張淑紅,張運(yùn)峰,武秋穎,高鳳菊,李亞子,紀(jì)景欣,許 可,范永山

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系,唐山市農(nóng)業(yè)病原真菌與毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 唐山 063000)

醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物的肝臟、植物組織及微生物細(xì)胞中,是生物體內(nèi)重要的氧化還原催化劑之一,其為具有廣泛專一性的含鋅金屬酶,以NAD+為輔酶,參與糖酵解末端反應(yīng)[1]。在各種代謝物的生物合成過程中,ADH催化醇和醛或酮之間的相互轉(zhuǎn)化,并且在酒精、烷烴、糖、脂質(zhì)代謝以及外源性酒精和醛類防御方面都有著極其重要的作用[2-5]。

ADH具有廣泛的底物特異性。在人和哺乳動(dòng)物體內(nèi),ADH是乙醇代謝的關(guān)鍵酶,在酒精性肝損傷的診斷、治療和解酒藥物研究中發(fā)揮重要作用[6-8]。在植物組織中,ADH是無氧呼吸時(shí)能量生成和NAD+再生的關(guān)鍵酶[9]。來源于微生物的ADH結(jié)構(gòu)差異較大,有的為二聚體,有的為四聚體,單體的折疊結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物相似,主要區(qū)別是活性位點(diǎn)與鋅離子的協(xié)調(diào)作用不同[10]。酵母ADH是145 ku 的四聚體,每條單體結(jié)合1個(gè) NAD+和1個(gè) Zn2+。酵母ADH主要有3種依賴Zn2+的同工酶——厭氧表達(dá)的YADH1、細(xì)胞質(zhì)組成成分YADH2 和線粒體中的YADH3,其中YADH1是酵母ADH活性的主要部分[11]。

ADH參與植物病原真菌致病性的研究較少。有報(bào)道[12]指出,灰霉菌(Botrytiscinerea)BcADH1、BcADH2和BcADH3等3個(gè)ADH基因在病菌侵染寄主早期轉(zhuǎn)錄水平急劇提升,參與調(diào)控該菌的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境適應(yīng)和致病過程,是必不可少的致病相關(guān)因子。玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)是威脅玉米生產(chǎn)的一種重要病原真菌,ADH基因在病菌侵染過程中的功能尚未明確。本文在玉米大斑病菌ADH基因(StADH)家族的鑒定和生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析它們?cè)诓【秩具^程中的表達(dá)規(guī)律,為明確ADH基因在致病過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

利用乙醇脫氫酶(ADH)的EC.1.1.1.1檢索玉米大斑病菌Et28A菌株基因組的KEGG數(shù)據(jù)庫(https://mycocosm.jgi.doe.gov/Settu1/Settu1.home.html),獲得玉米大斑病菌ADH家族成員的基因和蛋白質(zhì)序列,利用在線分析工具M(jìn)G2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1)進(jìn)行染色體定位,利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)進(jìn)行理化性質(zhì)分析,利用WOLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)進(jìn)行亞細(xì)胞定位,利用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,利用MEME(https://meme-suite.org/meme)進(jìn)行保守基序分析。

通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)獲得釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ADH氨基酸序列,利用MEGA7.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹?；诒菊n題組已有的玉米大斑病菌接種抗病自交系B73Ht1(R)和感病自交系B73(S)玉米葉片3、5、7、10 d后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參,獲得各基因的相對(duì)表達(dá)量,利用TBtools[13]和GraphPad prism軟件(GraphPad Software, San Diego, California USA, www.graphpad.com)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌ADH基因家族的染色體定位

利用玉米大斑病菌基因組的KEGG數(shù)據(jù)庫共獲得22個(gè)ADH基因家族成員,按照基因定位分別命名為StADH1-StADH22(圖1)?；蚨ㄎ唤Y(jié)果表明,22個(gè)StADH家族成員分布在12條scaffold上,其中以scaffold2最多,分布有6個(gè)基因。而其他395條scaffold上未發(fā)現(xiàn)有玉米大斑病菌ADH基因家族成員分布。

圖1 玉米大斑病菌ADH基因染色體定位Fig.1 Chromosome locations of ADH genes in Setosphaeria turcica

2.2 玉米大斑病菌ADH基因家族成員的序列及理化性質(zhì)分析

22個(gè)StADH基因長(zhǎng)度變化較大,CDS序列全長(zhǎng)696～1 485 bp,編碼232～495個(gè)氨基酸殘基,分子量31 538.78～53 590.22,理論等電點(diǎn)5.65～9.22。除了StADH5、StADH15、StADH18和StADH22顯堿性外,其他18個(gè)ADH基因編碼蛋白均為酸性。疏水性平均值顯示,StADH6、StADH9、StADH11、StADH15、StADH17及 StADH21呈現(xiàn)疏水性,其他16個(gè)基因家族成員編碼蛋白均顯示親水性。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,StADH7、 StADH15、StADH20和StADH21定位于線粒體,StADH4、StADH22定位于過氧化物酶體,其余家族成員均定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 玉米大斑病菌ADH蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹及結(jié)構(gòu)分析

利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)獲得釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)7個(gè)ADH基因家族成員(YADH1-YADH7),與玉米大斑病菌22個(gè)ADH基因家族成員(StADH1-StADH22)共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,利用InterPro和MEME分析其保守結(jié)構(gòu)域和保守基序(圖2)。結(jié)果表明,玉米大斑病菌ADH家族蛋白分為6類:第Ⅰ類包含StADH2、StADH4、StADH7、StADH10、StADH12-13、StADH19-20等8種,與酵母YADH4親緣關(guān)系較近,其結(jié)構(gòu)中含有0～2個(gè)保守基序,其中StADH4和StADH13分別含有乙醇脫氫酶的保守結(jié)構(gòu)域ADH_N和ADH_zinc_N[9,14],StADH2和StADH12含有保守結(jié)構(gòu)域Aldo_ket_red,屬于醛酮還原酶家族[15-16],其余6個(gè)基因與YADH4具有相同的保守結(jié)構(gòu)域Fe-ADH,屬于含鐵醇脫氫酶家族[17];第Ⅱ類包括StADH1、StADH5、StADH9、StADH14、StADH16、StADH22等6種,含有2～4個(gè)保守基序,僅StADH22的結(jié)構(gòu)域?yàn)锳DH_zinc_N,其余均為ADH_N;第Ⅲ類為StADH3和StADH8,分別含有4、5個(gè)保守基序,均含有ADH_zinc_N結(jié)構(gòu)域序列;第Ⅳ類為StADH21和StADH6,與YADH1、YADH2、YADH3、YADH5親緣關(guān)系較近,其中StADH6與YADH均含有5個(gè)保守基序,典型結(jié)構(gòu)域?yàn)锳DH_N,而StADH21不含Motif3,結(jié)構(gòu)域?yàn)锳DH_zinc_N;第Ⅴ類為StADH11、StADH17和StADH18,均含有5個(gè)保守基序,典型結(jié)構(gòu)域?yàn)锳DH_zinc_N;第Ⅵ類為StADH15,與YADH6、YADH7親緣關(guān)系較近,都含有5個(gè)保守基序,結(jié)構(gòu)域組成也相同,均為ADH_N。

圖2 玉米大斑病菌ADH的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the ADH of Setosphaeria turcica

2.4 玉米大斑病菌ADH基因在病菌侵染過程中的表達(dá)分析

分析玉米大斑病菌ADH基因接種到抗病自交系B73Ht1(R)和感病自交系B73(S)玉米葉片3、5、7、10 d的表達(dá)規(guī)律,結(jié)果如圖3所示,StADH1基因平均相對(duì)表達(dá)量最高,為1.98;其次為StSDH6和StADH12,基因平均相對(duì)表達(dá)量分別為1.69和1.60;StADH4的相對(duì)表達(dá)量中等,為1.02;其余18個(gè)StADH的相對(duì)表達(dá)量較低,在0.01～0.67。因此,StADH1、StADH4、StADH6和StADH12在病菌侵染過程中可能發(fā)揮著較重要的作用。

圖3 玉米大斑病菌ADH基因在接種后不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.3 Analysis of the relative expression of ADH gene in Setosphaeria turcica at different time after inoculation

分析StADH1、StADH4、StADH6和StADH12在病菌侵染后的表達(dá)規(guī)律(圖4-A、B),發(fā)現(xiàn)接種玉米葉片3、5、7、10 d后,StADH6的表達(dá)量比較穩(wěn)定,接種期間差異不顯著;StADH1、StADH4和StADH12在接種3、5、7 d 時(shí)表達(dá)量很低,10 d 時(shí)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05),其中StADH1和StADH4差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。比較接種抗病玉米(R)和感病玉米(S)10 d時(shí)的基因表達(dá)差異(圖4-C),結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種感病玉米StADH1基因的表達(dá)量顯著高于接種抗病玉米(P<0.05),StADH4、StADH6和StADH12則差異不顯著。

A,接種抗病自交系(R);B,接種感病自交系(S);C,接種10 d的基因表達(dá)差異;*表示差異顯著(P<0.05)。A,Inoculated disease-resistant inbred line (R); B,Inoculated susceptible inbred line (S); C,Difference of gene expression after 10 days of inoculation; * Indicating the significant difference(P<0.05).圖4 玉米大斑病菌ADH基因家庭成員在病菌侵染后的表達(dá)規(guī)律Fig.4 Expression of family members of ADH gene in Setosphaeria turcica after infection

以上研究表明,StADH1、StADH4、StADH12在病菌接種10 d時(shí)發(fā)揮重要作用,是關(guān)鍵StADH基因,它們主要在病害侵染后期起作用,其中StADH1還可能與病菌的致病特異性有關(guān)。

2.5 玉米大斑病菌ADH基因家族關(guān)鍵基因的功能分析

NCBI CDD分析結(jié)果顯示,StADH1、StADH4及StADH6均包含MDR superfamily(依賴鋅/中鏈醇脫氫酶超家族)(圖5)。StADH1的典型結(jié)構(gòu)域FDH_like_1為谷胱甘肽依賴性甲醛脫氫酶,由Motif1和Motif3組成(圖2),FDH可將甲醛和NAD(P)轉(zhuǎn)化為甲酸和NAD(P)H。StADH4的典型結(jié)構(gòu)域enoyl_reductase_like為類烯酰還原酶,由Motif2組成(圖2),催化脂肪酸合成中反式烯酰載體蛋白/輔酶A(ACP/CoA)依賴于NADPH轉(zhuǎn)化為酰基(ACP/CoA)。此活性在熱帶假絲酵母中被認(rèn)為是維持線粒體呼吸功能所必需的。StADH6的結(jié)構(gòu)域CAD3為肉桂醇脫氫酶,由Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5組成(圖2),其主要功能是依賴NAD(P)(H)催化醇和醛或酮之間的相互轉(zhuǎn)化。StADH12的結(jié)構(gòu)與其他3個(gè)StADH不同,在分子中沒有發(fā)現(xiàn)保守基序,其結(jié)構(gòu)域?yàn)锳KR_AKR1-5-like,是一類可溶性NAD (P)(H)氧化還原酶,屬于AKR_SF superfamily(圖5),其主要功能是將醛和酮還原為仲醇。

圖5 玉米大斑病菌ADH基因家族關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Domain analysis of key genes of ADH gene family in Setosphaeria turcica

3 討論

目前,在微生物、動(dòng)物、植物細(xì)胞中都存在醇脫氫酶,且在微生物中最廣泛[18]。醇脫氫酶(ADH)是生物體內(nèi)重要的醇類代謝酶,具有廣泛的基因多態(tài)性。釀酒酵母有7個(gè)ADH編碼基因(YADH1-YADH7)。YADH1是催化乙醛生成乙醇的關(guān)鍵酶[19],將NADH再生為NAD+,當(dāng)以葡萄糖為發(fā)酵底物時(shí),該基因組成型表達(dá),以非葡萄糖如乙醇、甘油為唯一碳源時(shí),YADH1基因表達(dá)受抑制。YADH2催化乙醇生成乙醛,高濃度葡萄糖抑制其基因表達(dá),主要參與 NADH 氧化還原平衡,氨基酸代謝和雜醇類的生成[20]。YADH3存在于線粒體基質(zhì)中,表達(dá)受葡萄糖阻遏抑制,主要功能是維持線粒體內(nèi)氧化還原平衡和參與乙酸-乙醛還原穿梭途徑[21]。YADH4在葡萄糖發(fā)酵過程中將乙醛降解為乙醇,當(dāng)鋅含量受到限制時(shí),可能會(huì)結(jié)合鐵,為依賴Fe2+的乙醇脫氫酶[22]。YADH5催化乙醇生成乙醛,可在細(xì)胞核內(nèi)起作用[23]。YADH6和YADH7的輔酶都為NADP+。在玉米大斑病菌基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)的22個(gè)ADH家族成員中,與酵母聚到相同類群的有11個(gè)基因,其中StADH4、StADH12等8個(gè)基因與YADH4聚到同一類群,StADH6和StADH21與YADH1、YADH2、YADH3、YADH5聚到同一類群,StADH15與YADH6、YADH7聚到同一類群。另外11個(gè)玉米大斑病菌ADH家族成員又分為3類,其中StADH1等6個(gè)基因?yàn)橥活惾?StADH3、StADH8及StADH11、StADH17、StADH18分別聚為同一類群。以上研究表明,玉米大斑病菌存在與酵母不同的ADH家族成員。

在玉米大斑病菌ADH家族成員中,僅有StADH1、StADH4、StADH6和StADH12在病菌侵染過程中起主要作用。其中StADH6在侵染過程中表達(dá)量穩(wěn)定,可能為組成型表達(dá);StADH1、StADH4、StADH12在接種10 d時(shí)表達(dá)量均顯著增高,表明它們可能在糖酵解無氧氧化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,對(duì)于病菌侵入寄主體內(nèi)后期的生存非常重要。StADH4和StADH12在接種抗病品種和感病品種間表達(dá)量差異不顯著,因此與寄主?；詿o關(guān),而StADH1接種感病品種的表達(dá)量顯著高于接種抗病品種,說明該基因是玉米大斑病菌的重要致病基因,由于其含有FDH_like_1結(jié)構(gòu)域,可通過催化產(chǎn)生甲醛或甲酸破壞寄主細(xì)胞,在病菌的成功侵染、定殖和病害發(fā)生過程中都可發(fā)揮非常重要的作用。