胡海洋,彭 亮,程 艷,程 剛, 4,邢 月

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學水利與土木工程學院,烏魯木齊 830052;2.新疆環(huán)境污染監(jiān)控與風險預警重點實驗室,烏魯木齊 830012;3.新疆環(huán)境保護科學研究院,烏魯木齊 830012;4.上饒師范學院生命科學學院,江西 上饒 334003;5.新疆農(nóng)業(yè)大學化學化工學院,烏魯木齊 830000)

【研究意義】真菌在水生生態(tài)系統(tǒng)中可作為分解者參與有機物的分解和代謝,同時在水體能量流動和營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和轉(zhuǎn)換中扮演著重要角色[1-2]。水生真菌廣泛存在于水生生態(tài)系統(tǒng)中,在靜態(tài)水(湖泊、水庫、人工湖等)和動態(tài)水(河流、小溪、水溝等)環(huán)境中均可存在[3-4]。作為水生生態(tài)環(huán)境中的分解者,水生真菌能夠通過胞外酶等形式分解和代謝水環(huán)境中的有機物質(zhì)并釋放營養(yǎng)和次級代謝產(chǎn)物,從而以不同方式影響著水生生態(tài)系統(tǒng)中食物網(wǎng)結構、物質(zhì)和能量流動。因此研究水生真菌的多樣性及胞外酶活性對指導水生生態(tài)系統(tǒng)的健康可持續(xù)發(fā)展以及預測環(huán)境變化對生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來,產(chǎn)胞外酶真菌對環(huán)境中大顆粒物質(zhì)的催化水解及作用機理研究備受關注,Payne等[5]對纖維素降解真菌產(chǎn)酶條件及應用范圍進行了初步探究。羅春雷等[6]和Fan等[7]對淀粉酶的分類及水解類型進行調(diào)查研究,發(fā)現(xiàn)淀粉酶被廣泛應用于各個行業(yè)中。陳洪洋等[8]對木聚糖酶的產(chǎn)生菌及如何提高木聚糖酶的酶活性進行了研究。武善軍[9]則對產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的真菌及其發(fā)酵條件進行研究,找出了最佳的產(chǎn)酶條件。而產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、酯酶和木聚糖酶的降解真菌主要以青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)為主[10-13]。大量研究已從水生生境中分離得到具有潛在應用價值的產(chǎn)胞外酶真菌[14-15]?！颈狙芯壳腥朦c】伊犁河流域是新疆水資源最豐富的內(nèi)陸河流域之一[16],流域地處西北內(nèi)陸干旱區(qū),自然地理、氣候條件及人類活動特征與中東部地區(qū)差異顯著,其水生態(tài)系統(tǒng)中微生物類型和多樣性在西北內(nèi)陸區(qū)具有典型性和代表性;而目前有關流域水生微生物,尤其是水生真菌種類及胞外酶活性研究尚屬空白?！緮M解決的關鍵問題】本研究針對伊犁河流域主要干支流水體及沉積物的可培養(yǎng)真菌多樣性及胞外酶活性進行調(diào)查分析,以期摸清該區(qū)域內(nèi)可培養(yǎng)真菌的種類、分布、優(yōu)勢門屬等信息,篩選潛在功能性真菌菌株,挖掘和儲備研究區(qū)具有水環(huán)境凈化和污水高效降解的真菌菌種資源,為流域水環(huán)境保護和水污染治理提供科學參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取伊犁河三支一干(特克斯河、喀什河、鞏乃斯河及伊犁河干流)水體和沉積物作為研究對象,平均約每50 km設置1個采樣點,全流域共設置15個點位,其中特克斯河、喀什河和伊犁河干流分別設置4個采樣點,鞏乃斯河設置3個采樣點,每個樣點采集水體和沉積物樣品各1份。于2021年7—8月,在伊犁河流域進行樣品采集,將采集的樣品裝在50 mL無菌離心管內(nèi),4 ℃低溫保存并運輸至實驗室備用。

1.2 培養(yǎng)基制備

分離培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基[21]。本試驗選擇的胞外酶有淀粉酶、纖維素酶、酯酶、明膠酶、木聚糖酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶培養(yǎng)基和偶氮還原酶,相關培養(yǎng)基的配置和胞外酶活性篩選參照相關文獻[17-22]的方法并做適當修改。

1.3 真菌的分離培養(yǎng)及菌種保藏

水樣和沉積物樣品采用稀釋涂布平板法,將各支流微生物取樣點的水體(1 mL)和沉積物(15 g左右)等量混合,用0.85%生理鹽水依次稀釋到10-1、10-2,每個稀釋度取0.2 mL涂布于4種分離培養(yǎng)基平板上,于26 ℃培養(yǎng)5～7 d,根據(jù)菌落形態(tài)、色澤的差異,挑取形態(tài)差異較大的單菌落轉(zhuǎn)接純化2～3次。挑取純化后的單菌落,用含40%甘油的分離純化培養(yǎng)基-80 ℃下保種。

1.4 真菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

1.4.1 真菌ITS區(qū)基因序列擴增 將篩選純化的菌株在培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后,刮取50 mg左右菌苔放至2 mL離心管內(nèi),參照真菌基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)的操作說明書提取真菌DNA。

純化真菌ITS區(qū)段的序列擴增使用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應體系(25 μL):雙蒸水16 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP Mixture 2 μL,rTaq0.5 μL,引物各1 μL,模板DNA 2 μL。PCR擴增程序參照魏超等[23]的方法進行并做適當修改[23]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,選擇有特異性明亮條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.4.2 系統(tǒng)發(fā)育分析與數(shù)據(jù)處理 將純化真菌的ITS區(qū)基因測序結果進行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)同源性比對,獲得最相近模式菌株的ITS區(qū)基因序列。利用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析,根據(jù)Kimura的雙參數(shù)模型計算系統(tǒng)進化矩陣,采用最大似然法(Maximum likelihood method)構建系統(tǒng)進化樹[24]。并將純化真菌測序結果上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫,獲取待測菌株的注冊號。

伊犁河流域可培養(yǎng)真菌α多樣性指數(shù)(Simpson、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Magalef豐富度指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù))的計算采用Excel 2019軟件,具體公式參考郭小芳等[25]的方法進行計算。

2 結果與分析

2.1 伊犁河流域可培養(yǎng)真菌菌群組成

從伊犁河流域采集的水體和沉積物樣品中共分離得到248株真菌。根據(jù)菌落形態(tài)結合ITS區(qū)基因比對結果,將248株可培養(yǎng)真菌劃分為3個門,11個綱,26個目,44個科,82個屬,其中菌株F-1(OM638712)只鑒定到柔膜菌目(Helotiales),菌株F-119(OM648169)只鑒定到肉座菌目(Hypocreales);菌株F-222(OM647879)只鑒定到Plectosphaerellaceae科,菌株F-232(OM670130)只鑒定到Cistella科(表1)。4株可培養(yǎng)真菌菌株(F-5、F-13、F-56、F-97)的BLAST比對結果最高相似率低于98%(表1,加粗標出),初步確定為潛在新物種,值得開展多項分類學研究來明確其系統(tǒng)分類地位。對部分代表菌株與相應的模式菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。在門水平上,248株菌株分屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉菌門(Mucoromycota)。其中,子囊菌門為優(yōu)勢門,占總分離菌株的87.10%,分屬于61個屬4個潛在的新類群,是伊犁河流域真菌的主要類群;其次是擔子菌門,共分離得到28株,占比為11.66%。在屬水平上,優(yōu)勢菌屬為青霉屬(Penicillium),占總分離菌株的7.26%;其次是枝孢霉屬(Cladosporium),占總分離菌株的6.85%;隨后是木霉屬(Trichoderma),占總分離菌株的5.65%;然后是鐮刀菌屬(Fusarium),占總分離菌株的4.44%;最后是小球腔霉屬(Leptosphaeria)和莖點霉屬(Phoma),都占總分離菌株的4.03%。上述結果表明,伊犁河流域水環(huán)境中具有豐富多樣的水生真菌。

圖1 伊犁河流域部分真菌ITS區(qū)基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of ITS region gene sequences of some fungi in the Ili River basin

表1 伊犁河流域可培養(yǎng)真菌ITS區(qū)基因序列相似性Table 1 ITS region gene sequence similarity of culturable fungi in the Ili River basin

2.2 伊犁河流域真菌分布特征

流域水體和沉積物分離出的可培養(yǎng)真菌多樣性具有明顯差異,水體中共分離得到116株真菌,其中子囊菌門(Ascomycota)101株,擔子菌門(Basidiomycota)14株,毛霉菌門(Mucoromycota)1株;優(yōu)勢菌屬為枝孢霉屬(Cladosporium)、莖點霉屬(Phoma)和Vishniacozyma,分別占水體總分離菌株的9.48%、6.90%、6.90%。沉積物中共分離得到132株真菌,其中子囊菌門115株,擔子菌門14株,毛霉菌門3株;優(yōu)勢屬為青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)和小球腔霉屬(Leptosphaeria),分別占沉積物總分離菌株的13.04%、10.43%和8.70%。

2.3 不同河流水生真菌群落組成差異

2.3.1 不同河流水生真菌多樣性分析 α多樣性指數(shù)指示了伊犁河流域三支一干河流中水生真菌的物種多樣性(表2)。Shannon指數(shù)(H′)分析可知,喀什河樣本中真菌群落多樣性最大,為3.79;鞏乃斯河樣本中真菌群落多樣性最小,為3.21;Simpson指數(shù)顯示各樣本間差異不大,喀什河樣本中水生真菌類群優(yōu)勢度最大,為0.976;鞏乃斯河樣本優(yōu)勢度最小,為0.950;Magalef豐富度和Pielou均勻度指數(shù)表明在鞏乃斯河水環(huán)境真菌群落分布最不均勻,豐富度最低,指數(shù)分別為0.95和7.86;特克斯河水環(huán)境真菌群落分布最均勻,指數(shù)為1.00。上述結果表明,伊犁河流域不同河流間可培養(yǎng)水生真菌的菌落組成、豐度及多樣性不同。

表2 不同河流可培養(yǎng)水生真菌菌群的多樣性Table 2 Diversity of culturable aquatic fungal flora in different rivers

2.3.2 不同河流水生真菌菌屬的差異 在伊犁河流域內(nèi),特克斯河和喀什河分離出的菌株最多,均為73株,占總分離菌株的29.44%;鞏乃斯河分離的菌株最少(44株),占菌株總數(shù)的17.74%。對比伊犁河流域4條河流中真菌菌屬的分布特征,發(fā)現(xiàn)喀什河分離的菌株有46個屬,在4條河中所占比重最多;其次是特克斯河,分離的菌株有43個屬;伊犁河干流分離的菌株有27個屬;鞏乃斯河分離的菌株有23個屬(圖2)。在屬的水平上,枝孢酶屬(Cladosporium)、青霉屬(Penicillium)和鐮刀菌屬(Fusarium)在4條河中都有分布;木霉屬(Trichoderma)除喀什河外均有分布;小球腔霉屬(Leptosphaeria)只在特克斯河和喀什河分布;Vishniacozyma只在鞏乃斯河和喀什河中分布;鞏乃斯河中無鏈格孢屬(Alternaria)、背芽突霉屬(Cadophora)、莖點霉屬(Phoma)和Solicoccozyma分布;曲霉屬(Aspergillus)除特克斯河外均有分布;Parasarocladium只分布在伊犁河干流。綜上所述,不同河流水生真菌群落組成與分布存在較明顯差異。

圖2 總豐度前1%屬水平上的真菌多樣性Fig.2 Fungal diversity at the genus level in the top 1% of total abundance

2.4 伊犁河流域真菌胞外酶活性的篩選

本研究對分離獲得的248株真菌進行了9種胞外酶活性篩選,部分菌株酶活性檢測結果見圖3。

圖3 部分菌株酶活性檢測結果Fig.3 Results of enzyme activity detection of some strains

根據(jù)篩選結果可知,產(chǎn)1種及1種以上胞外酶的菌株共有153株,其中子囊菌門(Ascomycota)真菌136株,擔子菌門(Basidiomycota)真菌17株,共62個屬;產(chǎn)2種及2種以上胞外酶的菌株共有100株,其中子囊菌門真菌88株,擔子菌門真菌12株,共47個屬,部分菌株酶活性測定結果見表3。在88株子囊菌真菌(41個屬)中,有7株菌株產(chǎn)5種及5種以上胞外酶,有43株菌株至少產(chǎn)3種胞外酶,優(yōu)勢菌屬為青霉屬(Penicillium)、枝孢霉屬(Cladosporium)和小球腔霉屬(Leptosphaeria)。在12株擔子菌真菌(6個屬)中,有1株菌株產(chǎn)5種及5種以上胞外酶,有4株菌株產(chǎn)3種及3種以上胞外酶,優(yōu)勢屬為Vishniacozyma。

表3 部分可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶活性測定結果Table 3 Measurement results of extracellular enzymes produced by some culturable fungi

產(chǎn)胞外酶活性菌株的比較結果(表3)顯示,產(chǎn)胞外纖維素酶的菌株(71株)最多,其次是產(chǎn)淀粉酶(53株)和酯酶(54株)的菌株,隨后是產(chǎn)木聚糖酶的菌株(44株),產(chǎn)明膠酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶和偶氮還原酶活性的菌株較少。產(chǎn)纖維素酶優(yōu)勢屬為枝孢霉屬(Cladosporium);產(chǎn)淀粉酶和木聚糖酶的主要菌屬為青霉屬(Penicillium)。由表4可知,淀粉酶、酯酶、纖維素酶、木聚糖酶、明膠酶和木質(zhì)素過氧化物酶這6種酶類中沉積物產(chǎn)胞外酶的菌株數(shù)均高于水體,淀粉酶和酯酶沉積物產(chǎn)胞外酶的菌株數(shù)為水體的2倍,錳過氧化物酶、漆酶和偶氮還原酶水體產(chǎn)胞外酶的菌株數(shù)高于沉積物。

表4 伊犁河流域產(chǎn)胞外酶菌株分布Table 4 Distribution of extracellular enzyme-producing strains in the Ili River basin

在空間分布上,9種胞外酶菌株在4條河流中均有分布,其中:特克斯河40株(25個屬)、鞏乃斯河25株(18個屬)、喀什河43株(31個屬)、伊犁河干流45株(25個屬)包含1種及1種以上胞外酶活性,分別占相應河流分離菌株的54.79%、56.82%、58.90%和77.59%;產(chǎn)2種及2種以上胞外酶活性的真菌中,特克斯河27株(18個屬)、鞏乃斯河16株(14個屬)、喀什河30株(22個屬)、伊犁河干流27株(16個屬),分別占相應河流分離菌株的36.40%、36.36%、41.10%和46.56%。特克斯河真菌產(chǎn)酶優(yōu)勢屬為枝孢霉屬(Cladosporium)和小球腔霉屬(Leptosphaeria);鞏乃斯河真菌產(chǎn)酶優(yōu)勢屬為曲霉屬(Aspergillus)和Vishniacozyma;喀什河真菌產(chǎn)酶優(yōu)勢屬為小球腔霉屬和青霉屬(Penicillium);伊犁河干流真菌產(chǎn)酶優(yōu)勢屬為青霉屬和枝孢霉屬。

3 討 論

3.1 伊犁河流域真菌多樣性差異

本研究從伊犁河流域共獲得248株可培養(yǎng)真菌,水體116株,沉積物132株,對其進行序列對比及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),248株真菌歸屬于3個門、87個屬、115個種。其中,子囊菌門(Ascomycota)為主要優(yōu)勢菌群。伊犁河流域可培養(yǎng)真菌類群多樣性明顯高于滇池水體和沉積物[26](61個屬)、黑龍江烏伊嶺濕地自然保護區(qū)水體[27](16個屬)和程海湖水體和沉積物[28](50個屬),水生真菌優(yōu)勢屬與上述水環(huán)境相同,均為青霉屬(Penicillium)、枝孢霉屬(Cladosporium)和木霉屬(Trichoderma)。

伊犁河流域主要干支流水體和沉積物的可培養(yǎng)真菌分布具有明顯差異,優(yōu)勢菌群也不同,沉積物中真菌的類群較多(53個屬),水體中的真菌類群較少(34個屬);沉積物和水體的優(yōu)勢屬也不同,沉積物的優(yōu)勢屬為青霉屬,占沉積物菌株總數(shù)的11.36%;而水體的優(yōu)勢屬為枝孢霉屬,占水體菌株總數(shù)的8.62%;沉積物和水體中真菌共有屬為22個,占伊犁河流域真菌分布屬的25.29%;兩種介質(zhì)中獨有真菌屬為43個(水體12個屬,沉積物31個屬),占伊犁河流域真菌分布屬的49.43%。伊犁河流域水體和沉積物中水生真菌類群多且多樣性豐富,沉積物中分離得到的可培養(yǎng)真菌無論是種群和數(shù)量都比水體的多,該結果與彭柯等[29]對北運河水體及沉積物微生物群落組成的對比研究相符,從沉積物中分離得到的真菌種類和數(shù)量要明顯高于水體,沉積物中營養(yǎng)組分和有機質(zhì)較水體豐富,更適合真菌菌株的生存和繁衍[30]。

α多樣性指數(shù)分析表明,伊犁河流域除鞏乃斯河外,特克斯河和喀什河可培養(yǎng)真菌群落的Simpson、Shannon和Magalef指數(shù)均高于伊犁河干流。Xue等[31]對烏魯木齊河的真菌多樣性進行研究,發(fā)現(xiàn)上游真菌群落多樣性高于下游,上游樣品的Shannon指數(shù)最高,Magalef指數(shù)有所不同,并指出大量的人類活動對真菌的群落結構有很大的影響。Sudheep等[32]和Pietryczuk等[33]對河流的真菌多樣性進行研究,表明河流上中游真菌群落的α多樣性指數(shù)最高。總的來說,伊犁河流域與上述這些河流真菌的群落多樣性指數(shù)變化相似,在人類活動較多的地區(qū),α多樣性指數(shù)相對較低。但伊犁河流域各河流間的α多樣性指數(shù)變化較小,體現(xiàn)了各河流之間真菌群落結構既有差異性又有相似性。伊犁河流域面積廣闊,從3個主源頭到干流區(qū)的地理差異性和人類活動特征顯著不同,這也是造成各河流環(huán)境中水生真菌多樣性指數(shù)不同的主要原因。

3.2 伊犁河流域真菌的胞外酶活性

對伊犁河流域分離的可培養(yǎng)真菌進行9種胞外酶活性菌株的篩選,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)1種及1種以上胞外酶的菌株共有153株,占總分離菌株的61.69%;共有100株菌株至少產(chǎn)2種胞外酶,占總分離菌株的40.32%。伊犁河流域可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶的優(yōu)勢屬為枝孢霉屬(Cladosporium)、青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus),與晉方佑[28]對程海湖及郭瀟等[34]對湖光巖的相關研究一致。其中,產(chǎn)胞外纖維素酶的菌株(71株)最多,優(yōu)勢屬為青霉屬;其次是產(chǎn)淀粉酶(53株)和酯酶(54株)的菌株,產(chǎn)淀粉酶的優(yōu)勢屬為青霉屬,產(chǎn)纖維素酶與淀粉酶的優(yōu)勢屬與戈帆[26]對滇池水體和沉積物中真菌胞外酶活性的研究結果相同;產(chǎn)酯酶的優(yōu)勢屬為曲霉屬。研究結果表明,伊犁河流域可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶菌株多樣性較豐富;說明在營養(yǎng)較為貧瘠的條件下,真菌產(chǎn)生拮抗活性物質(zhì)作為中間競爭的方式,以此占據(jù)有利的水生生態(tài)環(huán)境[35]。

從特克斯河至伊犁河干流,可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶活性的類群均以子囊菌門(Ascomycota)為主,真菌菌株產(chǎn)胞外酶活性的比例逐漸增加(54.79%～77.59%),伊犁河干流菌株產(chǎn)胞外酶活性的比例最高(77.59%)。表明伊犁河流域可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶活性菌株的空間分布差異性較顯著。4條河流中產(chǎn)胞外酶的真菌種群既有共性也有其特異性,其原因可能是這4條河流具有地理相似性,而產(chǎn)酶種群可能與自身所存在的河流環(huán)境的差異性有關。戈帆[26]通過對滇池真菌胞外酶活性與環(huán)境因子間相關性研究發(fā)現(xiàn),滇池各個區(qū)域之間的真菌胞外酶活性與環(huán)境因子(總氮、總磷、氫離子濃度指數(shù)、溫度、電導率等)具有極顯著相關性,譚金連[36]和李賀鵬[37]對沉積物中真菌胞外酶活性與理化因子間的關系進行分析,也表明真菌胞外酶活性與環(huán)境因子(總氮、總磷、總有機碳、溫度、電導率等)相關性顯著。因此,推測伊犁河流域水生真菌的胞外酶活性可能會隨河道周邊地理、氣候條件和人類活動等外界環(huán)境因子的改變而變化。

4 結 論

(1)共分離出248株可培養(yǎng)真菌,歸屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉菌門(Mucoromycota)三大系統(tǒng)發(fā)育類群,共有82個屬,其中分離得到4個潛在新菌種。

(2)4條河流沉積物中可培養(yǎng)真菌種群多樣性高于水體,Shannon指數(shù)分析表明,喀什河可培養(yǎng)真菌的群落多樣性最高,為3.79,鞏乃斯河最少,為3.21,種群組成和多樣性的空間差異性顯著。

(3)有100株真菌菌株至少產(chǎn)2種及2種以上胞外酶(主要是淀粉酶、酯酶和纖維素酶),且伊犁河干流較3條支流的產(chǎn)胞外酶活性菌株的比例最高,占比達77.59%。

(4)伊犁河流域真菌的豐度和多樣性明顯高于中東部地區(qū)水體,貯藏大量值得開發(fā)利用的真菌菌種資源;地理、氣候條件和人類活動等因素可能是造成差異性的主要原因。

(5)需進一步深入分析和探討環(huán)境因子對伊犁河流域水環(huán)境中真菌胞外酶活性的影響機理,科學優(yōu)化菌株最佳產(chǎn)酶條件,以期為合理開發(fā)流域水生真菌菌株提供科學依據(jù)。