李清嵐　劉穎　崔春

摘要：采用牛動脈彈性蛋白為原料，以彈性蛋白酶抑制活性和蛋白回收率為評價指標(biāo)，研究彈性蛋白肽制備工藝和理化性質(zhì)。結(jié)果表明，胰酶在酶添加量1.0%、pH 11、溫度45 ℃和時間15 h的條件下酶解彈性蛋白，彈性蛋白酶抑制活性（蛋白濃度為10 mg/mL）為35.63%，蛋白回收率可達(dá)80.08%；彈性蛋白酶解過程中，部分β-折疊和α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角，酶解產(chǎn)物小于1 000 Da的肽段占45.50%，富含疏水性氨基酸和芳香族氨基酸，具有較強(qiáng)還原力，清除DPPH和ABTS自由基的IC50值分別為6.90，3.41 mg/mL，且在溫度＜85 ℃、pH為中性和堿性的條件下具有良好的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：彈性蛋白；胰酶；MMP-12抑制活性；蛋白回收率；理化性質(zhì)

中圖分類號：TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0189-06

Abstract： With bovine arterial elastin as the raw material， elastase inhibitory activity and protein recovery rate as the evaluation indexes， the preparation process and physicochemical properties of elastin peptides are studied. The results show that when elastin is hydrolyzed by pancreatin under the conditions of enzyme addition amount of 1.0%， pH of 11， temperature of 45 ℃ and time of 15 h， the elastase inhibitory activity （protein concentration of 10 mg/mL） is 35.63% and the protein recovery rate is 80.08%. During the enzymolysis of elastin， some β-folding and α-helix are converted into β-turn. In the enzymatic hydrolysate， the peptides less than 1 000 Da account for 45.50%， which are rich in hydrophobic amino acids and aromatic amino acids， have strong reducing capacity， and the IC50 of scavenging DPPH and ABTS radicals is 6.90， 3.41 mg/mL respectively， and they have good stability at temperature < 85 ℃， pH neutral and alkaline conditions.

Key words： elastin; pancreatin; MMP-12 inhibitory activity; protein recovery rate; physicochemical properties

收稿日期：2022-12-05

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31201416）；國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0400803）

作者簡介：李清嵐（1997—），女，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：崔春（1978—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）過度表達(dá)時會加速降解彈性蛋白、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，表現(xiàn)為皮膚松弛、失去彈性、皺紋加深[1-3]。彈性蛋白酶（MMP-12）是降解彈性蛋白的關(guān)鍵酶[4]，且能激活其他MMPs活性[5]，與皮膚衰老密切相關(guān)，因此MMP-12抑制活性被認(rèn)為是延緩皮膚衰老的潛在解決方案。彈性蛋白肽（elastin peptide，EP）是彈性蛋白原的降解產(chǎn)物，與MMP-12有良好的親和力[6]，調(diào)控彈性蛋白和膠原蛋白的mRNA表達(dá)[7-8]，增殖成纖維細(xì)胞并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成[9-10]，因此通過生物酶解技術(shù)制備EP具有良好的開發(fā)價值。

彈性蛋白是一種硬蛋白，主要存在于牛、豬等哺乳動物的韌帶（約80%）、主動脈（30%～50%）、肺（10%～25%）、皮膚（2%～3%）或魚類的動脈球。丁劉剛等[11]以牛頸韌帶為原料，利用多種酶的協(xié)同作用在pH 7、50～60 ℃酶解10～20 h，制備具有美容作用的EP。蔡亞君等[12]采用木瓜蛋白酶在pH 6～8、30～60 ℃下酶解豬蹄粉10～20 h，制備可改善睡眠的EP。劉洋[13]、Nakaba等[14]分別以牛動脈、魚動脈球制備具有抗皮膚衰老活性的EP。目前國內(nèi)外對EP的研究多集中在活性評價，鮮有提及EP回收率，相關(guān)制備工藝的基礎(chǔ)性研究也較少。然而，在實際生產(chǎn)中酶解效率對于原料利用和經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。隨著市場對彈性蛋白肽需求的與日俱增，尋求效率高、成本低、效果顯著的制備工藝亟待解決。本研究通過酶篩選和工藝優(yōu)化提高彈性蛋白的酶解效率，探討彈性蛋白肽的理化性質(zhì)，以期為制定科學(xué)的生產(chǎn)工藝提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛動脈：購于當(dāng)?shù)厥袌?；彈性蛋白酶、N-succinyl-Ala-Ala-Ala-pNA：Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：上海麥克林生化科技有限公司；其他無機(jī)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

L-8800氨基酸分析儀 安捷倫科技有限公司；U-3000液相色譜儀、Multiskan Sky多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 彈性蛋白的提取

新鮮牛動脈清洗后去除表面脂肪，絞碎。采用熱堿法[15]提取，去除表面油脂和可溶性雜蛋白。將牛動脈與0.1 mol/L NaOH按1∶10（質(zhì)量和體積比）混勻，95 ℃水浴振蕩1 h，水洗至中性，離心取沉淀凍干，儲存使用。

1.3.2 酶種類篩選

按照表1的水解條件，稱取2 g彈性蛋白粉，加20 g水復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH，酶底比（E/S）為1.0%，在一定溫度下酶解15 h后沸水浴滅酶10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定MMP-12抑制活性、蛋白回收率和水解度。

1.3.3 彈性蛋白酶解工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

選用胰酶對彈性蛋白酶解，通過對酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酶解溫度（40，45，50，55，60，65 ℃）、酶解時間（9，12，15，18，21，24 h）、酶解pH（6，7，8，9，10，11）進(jìn)行研究，優(yōu)化MMP-12抑制肽制備工藝。

1.3.3.2 正交試驗

采用L9（33）正交表（見表2），選取酶解溫度、酶解時間和酶解pH 3個考察因素，以MMP-12抑制活性和蛋白回收率為評價指標(biāo)，確定最優(yōu)酶解工藝條件。

1.3.4 蛋白回收率和水解度的測定

采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定總氮，水解度采用甲醛滴定法測定。

水解度（%）=上清液氨基酸態(tài)氮含量原料總氮含量×100。

蛋白回收率（%）=上清液總氮質(zhì)量原料總氮質(zhì)量×100。

1.3.5 MMP-12抑制活性的測定

根據(jù)劉洋[13]的方法并稍作修改，96孔板依次加入200 μL樣品和50 μL 彈性蛋白酶（60 mU/mL），充分混勻，于25 ℃放置3 min，隨后加入50 μL N-succinyl-Ala-Ala-Ala-pNA（1 mmol/L），在410 nm處測定吸光度，記為Ac0、As0，將板放在全波長掃描儀上于25 ℃溫育10 min，隨后立即在410 nm處測定反應(yīng)后的吸光度，記為Ac、As。以Tris-HCl 緩沖液作為對照。MMP-12抑制活性計算公式如下：

MMP-12抑制活性（%）=1－As－As0Ac－Ac0×100。

式中：As0為反應(yīng)前樣品組的吸光度，As為反應(yīng)后樣品組的吸光度；Ac0為反應(yīng)前對照組的吸光度，Ac為反應(yīng)后對照組的吸光度。

1.3.6 彈性蛋白和EP的理化性質(zhì)測定

1.3.6.1 紅外光譜分析

采用紅外光譜（FT-IR）法測定蛋白結(jié)構(gòu)，稱取20 mg樣品，溴化鉀混合壓片，波長掃描范圍設(shè)置為400～4 000 cm-1，F(xiàn)T-IR光譜和二級結(jié)構(gòu)采用Ominic和PeakFit軟件進(jìn)行分析。

1.3.6.2 氨基酸組成的測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》測定氨基酸組成。

1.3.6.3 肽分子量的測定

采用HPLC法測定分子量分布，色譜柱：TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×300 mm，250 mm），檢測波長220 nm，柱溫30 ℃。流動相為水∶乙腈為80∶20（體積比），加入濃度為0.1%的TFA，以0.5 mL/min等度洗脫。以標(biāo)準(zhǔn)品分子量對數(shù)與保留時間作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算分子量分布。

1.3.6.4 抗氧化活性的測定

根據(jù)葉昱輝[16]的方法測定還原力。

根據(jù)GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性測定 DPPH和ABTS法》測定。

1.3.6.5 溫度和pH對EP活性保留率的測定

配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品溶液，分為溫度組（25，45，65，85，100，121 ℃保溫2 h）和pH組（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0放置2 h后將pH調(diào)至8.0），分別將25 ℃和pH 8.0設(shè)為對照組（100%），計算MMP-12抑制活性保留率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Excel和SPSS 23.0軟件統(tǒng)計分析，結(jié)果記為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，采用Tukey檢驗進(jìn)行顯著性分析，P<0.05視為具有顯著性差異，使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類篩選

不同蛋白酶的酶切位點不同，催化同一底物產(chǎn)生的肽鏈長度和氨基酸序列不同導(dǎo)致活性有差異。由表3可知，采用堿性蛋白酶、AB 8000、木瓜蛋白酶酶解的EP的MMP-12抑制活性顯著高于其他蛋白酶，NS 37071、胰酶酶解的EP次之，但堿性蛋白酶、AB 8000、木瓜蛋白酶酶解的蛋白回收率和水解度很低，表明彈性蛋白未充分水解，造成總體活性貢獻(xiàn)率低和原料的浪費(fèi)。NS 37071與胰酶酶解的EP的MMP-12抑制活性無顯著性差異，但胰酶酶解的EP蛋白回收率是NS 37071的1.48倍，顯著高于NS 37071。胰酶中蛋白酶主要由胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶等組成，姜佳等[17]利用胰蛋白酶和胰糜蛋白酶協(xié)同酶解豬肺可獲得高鎖鏈素含量的彈性蛋白肽，說明胰蛋白酶和胰糜蛋白酶能提高彈性蛋白肽的釋放量，此外，彈性蛋白酶對彈性蛋白具有特異吸附性，對彈性蛋白優(yōu)先水解且有很強(qiáng)的水解作用[18]，這可能是胰酶能深度水解結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的彈性蛋白的原因。綜合考慮活性和得率，選擇胰酶進(jìn)一步試驗。

由圖1可知，當(dāng)?shù)鞍诐舛刃∮?0 mg/mL時，隨著EP濃度的增大，MMP-12抑制活性隨之提高，表明EP的MMP-12抑制活性與蛋白濃度存在良好的劑量關(guān)系，因此EP的蛋白回收率越大，對產(chǎn)品整體的貢獻(xiàn)率越大。

2.2 單因素試驗結(jié)果

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，MMP-12抑制活性呈現(xiàn)倒“V”趨勢，在45 ℃時MMP-12抑制活性、蛋白回收率達(dá)到最大值，因此45 ℃為最佳酶解溫度。隨著酶添加量的增加，MMP-12抑制活性無顯著性差異，說明在不同酶添加量下可能得到相似組成的EP。當(dāng)酶添加量在0.5%～1.0%時，蛋白回收率增加幅度較大，當(dāng)酶添加量>1.0%時，蛋白回收率增加緩慢。綜合考慮生產(chǎn)成本，確定酶添加量為1.0%。隨著酶解時間的延長，蛋白回收率隨之增大，在15 h后增加幅度變緩，MMP-12抑制活性在12 h后無顯著性差異，這與劉洋[13]的研究結(jié)果相似，因此選擇9～15 h進(jìn)一步優(yōu)化。pH在8～11范圍內(nèi)MMP-12抑制活性無顯著性差異，且在pH 10時達(dá)到最高蛋白回收率，過高的pH（＞12）會導(dǎo)致胰酶失活，因此選擇pH 9～11進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 正交試驗結(jié)果

由表4中極差分析可知，影響蛋白回收率和MMP-12抑制活性的主次順序均為時間＞pH＞溫度。對于因素A和因素C，蛋白回收率和MMP-12抑制活性的最優(yōu)水平分別為A2和C3。對于因素B，優(yōu)化水平可選B2或B3。取B2時，MMP-12抑制活性比取B3時提高10.3%，蛋白回收率減少6.4%，故因素B取B2。因此，本試驗的優(yōu)化組合為A2B2C3，即酶解溫度為45 ℃，酶解時間為15 h，酶解pH為11。在該條件下酶解，蛋白回收率為80.08%，水解度為12.98%，蛋白濃度為10 mg/mL時MMP-12抑制活性為35.63%。

2.4 彈性蛋白和EP的紅外光譜分析

酶解前后彈性蛋白在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)的FT-IR光譜見圖3。

3 500～3 100 cm-1區(qū)域強(qiáng)而寬的特征峰是由O-H和N-H伸縮振動引起的，吸收峰紅移，說明形成氫鍵，可能是由于N-H伸縮振動與氫鍵互相結(jié)合[19]。1 700～1 600 cm-1為酰胺I帶，此波段的吸收峰表示蛋白分子間以及分子內(nèi)部形成的二級結(jié)構(gòu)。一般而言，酰胺I帶吸收的波數(shù)越低，蛋白質(zhì)中的氫鍵作用越高，酶解后的酰胺I帶（CO伸縮振動峰）發(fā)生了藍(lán)移（約8 cm-1），可能是酶解處理破壞了彈性蛋白結(jié)構(gòu)中CO參與的氫鍵作用，從而引起蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的部分解體[20]，表明其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

由表5可知，在酶解過程彈性蛋白的二級結(jié)構(gòu)之間出現(xiàn)了相互轉(zhuǎn)化。β-折疊從49.45%降低到32.12%，α-螺旋從15.27%降低到9.65%，無規(guī)則卷曲無顯著性變化，β-轉(zhuǎn)角從13.36%增加到32.09%，β-反平行從1.40%增加至5.04%。β-折疊結(jié)構(gòu)變化較復(fù)雜，包括分子內(nèi)、分子間平行和反向平行等多種形式，其中平行β-折疊較β-反平行折疊更規(guī)則。彈性蛋白的重復(fù)序列具有較高的形成分子內(nèi)和分子間氫鍵的能力，這與β-折疊形成有關(guān)，由表5可知，彈性蛋白的β-折疊含量高達(dá)49.45%，這可能與彈性蛋白特殊的氨基酸組成有關(guān)，且β-折疊相較于α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角更穩(wěn)定[21]，α-螺旋、β-折疊的減少和β-轉(zhuǎn)角的增加可能使蛋白質(zhì)展開，二級結(jié)構(gòu)由有序轉(zhuǎn)為無序，利于酶解的進(jìn)行，使得更多的疏水性氨基酸暴露。

2.5 彈性蛋白和EP的氨基酸組成

彈性蛋白和EP具有相似的氨基酸組成和含量，彈性蛋白（肽）的標(biāo)志性氨基酸（Des和Ide）含量約為0.18%，非極性氨基酸占比超過90%，Gly含量高達(dá)24%，Ala含量約占19%；親水性氨基酸含量較低，其中Met含量極少（未檢出），與報道的（牛來源）彈性蛋白氨基酸組成相符[22]。EP高水平的Gly、Ala、Val、Pro、Leu、Phe被報道與彈性蛋白酶具有良好的親和力[23]，這可能是其具有較高M(jìn)MP-12抑制活性的原因。彈性蛋白酶解后，堿性氨基酸Lys、Arg、His和酸性氨基酸Asp含量增加，芳香族氨基酸Phe和Tyr含量占比約為10%，高含量的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸可能對EP的抗氧化活性起著關(guān)鍵作用。

2.6 EP的肽分子量分布

由表7可知，EP的分子量小于3 000 Da的多肽組分占彈性蛋白肽的60.49%，其中小于1 000 Da的多肽占45.50%，據(jù)報道，小肽更容易被吸收利用且在體內(nèi)發(fā)揮生物活性作用[24—25]。同時，蛋白過度酶解可能會因含有大量游離氨基酸而導(dǎo)致活性降低，Alemán等[26]研究發(fā)現(xiàn)酶解物中的游離氨基酸會降低其抗氧化活性，本研究中EP分子量小于180 Da的多肽占比僅為0.44%，含量極低，說明在該酶解條件下，彈性蛋白并未過度水解。

2.7 EP的抗氧化活性

彈性蛋白肽的抗氧化活性對延緩皮膚衰老有潛在貢獻(xiàn)作用[27—29]。

由圖4可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，EP的還原力、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力都逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時，EP在700 nm處的吸光值為0.352，與0.1 mg/mL谷胱甘肽的還原力相當(dāng)，具有較強(qiáng)的還原力。唐敏等[30]制備的牛頸韌帶EP在質(zhì)量濃度30 mg/mL時，在700 nm處的吸光值不及0.3。經(jīng)計算，EP的DPPH和ABTS自由基清除能力的IC50值分別為6.90，3.41 mg/mL。當(dāng)EP的質(zhì)量濃度分別約為GSH的25倍和38倍時，EP清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力與GSH相當(dāng)。

2.8 溫度和pH對EP活性保留率的影響

熱處理和pH處理是食品加工中的常用方法，由圖5可知，升高溫度（＜65 ℃）對MMP-12抑制活性無顯著影響，當(dāng)溫度升至85 ℃以上，MMP-12抑制活性低于85%。EP在不同pH條件下MMP-12抑制活性保留率呈現(xiàn)中間高兩端低的特點，在中性和偏堿性條件下MMP-12抑制活性保留率保持在85%以上。

3 結(jié)論

以牛動脈彈性蛋白為原料，通過酶篩選和工藝優(yōu)化制備具有高蛋白回收率的MMP-12抑制肽，分析其二級結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、肽分子量分布、抗氧化能力和加工穩(wěn)定性，對它們的理化性質(zhì)進(jìn)行基礎(chǔ)性研究，為EP的實際應(yīng)用提供借鑒。

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