李俊輝，張偉，程蘭玲，潘曉梅，唐慧芬，周濤，秦義杰，胡耀凱，劉強(qiáng)德，肖艷，賀筍

（天康生物制藥有限公司 烏魯木齊 830032）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀及死亡的高度接觸性傳染病，其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種易于發(fā)生變異和重組的單股正鏈RNA 病毒，該疾病可造成持續(xù)性感染和免疫抑制，對養(yǎng)豬業(yè)危害極為嚴(yán)重[1]。上世紀(jì)80 年代PRRS 在美國首次被報(bào)道，當(dāng)時(shí)因病原體未知被稱“豬神秘病”[2]，我國在1996 年首次分離到PRRSV 并命名為CH-1a[3]，此后流行的PRRSV 基因組發(fā)生變異，在Nsp2 基因處出現(xiàn)30 個氨基酸不連續(xù)缺失，稱之為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV），該毒株可感染各個年齡階段的豬只，發(fā)病率可達(dá)50%～100%，死亡率達(dá)20%～100%，感染豬群主要表現(xiàn)出高熱、高發(fā)病率和高死亡率的典型特征，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失[4,5]。2014 年起我國報(bào)道了基因組出現(xiàn)明顯變異和易重組的NADC30-like PRRSV[6,7]。不同區(qū)域類NADC30 毒株毒力差異較大，HNjz15 僅表現(xiàn)一過性體溫升高、伴隨呼吸道癥狀和體重下降的臨床表現(xiàn)[7]，而PRRSV JL580 可引起6 周齡的豬100%死亡[6]。通過全基因組分析也不能有效判定毒株的毒力，因此，本研究將分離的毒株用靶動物進(jìn)行毒力評價(jià)，以期獲得一株能夠用于疫苗的效力評價(jià)的中等毒力或強(qiáng)毒力毒株。

1 材料與方法

1.1 毒株

PRRSV NADC30-like 毒株由天康生物制藥有限公司分離獲得。毒株信息見表1。經(jīng)外源病毒檢測，證明無PRRSV、ASFV、PRV、CSFV、PCV2/3 等外源病毒和細(xì)菌的污染。

表1 進(jìn)行毒力評價(jià)的豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離毒株的背景信息

1.2 試驗(yàn)動物

30 頭6～7 周齡健康易感豬，PRRSV（病原和抗體）陰性；偽狂犬gE（抗原和抗體）陰性；豬瘟病原陰性；PCV2 病原陰性。

1.3 主要試劑與耗材

核酸提取試劑購自天根生物工程公司；PRRSV、PRV、CSFV、PCV2、核酸檢測試劑盒購自世紀(jì)元亨公司；PRRSV、PRV 抗體試劑盒購自IDEXX 公司。

2 動物試驗(yàn)

試驗(yàn)分為六組，每組5 頭，其中五組為攻毒組，另一組為空白對照組；30 頭試驗(yàn)隨機(jī)分組，并對其進(jìn)行編號，分配在不同的區(qū)域進(jìn)行飼養(yǎng)。每個試驗(yàn)組動物的編號應(yīng)如實(shí)進(jìn)行記錄。試驗(yàn)分組信息見表2。

表2 試驗(yàn)動物分組

2.1 攻毒程序

1）攻毒前準(zhǔn)備。所有豬每日測定直腸溫度用于確定基礎(chǔ)體溫，以攻毒前3d 測定的直腸溫度的平均值作為基礎(chǔ)體溫。

2）攻毒。毒力評價(jià)組所有豬按頸部肌肉注射和滴鼻途徑接種不同分離PRRSV 毒株（病毒含量為1.0×105.0TCID50/mL），滴鼻接種1.5 mL，頸部肌肉注射1.5 mL。攻毒時(shí)，使豬頭部稍微上仰，當(dāng)豬吸氣時(shí)，緩慢滴入鼻腔。對照組接種PBS，接種方式和劑量與毒力評價(jià)組相同。

2.2 攻毒后臨床癥狀觀察

試驗(yàn)動物攻毒后每日進(jìn)行臨床癥狀觀察，包括食欲狀況、呼吸癥狀、精神狀態(tài)、腹瀉等，并記錄觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)死亡情況。

2.3 體溫測定

攻毒后每日上午測直腸溫度，直至攻毒后21d 結(jié)束。

2.4 樣品采集

攻毒后第0、3、5、7、10、14 和21 天采集全血、咽拭子和肛拭子，直至試驗(yàn)結(jié)束。血樣分離血清，用于樣品中核酸載量分析。

3 結(jié)果

3.1 臨床癥狀

從精神狀態(tài)、被毛、體型、呼吸、咳嗽、皮膚、眼睛/結(jié)膜、采食、糞便九個維度進(jìn)行臨床癥狀評分，每個維度0～3 分，發(fā)病越嚴(yán)重評分越高[8]。其中A 組有一頭豬有臨床癥狀總評分（九個維度合計(jì)）最高2 分，表現(xiàn)采食下降，眼結(jié)膜炎；另外一頭最高總評分7 分，主要表現(xiàn)采食下降、被毛粗亂、皮膚發(fā)紅和眼結(jié)膜炎的癥狀，最高得分之后逐漸恢復(fù)正常，其他三頭在整個期間臨床癥狀總評分為0 分，未表現(xiàn)出九個維度特有的臨床癥狀。B 組有三頭臨床癥狀總評分最高分別為3 分、2 分、2 分，主要表現(xiàn)采食降低，眼結(jié)膜炎的癥狀，之后逐漸恢復(fù)正常，其余兩頭為0 分。C 組五頭臨床癥狀總評分最高分別為1 分、2 分、2 分、4 分、4 分，主要表現(xiàn)采食降低，眼結(jié)膜炎或被毛粗亂的癥狀，之后逐漸恢復(fù)正常。D 組五頭臨床癥狀總評分最高分別為10 分、12 分、12 分、13 分、15 分，得15 分豬最終死亡，主要臨床癥狀表現(xiàn)為不食、消瘦、被毛粗亂、眼部分泌物將上下眼瞼粘連、臥倒不能站立、呈現(xiàn)腹式呼吸；得10～13 分者表現(xiàn)食欲不佳、消瘦、被毛粗亂、眼部分泌物將上下眼瞼黏連、臥倒后驅(qū)趕可站立。E 組有兩頭臨床癥狀總評分最高分別為2、4 分，主要表現(xiàn)采食下降，眼結(jié)膜炎，其余三頭為0 分。F 組在整個攻毒過程中臨床癥狀總評分均為0 分。

3.2 體溫測定結(jié)果

其中D 組攻毒后第4～15 天，該組試驗(yàn)豬平均體溫均不低于40.5 ℃，3/5 試驗(yàn)豬連續(xù)3 d 體溫超過41 ℃，顯著高于其他攻毒組，其他攻毒組試驗(yàn)豬呈現(xiàn)體溫一過性升高，偶有一個溫次超過41 ℃后逐步恢復(fù)正常。對照組試驗(yàn)豬在整個試驗(yàn)過程中體溫未超過39.6 ℃，見圖1“試驗(yàn)豬攻毒后體溫變化曲線”。

圖1 試驗(yàn)豬攻毒后體溫變化曲線

3.3 血液、口、肛拭子病毒載量分析

1）血液中病毒載量。試驗(yàn)豬攻毒后分別在第0、3、5、7、10、14和21 天采集全血監(jiān)測病毒血癥的動態(tài)變化。所有豬在第0 天血液核酸陰性；A 組在攻毒第21 天檢測有一頭豬核酸陰性，其他豬和其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；B 組有一頭豬在第10、14 和21 天核酸陰性，有三頭在第14 天核酸陰性，之后又轉(zhuǎn)為陽性；C 組在第14 天有一頭豬核酸陰性，第21 天又轉(zhuǎn)為陽性，其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；D組在整個攻毒期病毒血癥核酸均為陽性；E 組在攻毒后第21 天檢測有一頭豬核酸陰性，其他豬和其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；F 組從攻毒到結(jié)束病毒血癥始終為陰性。圖2-1“試驗(yàn)豬攻毒后全血中病毒核酸載量分析”。

圖2-1 試驗(yàn)豬攻毒后全血中病毒核酸載量分析

2）咽拭子病毒載量的動態(tài)變化。試驗(yàn)豬攻毒后分別在第0、3、5、7、10、14 和21 天采集全血監(jiān)測咽拭子排毒的動態(tài)變化。所有豬在第0 天咽拭子核酸陰性；A 組在攻毒第14 和21 天檢測分別有一頭豬核酸陰性，其他豬和其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；B 組在第10 天有三頭豬、第14 天所有豬、第21 天一頭豬核酸陰性，之后又轉(zhuǎn)為陽性；C 組在第10、14 和21 天分別有四頭豬核酸陰性，第21 天又轉(zhuǎn)為陽性，其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；D 組攻毒開始到結(jié)束咽拭子始終為核酸陽性；E 組在攻毒后第14 和21 天檢測分別有二頭、一頭豬核酸陰性，其他豬和其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；F 組從攻毒到結(jié)束咽拭子始終為陰性，見圖2-2。

圖2-2 試驗(yàn)豬攻毒后咽拭子中病毒核酸載量分析

3）肛拭子病毒載量的動態(tài)變化。試驗(yàn)豬攻毒后分別在第0、3、5、7、10、14 和21 天采集全血監(jiān)測咽拭子排毒的動態(tài)變化。所有豬在第0 天肛拭子核酸陰性；A 組在攻毒第10 和21 天檢測分別有三頭豬、兩頭豬核酸陰性，其他豬和其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；B 組在第10 天有三頭豬、第14 天所有豬、第21 天一頭豬核酸陰性，之后又轉(zhuǎn)為陽性；C 組在第7、10 和21 天分別有三頭、一頭、三頭豬核酸陰性，第14 天又轉(zhuǎn)為陽性，其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；D 組攻毒開始到結(jié)束肛拭子始終為核酸陽性；E 組在攻毒后第7、14 和21 天檢測分別有一頭、第10 天有兩頭豬核酸陰性，其他豬和其他監(jiān)測時(shí)間均為陽性；F 組從攻毒到結(jié)束咽拭子始終為陰性，見圖2-3。

圖2-3 試驗(yàn)豬攻毒后肛拭子中病毒核酸載量分析

3.4 發(fā)病率統(tǒng)計(jì)

通過上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果的分析，結(jié)合農(nóng)業(yè)部第1548 公告《高致病豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗（TJM-92 株）質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程》中檢驗(yàn)用種毒的要求，從體溫、臨床癥狀、肺部病變?nèi)齻€維度進(jìn)行判定，本試驗(yàn)分離毒株進(jìn)行毒力評價(jià)和發(fā)病率分析統(tǒng)計(jì)見表3。

表3 發(fā)病率統(tǒng)計(jì)表

4 討論

本研究經(jīng)分離的毒株來自PRRSV 發(fā)病嚴(yán)重的陽性場，臨床豬死亡率在40%～50%，但在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行毒力評價(jià)并沒有顯示比較強(qiáng)的致病性，但JL580 株的致死率可達(dá)到100%[6]。造成這種差異存在兩個方面原因，一方面和毒株自身的致病力有關(guān)，有研究表明，JL580 株是類NADC30 與高致病性的重組毒，故具有較強(qiáng)的毒力[6]。另一方面用于毒力評價(jià)的豬只比較健康，飼養(yǎng)環(huán)境較好，未引起與臨床相當(dāng)死亡率。從臨床癥狀評分看，只有D 組表現(xiàn)出PRRSV特有的嚴(yán)重的臨床癥狀外，其余四組主要表現(xiàn)采食降低、被毛粗亂、眼結(jié)膜炎的輕微癥狀，臨床癥狀的嚴(yán)重程度和體溫成正相關(guān)。

本研究所用毒株經(jīng)宏基因組測序分析YQ（B 組）由譜系1.9 毒株P(guān)RRSV-T1 和譜系8.7 毒株JXA1-P120 重組而來；DB1（C 組）由譜系1.9 代表毒株NADC30 和譜系8.7 毒株HB-1/3.9c 重組而來；FCH（B 組）、HM（E 組）沒有與其他譜系的毒株重組，但上述毒株均屬低致病力毒株，有可能在重組或進(jìn)化過程中未獲得強(qiáng)毒的毒力基因。而DB3（D 組）由譜系1.9 毒株Fujian-2014 和譜系3 野毒株QYYZ 重組而來，可使3/5 發(fā)病，一頭死亡，屬中等毒力毒株，在整個試驗(yàn)過程中體溫、病毒血癥、咽拭子、肛拭子排毒時(shí)間和排毒量均高于其他攻毒組類。從病毒血癥、咽拭子、肛拭子含毒量、含毒周期數(shù)據(jù)來看，病毒檢出率為病毒血癥〉咽拭子〉肛拭子，因此，在臨床檢測中全血是首選的檢測材料。

NADC30 毒株無時(shí)無刻不在發(fā)生變異和重組，在進(jìn)化重組的過程中有可能獲得高致病性的毒力基因，為PRRSV 疫病的防控雪上加霜。在實(shí)際生產(chǎn)中除做好生物安全外，急需一款能夠通用且廣譜的PRRSV 基因工程疫苗，以減少臨床帶毒、排毒和共感染現(xiàn)狀，減少毒株遺傳演化多樣性，從而降低因PRRSV 造成的經(jīng)濟(jì)損失。因此，獲得一株具有代表性，又可引發(fā)強(qiáng)烈臨床癥狀的毒株是至關(guān)重要的，本研究評價(jià)的毒株（DB-3）初步可用于NADC30-like 疫苗效力評價(jià)的毒株。