王 倩 張立媛 許 月 李 海 劉少雄 薛亞鵬 陸 平 王瑞云 劉敏軒,*

研究簡(jiǎn)報(bào)

黍稷高基元EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及200份核心種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

王 倩1,2張立媛3許 月4李 海5劉少雄2薛亞鵬1,2陸 平2王瑞云1,*劉敏軒2,*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山西太谷 030801;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;3赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究所, 內(nèi)蒙古赤峰 024031;4吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 吉林長(zhǎng)春 130012;5山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所, 山西大同 037008

為搞清黍稷核心種質(zhì)資源的遺傳背景, 開(kāi)發(fā)新的高基元EST-SSR標(biāo)記用以評(píng)估國(guó)內(nèi)不同生態(tài)區(qū)資源的遺傳多樣性, 為加快黍稷育種進(jìn)程和挖掘優(yōu)異種質(zhì)提供依據(jù)。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了200個(gè)高基元EST-SSR標(biāo)記并進(jìn)行多態(tài)性篩選, 利用篩選到的多態(tài)性標(biāo)記評(píng)價(jià)200份黍稷核心種質(zhì)資源的遺傳多樣性。結(jié)果表明, 200個(gè)標(biāo)記在6份地理來(lái)源差異顯著的黍稷材料中有52個(gè)呈多態(tài)性, 開(kāi)發(fā)效率為26%, 其中四、五和六堿基重復(fù)多態(tài)性標(biāo)記分別為17個(gè)(32.7%)、17個(gè)(32.7%)和18個(gè)(34.6%)。利用52個(gè)高基元EST-SSR多態(tài)性標(biāo)記對(duì)200份核心資源進(jìn)行檢測(cè), 共得到129個(gè)觀測(cè)等位變異, 每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到2～3個(gè); Shannon多樣性指數(shù)為0.3093～1.0910, 平均為0.7277; 多態(tài)性信息含量為0.1948～0.8211, 平均為0.5104?；赨PGMA將200份資源劃分為6個(gè)群組。基于Structure的遺傳結(jié)構(gòu)(=7)將資源劃分為7個(gè)類(lèi)群, 黍稷資源主要來(lái)自4個(gè)(東北地區(qū)、華北地區(qū)、黃土高原和北方地區(qū))基因庫(kù)?；谥鞒煞址治鰧⒉牧暇蹫?個(gè)類(lèi)群, 與其地理來(lái)源一致。構(gòu)建了52個(gè)四–六堿基重復(fù)EST-SSR標(biāo)記, 開(kāi)發(fā)率為26%; 用其分析材料的遺傳差異發(fā)現(xiàn)黍稷地方核心種質(zhì)遺傳多樣性較為豐富。

黍稷; 核心種質(zhì); 高基元EST-SSR; 遺傳多樣性; 群體結(jié)構(gòu)

黍稷(L.), 又叫糜子、糜黍和粢, 是起源于中國(guó)的一年生暖季型作物, 栽培歷史超過(guò)10,000年[1-3]。黍稷生長(zhǎng)周期短, 具有耐旱、耐瘠、耐鹽堿和水資源利用效率高的特性, 適應(yīng)不良環(huán)境的能力強(qiáng), 在世界范圍內(nèi)廣泛種植[4-6]。黍稷富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素和微量元素, 包括銅、鋅、鐵、錳[7], 其籽粒中的必需氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸)含量高于小麥[8]。黍稷脫殼后稱(chēng)黃米, 可制作粘糕、釀制黃酒。目前中國(guó)保存黍稷資源9800余份[9], 對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性研究, 有助于探究其起源與進(jìn)化關(guān)系, 同時(shí)為良種選育、資源保護(hù)等提供材料基礎(chǔ)。

評(píng)估種質(zhì)資源遺傳多樣性可以通過(guò)表型性狀或者分子標(biāo)記等方法[10]。表型性狀具有不穩(wěn)定性, 容易受到外界環(huán)境的影響, 從而導(dǎo)致評(píng)價(jià)結(jié)果不準(zhǔn)確[11]; 而分子標(biāo)記技術(shù)是從DNA水平上揭示遺傳變異, 受外界環(huán)境影響小, 結(jié)果穩(wěn)定可靠[12]。目前廣泛應(yīng)用于黍稷遺傳差異分析的分子標(biāo)記有SSR。根據(jù)SSR的來(lái)源可將其分為基因組SSR和EST-SSR (表達(dá)序列標(biāo)簽, expressed sequence tag, EST) 2個(gè)類(lèi)型[13]?；蚪MSSR已廣泛用于黍稷遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域[1,6,14-15]。連帥等[16]用63個(gè)基因組SSR分析國(guó)內(nèi)外192份黍稷地方品種和野生種質(zhì)遺傳多樣性, 檢測(cè)出161個(gè)等位變異, 發(fā)現(xiàn)不同地理來(lái)源群體間表現(xiàn)出顯著的遺傳多樣性差異, 其中內(nèi)蒙地區(qū)、東北地區(qū)和黃土高原地區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性最豐富。Liu等[1]用67個(gè)基因組SSR分析88份黍稷種質(zhì), 檢測(cè)到179個(gè)等位基因, 多態(tài)性信息含量平均值為0.376, 不同生態(tài)區(qū)內(nèi)遺傳變異豐富, 而且不同群體間遺傳關(guān)系復(fù)雜。薛延桃等[17]用103個(gè)基因組SSR評(píng)估216份甘肅和新疆黍稷種質(zhì), 共檢測(cè)到299個(gè)等位基因, 發(fā)現(xiàn)甘肅資源遺傳多樣性較高。EST-SSR (表達(dá)序列標(biāo)簽, expressed sequence tag, EST)標(biāo)記是基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)得出的, 具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、信息量大等特點(diǎn)[18]。目前, 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘了大量的黍稷EST-SSR標(biāo)記。劉笑瑜等[19]從一個(gè)抗旱和抗鹽品種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中開(kāi)發(fā)了151個(gè)高基元SSR標(biāo)記, 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)85個(gè)標(biāo)記具有多態(tài)性(四、五和六堿基重復(fù)標(biāo)記分別為71個(gè)、10個(gè)和4個(gè)), 開(kāi)發(fā)效率為56.29%。王璐琳等[20]根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期黍稷轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)了70個(gè)三堿基重復(fù)SSR標(biāo)記, 篩選出17個(gè)多態(tài)性標(biāo)記, 開(kāi)發(fā)效率為25.37%。Jiang等[21]從雁黍5號(hào)中發(fā)掘了8139個(gè)EST-SSR, 隨機(jī)驗(yàn)證24個(gè)標(biāo)記發(fā)現(xiàn), 3個(gè)具有多態(tài)性, 開(kāi)發(fā)效率為12.5%。陳小紅等[22]基于黃糜子和鎮(zhèn)原大糜子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果構(gòu)建了200個(gè)低基元SSR, 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)80個(gè)標(biāo)記具有多態(tài)性(一、二和三堿基重復(fù)SSR標(biāo)記分別為10個(gè)、15個(gè)和55個(gè)), 開(kāi)發(fā)效率為40%。高基元SSR引物分辨率高, 對(duì)不同基因型分辨力強(qiáng), 可以檢測(cè)到低基元SSR擴(kuò)增不出的變異[19]。何杰麗等[23]用80個(gè)低基元EST-SSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外的144份黍稷種質(zhì)進(jìn)行遺傳差異評(píng)估, 檢測(cè)到206個(gè)等位變異, PIC平均值為0.4573, 基于主成分分析將材料分為7個(gè)類(lèi)群, 該結(jié)果與材料的地理來(lái)源一致。王舒婷等[24]用27個(gè)高基元SSR擴(kuò)增57份山西黍稷種質(zhì), 檢測(cè)到71個(gè)等位變異, 發(fā)現(xiàn)山西省黍稷資源的遺傳多樣性豐富。王瑞云等[25]用85個(gè)高基元SSR評(píng)估國(guó)內(nèi)6個(gè)生態(tài)栽培區(qū)的96份黍稷資源, 檢測(cè)到232個(gè)等位變異, 基于UPGMA和遺傳結(jié)構(gòu)均將材料劃分為4個(gè)類(lèi)群。陳小紅等[26]用30個(gè)高基元SSR標(biāo)記評(píng)估國(guó)內(nèi)4個(gè)生態(tài)栽培區(qū)的133份種質(zhì), 檢測(cè)到90個(gè)等位變異, 基于UPGMA將試材聚為3個(gè)類(lèi)群, 主成分分析將材料劃歸4類(lèi)。

核心種質(zhì)是以較小的種質(zhì)資源最大限度地代表整個(gè)種質(zhì)資源的遺傳多樣性, 因此對(duì)于核心種質(zhì)遺傳多樣性的評(píng)估極為重要[27]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 分子標(biāo)記在核心種質(zhì)遺傳多樣性檢測(cè)方面應(yīng)用也較為廣泛。姜俊燁等[27]用24個(gè)SSR分析了國(guó)內(nèi)外1075份蠶豆核心種質(zhì)的遺傳多樣性。車(chē)卓等[28]用13個(gè)SRAP標(biāo)記分析了100份黑芝麻核心種質(zhì)遺傳多樣性。徐彥剛等[29]用45個(gè)SSR對(duì)不同來(lái)源的78份西瓜核心種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。種質(zhì)資源是創(chuàng)造新性狀、培育新品種的材料基礎(chǔ), 課題組前期構(gòu)建了516份國(guó)內(nèi)外黍稷核心種質(zhì), 含有國(guó)內(nèi)外地方品種、育成品種和野生材料, 從中篩選出來(lái)自18個(gè)省份的200份具有代表性的優(yōu)良性狀的黍稷地方核心資源, 以促進(jìn)黍稷種質(zhì)資源的進(jìn)一步鑒定和有效利用。

黍稷雖然是一種小宗作物, 但其栽培歷史悠久、種質(zhì)資源豐富, 且目前已完成了全基因組測(cè)序工作[30-31], 并廣泛開(kāi)發(fā)了SSR等分子標(biāo)記, 從分子水平開(kāi)展了較多遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究。但所用遺傳標(biāo)記多為低基元SSR, 對(duì)研究材料的基因型分辨能力不足, 而開(kāi)發(fā)適用于黍稷研究的高基元多態(tài)性SSR標(biāo)記并利用其進(jìn)行遺傳多樣性分析的相關(guān)研究較少。課題組前期對(duì)抗旱和干旱敏感品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)存在大量高基元EST-SSR標(biāo)記, 其中五、六堿基重復(fù)標(biāo)記較多, 因此, 本研究開(kāi)發(fā)了200個(gè)新的高基元SSR標(biāo)記。并且前期構(gòu)建了一批黍稷核心種質(zhì)資源, 可以大大提高黍稷種質(zhì)資源利用效率?；诖? 本研究擬首先利用6份地理來(lái)源差異顯著的材料對(duì)本試驗(yàn)開(kāi)發(fā)的200個(gè)高基元SSR標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性初篩, 隨后利用篩選到的高基元SSR標(biāo)記對(duì)構(gòu)建的200份黍稷核心種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析, 為鑒定黍稷優(yōu)異種質(zhì)、育種親本選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所資源中心小宗作物創(chuàng)新組所構(gòu)建的黍稷地方品種核心種質(zhì)200份, 來(lái)源于國(guó)內(nèi)6個(gè)生態(tài)栽培區(qū)(表1和附表1)。

表1 參試黍稷資源的生態(tài)區(qū)分布

其他糜子區(qū): 南方秋冬糜子區(qū)和青藏高原春糜子區(qū)。

Other sowing ecotope: the Southern autumn & winter-sowing ecotope and the Qinghai-Tibet plateau spring-sowing ecotope.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè) 選取15 d左右的幼葉, 用DNA提取試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司)提取全基因組DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量, 用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。調(diào)試其終濃度至30～60 ng μL–1, 保存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 EST-SSR標(biāo)記分析 用地理來(lái)源差異較大的6份材料(表2)對(duì)前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的200對(duì)高基元EST-SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選, 其中52對(duì)引物(附表2, 由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成)的擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性穩(wěn)定, 可用于下一步評(píng)估200份黍稷核心種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

表2 用于篩選EST-SSR引物的黍稷材料

在MY-CYCLER PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括PCR Master Mix (北京擎科生物技術(shù)有限公司) 10 μL、正向引物和反向引物各0.8 μL、基因組DNA 1 μL和ddH2O 7.4 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 5 min; 98℃ 10 s,m值10 s, 72℃ 15 s, 36個(gè)循環(huán); 72℃ 2 min, 4℃保存。用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物, 硝酸銀染色檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

讀取電泳結(jié)果, 同一位置有擴(kuò)增條帶的記為1, 否則記為0。用PopGen 1.32計(jì)算每對(duì)引物的遺傳多樣性參數(shù), 包括觀測(cè)等位基因()、有效等位基因()、Shannon多樣性指數(shù)()等。用PowerMarker 3.25計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)和遺傳距離。用MEGA 6.06構(gòu)建聚類(lèi)圖。分別用NTSYSpc 2.11和Structure 2.3.4進(jìn)行主成分和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高基元EST-SSR引物篩選

利用6份地理來(lái)源差異顯著的黍稷對(duì)200個(gè)高基元EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增發(fā)現(xiàn), 14對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增條帶, 186對(duì)引物有擴(kuò)增條帶, 其中52對(duì)在6份材料間呈多態(tài)性,開(kāi)發(fā)效率為26%。52對(duì)多態(tài)性引物中四、五和六堿基重復(fù)引物分別有17對(duì)(32.7%)、17對(duì)(32.7%)和18對(duì)(34.6%)。

2.2 基于52對(duì)高基元EST-SSR標(biāo)記的200份黍稷資源遺傳多樣性分析

利用52對(duì)高基元EST-SSR引物評(píng)估200份黍稷核心種質(zhì)資源的遺傳多樣性(附表3)發(fā)現(xiàn), 52個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)出129個(gè)觀測(cè)等位變異, 每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到2～3個(gè), 平均為2.4804個(gè); 有效等位變異變化范圍為1.1893 (BMGJY80)～ 2.9565 (BMGJY141), 平均為1.9729; Shannon多樣性指數(shù)為0.3093 (BMGJY155)～1.0910 (BMGJY141), 平均為0.7277; 觀測(cè)雜合度為0 (BMGJY5、BMGJY12和BMGJY19等)～0.9282 (BMGJY177), 平均為0.2695; 期望雜合度為0.1597 (BMGJY80)～0.6636 (BMGJY141), 平均為0.4609; Nei’s期望雜合度為0.1592 (BMGJY80)～0.6618 (BMGJY141), 平均為0.4593; 多態(tài)性信息含量為0.1948 (BMGJY86)～0.8211 (BMGJY46), 平均為0.5104。

2.3 不同生態(tài)區(qū)黍稷資源的遺傳多樣性和相似性分析

分析不同生態(tài)區(qū)黍稷資源的遺傳多樣性參數(shù)(表3)發(fā)現(xiàn), 各生態(tài)區(qū)觀測(cè)等位基因變化范圍為2.1346～2.4808, 最高的是北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū), 最低的是其他糜子區(qū)。有效等位基因變化范圍為1.7636～1.9570, 最高的是東北春糜子區(qū), 最低的是華北夏糜子區(qū)。從Nei’s基因雜合度分析, 觀測(cè)雜合度最高的是黃土高原春夏糜子區(qū)(0.2803), 最低的是華北夏糜子區(qū)(0.2272)。期望雜合度最高的是東北春糜子區(qū)(0.4558), 最低的是華北夏糜子區(qū)(0.3715)。就Shannon多樣性指數(shù)和PIC值而言, 黃土高原春夏糜子區(qū)材料最高, 其他糜子區(qū)材料最低, 說(shuō)明前者遺傳多樣性比較豐富。

分析不同生態(tài)區(qū)黍稷資源的遺傳距離與遺傳一致度參數(shù)(表4)發(fā)現(xiàn), 遺傳距離變化范圍為0.0177～0.1238, 平均值為0.0670; 遺傳一致度變化范圍為0.8835～0.9824, 平均值為0.9357。北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)間的遺傳距離最小(0.0177), 遺傳一致度最高(0.9824), 東北春糜子區(qū)和其他糜子區(qū)間的遺傳距離最大(0.1238), 遺傳一致度最低(0.8835)。由此表明地理位置越近, 遺傳距離越小, 遺傳相似性越高, 親緣關(guān)系越近; 地理位置越遠(yuǎn), 遺傳距離越大, 遺傳相似性越低, 親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。

2.4 基于UPGMA的黍稷資源聚類(lèi)分析

基于UPGMA對(duì)200份黍稷核心種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖1)發(fā)現(xiàn), 200份黍稷核心種質(zhì)分為6個(gè)組群(表5)。組群I有6份材料, 主要來(lái)自青海, 屬于黃土高原春夏糜子區(qū)。組群II有8份材料, 主要來(lái)自新疆, 屬于西北春夏糜子區(qū)。組群III有18份, 主要來(lái)自?xún)?nèi)蒙古, 屬于北方春糜子區(qū)。組群IV有33份, 主要來(lái)自甘肅, 屬于黃土高原春夏糜子區(qū)。組群V有112份, 主要來(lái)自山西, 屬于北方春糜子區(qū)。組群VI有23份, 主要來(lái)自山東, 屬于華北夏糜子區(qū)。

表3 6個(gè)生態(tài)區(qū)黍稷的遺傳多樣性參數(shù)

其他糜子區(qū): 南方秋冬糜子區(qū)和青藏高原春糜子區(qū)。

Other sowing ecotope: the Southern autumn & winter-sowing ecotope and the Qinghai-Tibet plateau spring-sowing ecotope. NES: Northeast spring-sowing ecotope; NSU: Northern summer-sowing ecotope; NSP: Northern spring-sowing ecotope; LPSS: Loess plateau spring & summer-sowing ecotope; NWSS: Northwest spring & summer-sowing ecotope; OSP: other sowing ecotope.

表4 不同黍稷群體間的遺傳距離與遺傳一致度

Nei氏遺傳一致度(對(duì)角線以上)和遺傳距離(對(duì)角線以下)。其他糜子區(qū): 南方秋冬糜子區(qū)和青藏高原春糜子區(qū)。

Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal). NES: Northeast spring-sowing ecotope; NSU: Northern summer-sowing ecotope; NSP: Northern spring-sowing ecotope; LPSS: Loess plateau spring & summer-sowing ecotope; NWSS: Northwest spring & summer-sowing ecotope; OSP: other sowing ecotope. Other sowing ecotope: the Southern autumn & winter-sowing ecotope and the Qinghai-Tibet plateau spring-sowing ecotope.

表5 基于UPGMA的200份黍稷資源組群分布

圖1 基于UPGMA的200份黍稷資源聚類(lèi)分析

NES: 東北春糜子區(qū); NSU: 華北夏糜子區(qū); NSP: 北方春糜子區(qū); LPSS: 黃土高原春夏糜子區(qū); NWSS: 西北春夏糜子區(qū); OSP: 其他糜子區(qū)。其他糜子區(qū): 南方秋冬糜子區(qū)和青藏高原春糜子區(qū)。

NES: Northeast spring-sowing ecotope; NSU: Northern summer-sowing ecotope; NSP: Northern spring-sowing ecotope; LPSS: Loess plateau spring & summer-sowing ecotope; NWSS: Northwest spring & summer-sowing ecotope; OSP: other sowing ecotope. Other sowing ecotope:the Southern autumn & winter-sowing ecotope and the Qinghai-Tibet plateau spring-sowing ecotope.

2.5 基于Structure的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

用Structure軟件對(duì)200份供試材料基因庫(kù)數(shù)目進(jìn)行建模(圖2)發(fā)現(xiàn), ?在=2和=7處存在峰值。由圖3可知,=2時(shí), 將試材分為2個(gè)類(lèi)群, 紅色類(lèi)群(121份), 主要為山西和陜西種質(zhì), 屬于北方春和黃土高原春夏糜子區(qū); 綠色類(lèi)群(79份), 主要為甘肅和河北種質(zhì), 屬于北方春和黃土高原春夏糜子區(qū)。=7時(shí), 劃分為7個(gè)類(lèi)群, 紅色類(lèi)群(32份), 主要來(lái)自山西和陜西種質(zhì), 代表黃土高原基因庫(kù); 綠色類(lèi)群(26份), 主要來(lái)自青海種質(zhì), 代表黃土高原基因庫(kù); 深藍(lán)色類(lèi)群(31份), 主要來(lái)自黑龍江和吉林種質(zhì), 代表東北基因庫(kù); 黃色類(lèi)群(19份), 主要來(lái)自山東種質(zhì), 代表華北基因庫(kù); 紫色類(lèi)群(25份), 主要來(lái)自山西種質(zhì), 代表北方基因庫(kù); 淺藍(lán)色類(lèi)群(34份), 主要來(lái)自山西種質(zhì), 代表北方基因庫(kù); 橙色類(lèi)群(33份), 主要來(lái)自甘肅種質(zhì), 代表黃土高原基因庫(kù)。

圖2 基于Structure對(duì)200份黍稷資源群體建模

圖3 基于Structure的黍稷核心種質(zhì)資源群體遺傳結(jié)構(gòu)圖

顏色代表類(lèi)群。橫坐標(biāo)數(shù)字分別代表黍稷材料序號(hào)和生態(tài)區(qū)類(lèi)型。NES: 東北春糜子區(qū); NSU: 華北夏糜子區(qū); NSP: 北方春糜子區(qū); LPSS: 黃土高原春夏糜子區(qū); NWSS: 西北春夏糜子區(qū); OSP: 其他糜子區(qū)。其他糜子區(qū): 南方秋冬糜子區(qū)和青藏高原春糜子區(qū)。

Different color represents the different group. Numbers in the horizontal axis represent accession number and type of ecotope area, respectively.NES: Northeast spring-sowing ecotope; NSU: Northern summer-sowing ecotope; NSP: Northern spring-sowing ecotope; LPSS: Loess plateau spring & summer-sowing ecotope; NWSS: Northwest spring & summer-sowing ecotope; OSP: other sowing ecotope. Other sowing ecotope:the Southern autumn & winter-sowing ecotope and the Qinghai-Tibet plateau spring-sowing ecotope.

2.6 200份黍稷資源遺傳差異的主成分分析

對(duì)200份供試材料進(jìn)行三維PCA分析(圖4)發(fā)現(xiàn), 前3個(gè)主成分PC1、PC2和PC3分別解釋總變異的49.7%、5.4%和3.5%, 累積解釋變異58.6%。200份黍稷資源可以劃分為6個(gè)類(lèi)群(東北春糜子區(qū)28份、華北夏糜子區(qū)23份、北方春糜子區(qū)63份、黃土高原春夏糜子區(qū)67份、西北春夏糜子區(qū)12份、其他糜子區(qū)7份), 與材料的地理來(lái)源一致。

圖4 200份黍稷資源遺傳多樣性的主成分分析

NES: 東北春糜子區(qū); NSU: 華北夏糜子區(qū); NSP: 北方春糜子區(qū); LPSS: 黃土高原春夏糜子區(qū); NWSS: 西北春夏糜子區(qū); OSP: 其他糜子區(qū)。其他糜子區(qū): 南方秋冬糜子區(qū)和青藏高原春糜子區(qū)。

NES: Northeast spring-sowing ecotope; NSU: Northern summer-sowing ecotope; NSP: Northern spring-sowing ecotope; LPSS:Loess plateau spring & summer-sowing ecotope; NWSS: Northwest spring & summer-sowing ecotope; OSP: other sowing ecotope. Other sowing ecotope: the Southern autumn & winter-sowing ecotope and the Qinghai-Tibet plateau spring-sowing ecotope.

3 討論

3.1 黍稷高基元SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)利用

黍稷是世界上最早馴化的谷類(lèi)作物之一, 具有重要的農(nóng)業(yè)、歷史和進(jìn)化意義。黍稷種質(zhì)資源豐富, 因此開(kāi)發(fā)新的分子標(biāo)記對(duì)于促進(jìn)其遺傳多樣性的研究意義重大。高基元SSR標(biāo)記的引物分辨率高, 對(duì)不同基因型的分辨能力強(qiáng), 2017年, 劉笑瑜[19]用151個(gè)高基元SSR擴(kuò)增6份黍稷材料, 發(fā)現(xiàn)85個(gè)標(biāo)記呈多態(tài)性, 多態(tài)率為56.3%。本研究從200對(duì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的高基元SSR引物中篩選得到52對(duì)多態(tài)性引物, 多態(tài)率為26%, 低于劉笑瑜的結(jié)果, 這可能與引物篩選標(biāo)準(zhǔn)不同以及獲得引物渠道有關(guān)。本研究開(kāi)發(fā)的四、五和六堿基重復(fù)多態(tài)性引物分別為17對(duì)、17對(duì)和18對(duì), 而劉笑瑜的研究結(jié)果分別為71對(duì)、10對(duì)和4對(duì), 表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料不同, 獲得的SSR標(biāo)記存在差異, 本研究開(kāi)發(fā)的五、六堿基SSR標(biāo)記數(shù)量占比顯著高于劉笑瑜的結(jié)果。一般來(lái)說(shuō), PIC<0.25, 為低度多態(tài)性引物, 0.25≤PIC<0.5為中度多態(tài)性引物, PIC≥0.5, 為高度多態(tài)性引物[32]。王舒婷等[24]利用27對(duì)高基元SSR檢測(cè)57份黍稷種質(zhì)的PIC平均值為0.5667, 陳小紅等[26]用30對(duì)高基元SSR擴(kuò)增130份黍稷材料發(fā)現(xiàn)PIC平均值為0.6966。本研究與前人結(jié)果一致, PIC均大于0.5, 所選引物為高度多態(tài)性引物, 說(shuō)明都可用于黍稷遺傳多樣性的研究。

3.2 黍稷種質(zhì)資源的遺傳差異

本研究參試200份黍稷地方核心種質(zhì)來(lái)源于國(guó)內(nèi)6個(gè)生態(tài)區(qū)的18個(gè)省、市、自治區(qū), 具有很強(qiáng)的代表性。因此, 利用新開(kāi)發(fā)的高基元SSR分子標(biāo)記對(duì)200份黍稷核心種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析, 將為黍稷種質(zhì)資源的收集保存以及育種研究提供理論依據(jù)。

本研究評(píng)估200份黍稷核心種質(zhì)資源遺傳差異發(fā)現(xiàn)Shannon多樣性指數(shù)()變化范圍為0.3093～1.0910, 平均為0.7277, 低于王舒婷等[24](0.7686)和王瑞云等[25](0.7708)結(jié)果, 這與選取試驗(yàn)材料差異有關(guān), 前人所選試材中含有農(nóng)家種和育成品種, 材料來(lái)源更廣, 而本研究材料均為地方品種; 高于連帥等[16](0.6275)結(jié)果, 這可能與我們所用高基元EST-SSR標(biāo)記有關(guān), 該標(biāo)記可以檢測(cè)到的變異更多。

有效等位基因數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)()和多態(tài)信息含量(PIC)可以綜合的反映群體遺傳多樣性水平[33]。從生態(tài)區(qū)角度對(duì)黍稷資源進(jìn)行遺傳多樣性分析, 結(jié)果表明黃土高原春夏糜子區(qū)材料的有效等位變異、基因多樣性和PIC指標(biāo)均高于其他6個(gè)生態(tài)區(qū)材料, 顯現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性, 這與王瑞云等[25]的結(jié)果一致。何杰麗等[23]、石甜甜等[34]和寇淑君等[35]研究均發(fā)現(xiàn)北方春糜子區(qū)與黃土高原春夏糜子區(qū)黍稷資源間的遺傳距離最小, 遺傳一致度最高, 親緣關(guān)系較近, 本研究也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果, 表明不同生態(tài)區(qū)黍稷種質(zhì)資源間遺傳距離的遠(yuǎn)近與其栽培環(huán)境及地理分布密切相關(guān)。

3.3 黍稷種質(zhì)資源的聚類(lèi)分析與遺傳結(jié)構(gòu)

聚類(lèi)分析與群體結(jié)構(gòu)分析是研究作物種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳背景的有效手段, 是作物種質(zhì)資源有效保護(hù)和利用的前提[36-37]。董俊麗等[38]對(duì)96份黍稷資源的表型性狀進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和聚類(lèi)分析結(jié)果表明, 類(lèi)群劃分與地理來(lái)源有一定的相關(guān)性。王瑞云等[25]利用高基元微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)96份中國(guó)糜子遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn), 聚類(lèi)分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果均與地理起源相關(guān)。本研究基于遺傳距離的聚類(lèi)分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn), 地理來(lái)源相近的資源基本聚在同一類(lèi)群, 與前人結(jié)果一致。因此, 本研究采用高基元EST-SSR標(biāo)記方法對(duì)200份黍稷核心種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 明確了黍稷核心種質(zhì)資源間遺傳背景和群體間的遺傳多樣性情況, 對(duì)今后育種材料的選用具有指導(dǎo)意義。

3.4 核心種質(zhì)的構(gòu)建

作物種質(zhì)資源是作物新品種的選育、特異種質(zhì)材料的利用以及種質(zhì)創(chuàng)新的物質(zhì)基礎(chǔ)[39]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和育種水平的不斷提高, 國(guó)內(nèi)外已構(gòu)建了包括四大糧食作物水稻[40]、小麥[41]、大麥[42]、玉米[43]等多種作物的核心種質(zhì)。中國(guó)是黍稷的起源中心, 之前也有報(bào)道構(gòu)建了黍稷核心種質(zhì), 包括胡興雨等[44]以國(guó)家作物種質(zhì)庫(kù)中保存的8016份國(guó)內(nèi)外黍稷資源為材料, 在11個(gè)表型性狀聚類(lèi)的基礎(chǔ)上, 按比例法取樣, 并依各組的遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整, 構(gòu)建了780份國(guó)內(nèi)外黍稷核心種質(zhì); 董孔軍等[45]以國(guó)內(nèi)黍稷地方種質(zhì)資源566份為基礎(chǔ), 按照20%取樣比例確定相應(yīng)數(shù)量類(lèi)群, 根據(jù)各基因型在類(lèi)群中的平均離差度確定取樣樣本, 構(gòu)建了甘肅省黍稷地方核心種質(zhì)122份。課題組前期構(gòu)建了516份國(guó)內(nèi)外黍稷核心種質(zhì)資源, 其中含有國(guó)內(nèi)外地方品種、育成品種及野生材料, 本試驗(yàn)材料200份是從中選出的具有優(yōu)良性狀、代表性強(qiáng)的國(guó)內(nèi)地方品種。因此, 本研究利用新開(kāi)發(fā)的高基元SSR標(biāo)記技術(shù)評(píng)估200份黍稷核心種質(zhì)資源的遺傳多樣性, 對(duì)于了解黍稷親緣關(guān)系、挖掘優(yōu)異種質(zhì)、提高育種效率和種質(zhì)資源利用率意義重大。

附表 請(qǐng)見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國(guó)知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬(wàn)方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

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High motif EST-SSR markers development and genetic diversity evaluation for 200 core germplasms in proso millet

WANG Qian1,2, ZHANG Li-Yuan3, XU Yue4, LI Hai5, LIU Shao-Xiong2, XUE Ya-Peng1,2,LU Ping2, WANG Rui-Yun1,*, and LIU Min-Xuan2,*

1College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Chifeng Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Chifeng 024031, Inner Mongolia, China;4College of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130012, Jilin, China;5Institute of High Latitude Crops, Shanxi Agricultural University, Datong 037008, Shanxi, China

The objective of this study is to clarify the genetic background for the core germplasm resources of proso millet and to evaluate the genetic diversity from different ecological regions in China. To provide a basis for accelerating proso millet breeding process and mining excellent germplasm, a new high motif EST-SSR markers were developed. In this study, 200 high motif EST-SSR markers were developed based on transcriptome sequencing results, and used to evaluate the genetic diversity for 200 core germplasm accessions of proso millet. Results showed that 52 of the 200 markers were polymorphic in 6 proso millet accessions with significant geographical differences, with the development efficiency of 26%, including 17 tetra-nucleotide repeat SSRs (32.7%), 17 penta-nucleotide repeat ones (32.7%), and 18 hexa-nucleotide repeat ones (34.6%). Among the examined 200 accessions, a total of 129 observed alleles were detected in 52 loci, changed 2–3 alleles at each locus. The Shannon diversity index was 0.3093–1.0910, with an average of 0.7277. The polymorphism information content was 0.1948–0.8211, with an average of 0.5104. Based on UPGMA, the 200 proso millet accessions were divided into six groups. Based on Structure (=7), proso millet were mainly from four gene pools in Northeast, Northern, Loess Plateau, and North China. Based on principal component analysis, the accessions were classified into six clusters, consistent with the geographic region. This study constructed a set of 52 tetra-, penta- and hexa-nucleotide repeat EST-SSR markers, with the efficiency of 26%. Based on the above markers, genetic diversity of proso millet for landrace core germplasm was abundant.

proso millet; core germplasm; high motif EST-SSR; genetic diversity; population structure

2023-02-13;

2023-02-28.

10.3724/SP.J.1006.2023.24201

通信作者(Corresponding authors):王瑞云, E-mail: wry925@126.com; 劉敏軒, E-mail: liuminxuan@caas.cn

E-mail: 457836483@qq.com

2022-08-31;

本研究由財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-06-14.5-A2), 農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用專(zhuān)項(xiàng)(2022NWB036-06), 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程, 吉林省自然科學(xué)基金(20200201153JC)和山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(2023CYJSTX03-12)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-06-14.5-A2), the Protection and Utilization for Crop Germplasm Resources (2022NWB036-06), the Agricultural Science and Technology Innovation Program of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, the Natural Science Foundation of Jilin Province (20200201153JC), and the Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System (2023CYJSTX03-12).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20230227.1702.014.html

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