(tǒng)和光合系統(tǒng)較野生型受損嚴(yán)重[63]。在番茄中過(guò)表達(dá)蘋(píng)果MdATG5-1和MdATG5-2增強(qiáng)了膜系統(tǒng)穩(wěn)定性,減少活性氧積聚,增強(qiáng)對(duì)高溫脅迫的耐受性[64]。蘋(píng)果過(guò)表達(dá)MdATG18a植株在高溫脅迫下活性氧積累減少,氣孔收縮程度較小,有更好的散熱能力,認(rèn)為自噬通過(guò)降解受損葉綠體減少異常葉綠體產(chǎn)生的活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷增強(qiáng)了耐熱性[65]。番茄植株中,ATG5和ATG7被高溫誘導(dǎo)表達(dá),將其分別沉默后,植株耐高溫能力明顯下降,生物膜穩(wěn)定性下降,膜透性增加,光合系統(tǒng)受損嚴(yán)重,認(rèn)為自噬通過(guò)保護(hù)膜結(jié)構(gòu)和光合系統(tǒng)抵抗高溫帶來(lái)的損傷[62]。

另外,自噬會(huì)降解植株在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)的另一重保護(hù)措施——熱激蛋白(Heat shock protein,Hsp),導(dǎo)致植物在面對(duì)第二次高溫脅迫時(shí)反應(yīng)緩慢,相對(duì)于自噬突變體受損更重。擬南芥中選擇性自噬受體NBR1與Hsp 90.1 和Rof1互作并通過(guò)自噬介導(dǎo)其降解,導(dǎo)致面對(duì)二次熱脅迫野生型植株反應(yīng)緩慢,自噬缺陷植株反應(yīng)迅速[66]。擬南芥中ATG7突變能修復(fù)熱敏感基因突變體的耐熱性缺陷,認(rèn)為植物細(xì)胞自噬是植物耐熱的不利因素[67]。

綜上所述,自噬在植物面對(duì)高溫脅迫時(shí)具有兩面性,一方面通過(guò)保護(hù)膜結(jié)構(gòu)和光合系統(tǒng)等抵抗高溫脅迫;另一方面通過(guò)降解熱激蛋白使植物在面對(duì)二次高溫脅迫時(shí)避免產(chǎn)生更大損傷。

2.3 自噬參與滲透脅迫

細(xì)胞自噬在植物抵御滲透脅迫如干旱脅迫和鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。蘋(píng)果MdATG5-1和MdATG5-2基因在番茄中過(guò)表達(dá)時(shí),在干旱條件下比野生型有更高的葉片相對(duì)含水量,活性氧積累量、相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量則顯著低于野生型,認(rèn)為自噬有助于維持干旱脅迫下的細(xì)胞穩(wěn)態(tài),增加干旱抗性[64]。同樣的,蘋(píng)果過(guò)表達(dá)MdATG10在干旱條件下較野生型有更多的生物量積累,更高的凈光合速率和水分利用率,且長(zhǎng)期干旱脅迫下活性氧積累較少,生物膜系統(tǒng)受損程度較低,顯著增強(qiáng)了植株抗旱性; 另外,脫落酸的合成與信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)量均下降,認(rèn)為可能由此調(diào)節(jié)了氣孔開(kāi)度,幫助植株更好適應(yīng)長(zhǎng)期干旱[46]。蘋(píng)果MdATG8i過(guò)表達(dá)植株在鹽脅迫下Na+積累較少,葉片中脫落酸積累較少,氣孔開(kāi)度較野生型大,精氨酸和多胺含量均高于野生型,認(rèn)為MdATG8i可能通過(guò)影響多胺的代謝增強(qiáng)耐鹽性;MdATG10過(guò)表達(dá)植株光合系統(tǒng)受損較輕,根系導(dǎo)水率較高,并且離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因MdSOS1、MdSOS2和MdSOS3的表達(dá)量均高于野生型,Na+積累較少,認(rèn)為MdATG10通過(guò)影響離子轉(zhuǎn)運(yùn),增強(qiáng)植株耐鹽性[65]。黃瓜(Cucumissativus)CsATG8a和CsATG8f在擬南芥中過(guò)表達(dá)在鹽脅迫下比野生型的根長(zhǎng)和鮮重更高,相對(duì)電導(dǎo)率較低;在黃瓜中過(guò)表達(dá)時(shí)在干旱與鹽脅迫下的抗氧化酶活性均顯著高于野生型,認(rèn)為植株在應(yīng)對(duì)滲透脅迫時(shí),通過(guò)自噬減少脅迫帶來(lái)的傷害[68]。

綜上所述,過(guò)表達(dá)自噬相關(guān)基因可增強(qiáng)植株對(duì)膜系統(tǒng)、光合系統(tǒng)以及水分的利用,減少脅迫損傷并提高耐受性。

2.4 自噬參與病原體侵染

植物在遭受病原體侵染時(shí)自噬被誘導(dǎo)以抵抗侵染。陸地棉(Gossypiumhirsutum)曲葉病毒的βC1蛋白通過(guò)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)結(jié)合破壞GAPDH與Atg3的相互作用來(lái)激活自噬,而βC1與GAPDH結(jié)合被破壞將減少病毒誘導(dǎo)的自噬并增強(qiáng)病毒感染,認(rèn)為植物在應(yīng)對(duì)病毒侵染時(shí)通過(guò)自噬途徑抵抗侵染[69]。本氏煙草(Nicotianabenthamiana)中植物蛋白NbP3IP與水稻條紋病毒編碼的RNA沉默抑制蛋白p3互作,并通過(guò)自噬途徑降解p3,影響p3的沉默抑制活性,ATG5或ATG7被沉默的植株中,水稻條紋病毒感染加劇,而GAPDH沉默的植株中,自噬被激活,病毒感染受到抑制,認(rèn)為自噬參與抑制水稻條紋病毒的感染[70]。

在宿主植物與病原體互作的過(guò)程中,病原體可以反過(guò)來(lái)通過(guò)自噬途徑侵染宿主植物。核盤(pán)菌可分泌植物毒素草酸觸發(fā)宿主無(wú)限制細(xì)胞死亡以便侵染宿主,而草酸缺陷突變體具有非致病性,能夠激活自噬,觸發(fā)宿主限制性細(xì)胞死亡,抵御病原體侵染[71]。同樣,大麥(Hordeumvulgare)條紋花葉病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)的γ-b蛋白通過(guò)與Atg7直接相互作用破壞Atg7-Atg8的相互作用抑制宿主植物自噬,破壞自噬介導(dǎo)的植物抗病毒防御,從而促進(jìn)感染[72]。蘋(píng)果中MdAtg8i通過(guò)與靶蛋白MdEF-Tu互作,降低蘋(píng)果對(duì)腐爛病菌敏感性;腐爛病菌效應(yīng)蛋白Vm1G-1794通過(guò)與MdAtg8i互作抑制細(xì)胞自噬活性,并競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MdAtg8i,使MdEF-Tu積累以削弱對(duì)腐爛病菌抗性,過(guò)表達(dá)MdATG8i時(shí)對(duì)腐爛病菌抗性有顯著提高,認(rèn)為蘋(píng)果腐爛病菌通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白操縱蘋(píng)果細(xì)胞自噬途徑[73]。

綜上所述,自噬在植物應(yīng)對(duì)病原體侵染過(guò)程中發(fā)揮雙重作用,一方面自噬抑制部分病原體感染;另一方面部分自噬相關(guān)蛋白可能作為病原體效應(yīng)物的靶標(biāo),被病原體利用侵染宿主植物。

3 總結(jié)與展望

自噬作為一種進(jìn)化上保守的胞內(nèi)物質(zhì)降解途徑,廣泛參與個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程與脅迫應(yīng)激反應(yīng)。近年來(lái)對(duì)自噬的研究不斷深入,但仍有很多問(wèn)題需要研究。例如,自噬體膜的來(lái)源、植物細(xì)胞自噬響應(yīng)逆境的機(jī)理、細(xì)胞自噬的活性在什么范圍內(nèi)能維持個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育與應(yīng)對(duì)脅迫之間的平衡、自噬如何協(xié)調(diào)植物激素共同抵抗逆境等。要解決這些問(wèn)題需要進(jìn)一步研究自噬基因的功能與核心組分的作用機(jī)制,隨著科技的不斷發(fā)展,自噬的分子機(jī)制將得到更深入的研究。