耿銘言 劉建陽(yáng) 林偉 洪天龍 閆鼎 孔凡玉 王靜 蔡憲杰

摘? 要：為解決酸化煙田青枯病防控難的問(wèn)題，本研究通過(guò)生防菌快速篩選法獲得一株耐酸性的拮抗細(xì)菌CLP-6，采用掃描電鏡觀察其拮抗活性，利用HPLC-MS技術(shù)確定胞外抑菌物質(zhì)種類(lèi)和含量，熒光定量PCR法檢測(cè)篩選菌株對(duì)青枯菌的抑制效果。結(jié)果表明，該菌株胞外抑菌物質(zhì)可降解青枯菌桿狀菌體并致其死亡，pH 5.5條件最適宜該菌株生長(zhǎng)，且胞外抑菌蛋白和抗生素2，4-二乙?；g苯三酚產(chǎn)量高。pH 5.5和pH 7.0土壤盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，在供試時(shí)間范圍內(nèi)，CLP-6能有效降低煙草根際土壤和莖基內(nèi)青枯菌數(shù)量，且pH 5.5時(shí)抑菌效果更強(qiáng)，其中，接種192 h時(shí)，CLP-6處理煙草根際土壤青枯菌數(shù)量較CK處理分別減少98.12%和96.25%；接種144 h時(shí)，pH 5.5土壤條件下CLP-6處理煙草莖基內(nèi)青枯菌數(shù)量最低，且顯著低于CK處理。16S rRNA，rpoD和rpoB多基因序列聯(lián)合鑒定CLP-6為防衛(wèi)假單胞菌（Pseudomonas protegens）。新型耐酸性防衛(wèi)假單胞菌CLP-6在減輕連作酸化土壤青枯菌侵染和提高煙草青枯病綠色防控效果具有重要開(kāi)發(fā)前景。

關(guān)鍵詞：煙草青枯?。籶H；次生代謝產(chǎn)物；脂肽類(lèi)抗生素

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）02-0058-08

Abstract： In order to solve the problem of prevention and control of tobacco bacterial wilt in acidic soil， an acid-resistant antagonistic bacteria CLP-6 was obtained by rapid screening of biocontrol bacteria based on rapid screening of biocontrol bacteria. The antagonistic activities of CLP-6 were observed by scanning electron microscope， the types and contents of extracellular bacteriostatic substances were determined with HPLC-MS techniques. Moreover， the inhibitory effect of screened strains on R. solanacearum was detected by fluorescence quantitative PCR. The results showed that the R. solanacearum was destroyed and killed by extracellular antagonistic substances of this strain， and pH 5.5 conditions were suitable for the growth of the strain CLP-6， and the extracellular bacteriostatic protein and 2，4-DAPG were high. Strain CLP-6 could significantly reduce R. solanacearum gene copy numbers in rhizosphere soil and stem base of tobacco at pH 5.5 and pH 7.0， and the inhibitory effect was better under the pH 5.5 soil condition. When inoculated for 192 h， the gene copy numbers of R. solanacearum in tobacco rhizosphere soil treated with CLP-6 decreased by 98.12% and 96.25% respectively compared with CK treatment. When inoculated for 144 hours under pH 5.5 soil condition， the gene copy numbers of R. solanacearum in tobacco stem base was the lowest in the CLP-6 treatment and significantly lower than that in the CK treatment. Strain CLP-6 was identified as Pseudomonas protegens combined with 16S rRNA， rpoD and rpoB gene sequences analysis. The new acid-resistant CLP-6 strain has an important development potential in reducing the infection of R. solanacearum in continuous cropping acidic soil and improving the green control of tobacco bacterial wilt.

Keywords： tobacco bacterial wilt; pH; secondary metabolites; lipopeptide antibiotic

由茄雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡(jiǎn)稱(chēng)青枯菌）引起的煙草青枯?。═obacco bacterial wilt），是嚴(yán)重威脅溫帶煙草產(chǎn)區(qū)的重要土傳病害[1-2]，常給煙草生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。青枯菌具有嗜酸性，偏酸性條件有利于病原菌的生長(zhǎng)[3，5]。已有研究表明，長(zhǎng)期連作可導(dǎo)致土壤pH降低，形成酸性土壤[6]，從而加重青枯病的發(fā)生程度[3，7]。隨著煙草種植面積的不斷減少和各地?zé)熑~生產(chǎn)的需求變化，連作是煙草的常見(jiàn)種植模式。目前尚缺乏針對(duì)酸性植煙土壤中煙草青枯病的有效防治研究。

生物防治是利用微生物間的拮抗、競(jìng)爭(zhēng)和寄生等關(guān)系或者其發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的次生拮抗代謝物，通過(guò)直接或間接方式抑制或殺死病原菌，從而達(dá)到降低病害發(fā)生的目的[8]，逐漸成為控制植物病原體以及環(huán)境保護(hù)的有效手段[9]。根際防病細(xì)菌存活于植物根際土壤中，是一類(lèi)極為重要的生防微生物[10]。本研究在明確采樣區(qū)連作酸化植煙田青枯病發(fā)病區(qū)病株和未發(fā)病區(qū)健株根際土壤pH基礎(chǔ)上，擬從健株根際土樣分離、篩選適宜于酸性土壤生長(zhǎng)的拮抗細(xì)菌菌株，研究其耐酸性、抑菌活性和胞外活性成分，結(jié)合盆栽試驗(yàn)測(cè)定不同pH土壤條件下其對(duì)青枯病菌的抑制作用，為土壤酸化條件下煙草青枯病有效防控提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 供試土壤、試劑和品種

2020年7月，在湖南張家界慈利縣江埡鎮(zhèn)細(xì)毛坪村（29°24′N(xiāo)，110°47′E）煙草青枯病連年發(fā)生的植煙田中進(jìn)行土樣采集。

供試青枯菌菌株HRs分離自湖南張家界慈利縣細(xì)毛坪村發(fā)病田病株莖部，鑒定為1號(hào)小種，生物型Ⅲ。

NB和NA培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基：脫脂奶粉20 g，加蒸餾水定容至500 mL，調(diào)pH至7.0，瓊脂20 g，121 ℃滅菌15 min。

磷酸緩沖溶液（Phosphate buffer saline， PBS，pH7.2）和Tris-HCl緩沖液（1 mol/L，pH6.8，無(wú)菌）購(gòu)自上海研生生化試劑有限公司，HCl和NaOH溶液濃度為2 mol/L。戊二醛固定液、叔丁醇溶液（電鏡專(zhuān)用）購(gòu)自青島科源生物科技有限公司。2，4-二乙?；g苯三酚（2，4-diacetylphloroglucinol， 2，4-DAPG）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自武漢易泰科技有限公司上海分公司（純度>98%）。

供試烤煙品種為K326，盆栽供試土壤為經(jīng)121 ℃高壓濕熱滅菌的市售營(yíng)養(yǎng)土（pH 7.0±0.5）。

1.2? 根際土pH測(cè)定

采用對(duì)角線5點(diǎn)法和抖根法[11]分別收集未發(fā)病區(qū)健株和發(fā)病區(qū)病株根際土，每取樣點(diǎn)采集3株根

際土樣混合為一份土壤樣品，每采樣區(qū)各收集5份健株和病株根際土樣，約為50.0±1.0 g，帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。分別稱(chēng)取10.0 g健株和病株的根際土，置于50 mL三角瓶中，加25 mL蒸餾水，室溫振蕩5 min并靜置1 h后，采用PHS-3E型pH儀測(cè)定pH，每樣品3次重復(fù)。

1.3? 耐酸性拮抗細(xì)菌篩選及其抑菌活性

參照青枯菌生防菌快速篩選方法[12]進(jìn)行生防菌的篩選?；A(chǔ)培養(yǎng)基為pH 5.5的NA培養(yǎng)基，根際土樣懸浮液不做熱處理。按照初篩方法對(duì)峙培養(yǎng)2 d后，選取產(chǎn)生抑菌圈的拮抗細(xì)菌菌株進(jìn)行復(fù)篩，選擇拮抗活性最穩(wěn)定的菌株CLP-6進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

分別挑取CLP-6和青枯菌HRs單菌落接種于NB培養(yǎng)液，28 ℃、150 r/min條件搖瓶培養(yǎng)48 h后，采用無(wú)菌水梯度稀釋法結(jié)合分光光度計(jì)將拮抗細(xì)菌和HRs菌液濃度分別調(diào)整為1×108 CFU/mL（OD600=0.1）。

CLP-6菌液經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器除菌后獲得無(wú)菌上清液。取9 mL上清液與1 mL HRs菌液混合，空白處理為等量NB與HRs菌液混合。各處理于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，經(jīng)8000 r/min、4 ℃低溫離心8 min，收集菌體沉淀經(jīng)PBS緩沖液沖洗3次，200 μL PBS緩沖液重懸后，加500 μL 2.5%戊二醛溶液固定24 h，8000 r/min離心，沉淀以叔丁醇梯度脫水15 min，真空干燥1 h，通過(guò)掃描電鏡（SEM）觀察CLP-6胞外代謝物對(duì)青枯菌生長(zhǎng)和形態(tài)的影響。

1.4? CLP-6菌株耐酸性及其拮抗活性測(cè)定

1.4.1? 培養(yǎng)基pH 對(duì)CLP-6菌株生長(zhǎng)擴(kuò)繁的影響 挑取CLP-6單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，以2.5%接種量分別轉(zhuǎn)接于裝有100 mL pH 4.0～8.0（梯度為0.5）NB培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于24、48、72、96和120 h取樣，分光光度計(jì)法測(cè)定各處理菌液濃度。

菌液經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器除菌后獲得無(wú)菌上清液，備用。

1.4.2? 不同pH培養(yǎng)下CLP-6菌液及上清液拮抗活性的測(cè)定? 采用噴菌法和瓊脂對(duì)峙擴(kuò)散法[13]進(jìn)行。將HRs菌液均勻噴霧至NA平板表面，在距平板中央?2 cm處對(duì)稱(chēng)打取2個(gè)孔洞（直徑7 mm），分別取70 μL 1.4.1中各處理CLP-6菌液和上清液加入孔內(nèi)，對(duì)照為等量相應(yīng)pH的NB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈直徑大小，每處理3次重復(fù)。

1.4.3? 不同pH培養(yǎng)下CLP-6胞外蛋白含量及其拮抗活性測(cè)定? pH 5.0～ 8.0（梯度0.5）無(wú)菌上清液蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法。采用硫酸銨沉淀法[14]制備上述各處理粗提蛋白，蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基平板測(cè)定其產(chǎn)水解蛋白能力，平板抑菌法測(cè)定其HRs拮抗活性[13]，對(duì)照為等pH的NB處理。

1.4.4? 脂肽類(lèi)抗生素2，4-DAPG拮抗活性及培養(yǎng)基pH 對(duì)其產(chǎn)量的影響? 采用噴菌法[13]測(cè)定2，4-DAPG標(biāo)準(zhǔn)品（0.001 g/mL）對(duì)HRs拮抗活性，對(duì)照為等量NB，28 ℃黑暗培養(yǎng)48 h后觀察抑菌圈。每處理3次重復(fù)。

采用普通PCR法檢測(cè)2，4-DAPG合成基因phlD，引物為Phl2a：5′-GAGGACGTCGAAGACCACCA- 3′；Phl2b：5′-ACCGCAGCATCGTGTATGAG-3′[15]。PCR產(chǎn)物測(cè)序后，提交GenBank與已知基因序列比對(duì)同源性，驗(yàn)證CLP-6產(chǎn)2，4-DAPG能力。

將pH 5.5和pH 7.0條件下培養(yǎng)的CLP-6菌液經(jīng)乙酸乙酯萃取，0.45 μm濾器除去雜質(zhì)，采用液質(zhì)聯(lián)用HPLC MS（ESI-MS：6410 Triple Quad LC/MS，安捷倫科技有限公司，USA）檢測(cè)。色譜柱采用反相色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相A為0.1%的乙酸溶液，B為100%乙腈，VA∶VB=60∶40，流速設(shè)置為0.4 mL/min，柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓4.5 kV，毛細(xì)管溫度300 ℃，質(zhì)譜掃描范圍100～1500 m/z，掃描速率500 amu/s。數(shù)據(jù)獲取采用正離子模式。以2，4-DAPG為內(nèi)標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.5? 菌株CLP-6在不同酸堿度土壤中的抑菌效果

1.5.1? GCN（gene copy number）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立? 制備標(biāo)準(zhǔn)品，采用EasyPure? Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取青枯菌基因組DNA，使用引物RSF/RSR[16]進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒[17]。篩選單克隆提取重組質(zhì)粒送青島派森諾基因科技有限公司測(cè)序。

進(jìn)行熒光定量檢測(cè)體系的優(yōu)化，采用SYBR GreenⅠ技術(shù)[18]，按20 μL反應(yīng)體系（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)熱10 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s）×45個(gè)循環(huán)，每處理5次重復(fù)。PCR反應(yīng)后立即進(jìn)行溶解曲線分析，95 ℃下15 s，60 ℃ 1 min，根據(jù)Tm值驗(yàn)證PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性。

經(jīng)10倍梯度稀釋調(diào)整質(zhì)粒濃度為1×101～1×108拷貝/μL，每梯度設(shè)定3個(gè)重復(fù)，根據(jù)基因拷貝數(shù)和達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）建立GCN標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2? CLP-6對(duì)煙草根際土壤和煙草莖內(nèi)青枯菌數(shù)量的抑制效果測(cè)定? 取適量HCl與供試無(wú)菌土（pH 7.0）充分混勻，稱(chēng)?。ㄍㄟ^(guò)2 m篩孔）土樣5.0 g置于50 mL燒杯中，加入12.5 mL ddH2O，攪拌5 min，靜置30 min，PHS-3E型pH儀測(cè)定pH。反復(fù)調(diào)整至土壤pH 5.5±0.1。將濃度為1×108 CFU/mL HRs菌液分別混入pH 5.5和pH 7.0土壤，至土壤含菌終濃度均為1×108 CFU/g。

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：T1，CLP-6菌液+青枯菌+pH 5.5土壤；T2，CLP-6菌液+青枯菌+pH 7.0土壤；CK1，青枯菌+pH 5.5土壤；CK2，青枯菌+pH 7.0土壤。將45 d苗齡煙苗分別經(jīng)CLP-6菌液（1×108 cfu/mL）或無(wú)菌水浸根40 min后移栽至盛有上述4個(gè)處理土壤的花盆（凈重150 g），每處理10盆煙苗，3次重復(fù)。供試煙苗置于晝夜溫度為32/30 ℃、75%濕度的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，分別于接種后48、72、96、144和192 h時(shí)收集根際土，每重復(fù)土樣為（2.0±0.1）g；同時(shí)無(wú)菌切取莖基向上1.0 cm的莖組織，置于超低溫冰箱。稱(chēng)取供試土樣（1.0±0.05）g，用試劑盒（Soil Genomic DNA Extraction Kit，Solarbio公司）提取土壤基因組DNA；稱(chēng)取莖組織（100.0±1.0）mg，用EasyPure?Plant Genomic DNA Kit試劑盒提取莖內(nèi)細(xì)菌基因組DNA，各處理、各取樣時(shí)間的土壤和莖基樣品參照1.5.1進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)自動(dòng)生成的基因拷貝數(shù)（Gene copy number， GCN）制作消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)曲線。

1.6? 耐酸性拮抗細(xì)菌種類(lèi)分子鑒定

利用EsayPure?Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）操作步驟提取CLP-6基因組DNA，測(cè)定16S rDNA（通用引物27 F/1492 R）及rpoB和rpoD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19]。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，35次循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由青島派森諾基因科技有限公司測(cè)序，將序列遞交GenBank并BLAST比對(duì)，MEGA 6.0軟件系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.7? 數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.05軟件，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行分析，同一列數(shù)據(jù)后的不同字母代表在p＜0.05水平下具有顯著差異性，數(shù)據(jù)作圖采用Excel（2019）軟件。

2? 結(jié)? 果

2.1? 煙草病株與健株根際土壤pH

江埡鎮(zhèn)細(xì)毛坪村青枯病侵染煙田未發(fā)病區(qū)健株和發(fā)病區(qū)病株各5份根際土樣的pH平均值分別為6.18和5.66（表2），說(shuō)明該連作青枯病煙田土壤酸化現(xiàn)象明顯，且健康煙株根際土壤pH均高于病株根際土壤。

2.2? 耐酸性拮抗細(xì)菌篩選及其抑菌活性

經(jīng)酸性培養(yǎng)的初篩和拮抗活性復(fù)篩，獲得耐酸性和拮抗活性均最強(qiáng)的拮抗細(xì)菌CLP-6，其發(fā)酵液和無(wú)菌上清液在pH 5.5時(shí)對(duì)HRs的抑菌性明顯。掃描電鏡觀察顯示：處理48 h后，對(duì)照的青枯菌桿狀菌體外形規(guī)整、生長(zhǎng)正常（圖1A）；無(wú)菌上清液致使青枯菌桿狀菌體的內(nèi)含物外泄，彌散包圍在菌體周?chē)?，菌體中部變形（圖1B，箭頭處），最終菌體死亡。

2.3? pH對(duì)CLP-6菌株生長(zhǎng)和拮抗活性的影響

如圖2所示，CLP-6在不同pH下培養(yǎng)，pH<5.0時(shí)其生長(zhǎng)明顯受到抑制，pH為5.5～8.0，培養(yǎng)72 h時(shí)菌液濃度最高，其中pH 5.5處理菌液濃度最高（2.35×109 CFU/mL）。CLP-6菌株生長(zhǎng)的最佳初始pH為5.5，最佳培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

如圖3所示，在不同pH條件下培養(yǎng)48 h，隨pH增加，CLP-6發(fā)酵液和無(wú)菌上清液對(duì)青枯菌拮抗活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在pH 5.5時(shí)，二者的抑菌活性最強(qiáng)。

2.4? pH對(duì)CLP-6胞外拮抗物質(zhì)產(chǎn)量和活性的影響

2.4.1? 胞外抑菌蛋白拮抗活性及含量? 經(jīng)CLP-6上清液處理的選擇性培養(yǎng)基出現(xiàn)了水解透明圈（圖4），說(shuō)明CLP-6具有產(chǎn)水解蛋白的能力。進(jìn)一步通過(guò)拮抗活性試驗(yàn)結(jié)果證明了CLP-6胞外抑菌蛋白能夠拮抗青枯菌（圖5）。

如圖6所示，相同pH條件下，CLP-6上清液蛋白含量與培養(yǎng)時(shí)間基本呈正相關(guān)，且72 h、pH 6.5時(shí)的蛋白含量達(dá)到最高；相同培養(yǎng)時(shí)間條件下，菌株CLP-6發(fā)酵液中蛋白含量隨pH增加呈先上升后下降趨勢(shì)。培養(yǎng)時(shí)間為72～120 h時(shí)，pH 6.5和pH 7.0條件下菌液蛋白含量相對(duì)較高。上述結(jié)果表明，在偏酸-中性條件、培養(yǎng)時(shí)間為72 ～120 h時(shí)更適合菌株CLP6菌株蛋白分泌。

2.4.2? pH對(duì)CLP-6分泌2，4-DAPG及其拮抗活性的影響? CLP-6菌株phlD擴(kuò)增序列為745 bp（圖7A），與P. fluorescens PGNR1 （AY928629）的phlD基因序列同源性為99%，說(shuō)明菌株CLP-6具有分泌2，4-DAPG的能力。拮抗活性試驗(yàn)驗(yàn)證了0.001 g/mL 2，4-DAPG標(biāo)準(zhǔn)品可以抑制青枯菌生長(zhǎng)（圖7B）。HPLC-MS檢測(cè)pH 5.5和pH 7.0培養(yǎng)的粗提物組分顯示，pH 5.5時(shí)，保留時(shí)間為3.37 min的出峰（圖8），與2，4-DAPG標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致[20]；結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1039x+0.0126（R2=0.99），pH 5.5培養(yǎng)條件時(shí)檢測(cè)2，4-DAPG濃度為30 mg/L，而pH 7.0時(shí)未檢測(cè)到2，4-DAPG。上述結(jié)果說(shuō)明，pH 5.5條件誘導(dǎo)CLP-6合成2，4-DAPG，有助于提高其拮抗活性。

2.5? pH 5.5和pH 7.0條件下菌株CLP-6對(duì)煙草根際土壤和莖內(nèi)青枯菌的抑制作用

通過(guò)對(duì)青枯菌進(jìn)行熒光定量PCR得到GCN標(biāo)準(zhǔn)曲線為Ct=?2.7911 lg C0＋38.93（R2>0.99，其中Ct為達(dá)到熒光強(qiáng)度閾值的循環(huán)數(shù)，C0為基因拷貝數(shù)）。CLP-6菌接種于pH 5.5和pH 7.0土壤后，均能夠抑制煙草根際青枯菌數(shù)量增長(zhǎng)（圖9）。在處理72 h內(nèi)，所有處理的根際土壤青枯菌數(shù)量呈緩慢上升趨勢(shì)。至96 h時(shí)，T1和T2根際土壤青枯菌GCN比72 h時(shí)略微下降，CK1和CK2土壤青枯菌GCN快速上升。CLP6處理pH 5.5和pH 7.0混菌土壤有效抑制了病菌的生長(zhǎng)，青枯菌GCN比2個(gè)空白處理分別降低了90.48%和88.65%。隨接種時(shí)間再增加，4個(gè)處理土壤青枯菌量總體趨勢(shì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但CLP-6處理的青枯菌數(shù)量降低幅度大，至192 h時(shí)，T1和T2煙草根際土壤青枯菌GCN分別較CK1和CK2降低了98.12%和96.25%。以上說(shuō)明CLP-6菌株能夠較好地抑制根際土壤青枯菌數(shù)量增長(zhǎng)，且pH 5.5土壤條件下其抑制效果更強(qiáng)。

如圖10所示，接種至96 h內(nèi)，所有處理莖基組織內(nèi)青枯菌量總體呈上升趨勢(shì)，但CLP-6處理的青枯菌數(shù)量增加相對(duì)緩慢。至96 h時(shí)，CK2處理青枯菌菌量最多，為8.94×107 CFU/g，其次為CK1，而T1和T2莖基組織內(nèi)青枯菌GCN僅為4.08×107和3.63×107 CFU/g，較對(duì)照減少38.46%和59.40%。隨接種時(shí)間再延長(zhǎng)，莖基組織內(nèi)青枯菌數(shù)量呈先下降后上升趨勢(shì)，但CLP-6處理的莖基組織內(nèi)青枯菌數(shù)量始終處于較低水平。以上說(shuō)明CLP-6能夠較好地抑制煙草莖基組織內(nèi)青枯菌數(shù)量增長(zhǎng)，且在pH 5.5土壤條件下抑菌效果更強(qiáng)。

2.6? 耐酸性拮抗細(xì)菌CLP-6屬種鑒定

菌株CLP-6的16S rDNA、rpoB和rpoD基因序列登錄號(hào)分別為KX644136、MT914470和MT914471，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST同源性比對(duì)，其同源性分別為100%、99.58%和99.58%。多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖11）表明，CLP-6與護(hù)衛(wèi)假單胞菌pf5屬于同一分支，因此鑒定CLP-6為P. protegens。

3? 討? 論

連作酸化植煙田中青枯病發(fā)生較重是亟待解決的問(wèn)題。本研究從酸化的健株根際土中篩選到一株對(duì)青枯菌有較強(qiáng)拮抗活性的耐酸性護(hù)衛(wèi)假單胞菌CLP-6，研究發(fā)現(xiàn)pH 5.5酸性條件最適宜該菌株生長(zhǎng)，其分泌的胞外抑菌物質(zhì)可降解青枯菌菌體，最終致菌體死亡，且胞外抑菌蛋白和抗生素2， 4-DAPG在酸性條件下產(chǎn)量高，說(shuō)明酸性生長(zhǎng)條件增強(qiáng)了CLP-6對(duì)青枯菌的拮抗活性。已有研究表明假單胞菌可以通過(guò)分泌蛋白酶，產(chǎn)生2， 4-DAPG、硝吡咯菌素、吩嗪類(lèi)等抗生素抑制病原菌生長(zhǎng)[21-22]。本研究獲得的防衛(wèi)假單胞菌CLP-6通過(guò)分泌抑菌蛋白和抗生素發(fā)揮協(xié)同抑菌功能，對(duì)青枯菌具有更強(qiáng)的拮抗能力，也進(jìn)一步顯示了CLP-6菌株具有在酸性土壤條件下提高青枯病防病效果的應(yīng)用潛力。

本研究通過(guò)熒光定量PCR法檢測(cè)CLP-6菌液處理混菌土壤和煙草莖內(nèi)青枯菌拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)CLP-6能夠明顯減少煙草酸性和中性根際土壤及莖基組織內(nèi)青枯菌數(shù)量，且pH 5.5條件下的抑菌作用更強(qiáng)，說(shuō)明CLP-6菌株可在酸性土壤條件下生長(zhǎng)、繁殖并減輕青枯病的發(fā)生。目前尚未有嗜酸性生防細(xì)菌在不同pH土壤條件下防治煙草青枯病菌的報(bào)道，本研究在盆栽條件下對(duì)土壤和煙草莖內(nèi)青枯菌數(shù)量進(jìn)行定量檢測(cè)跟蹤，為了解嗜酸性防衛(wèi)假單胞菌CLP-6的抑菌能力、動(dòng)態(tài)變化和抑菌效果提供了直觀的科學(xué)依據(jù)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，pH 5.5和pH 7.0土壤條件下，CK處理的根際土壤青枯菌數(shù)量于72 h開(kāi)始急劇上升，于96 h開(kāi)始趨于平緩；與之相比，CLP-6處理的青枯菌數(shù)量于96 h時(shí)緩慢增加，且遠(yuǎn)低于CK處理的青枯菌數(shù)量，說(shuō)明CLP-6能一定程度延緩青枯病發(fā)病時(shí)間和發(fā)病程度；處理120 h后根際土壤中青枯菌數(shù)量開(kāi)始急劇下降，至192 h較CK1和CK2分別降低98.12%和96.25%。推測(cè)其原因是接種的CLP6菌株適應(yīng)了酸性土壤環(huán)境后，在一定程度上與青枯菌進(jìn)行生存競(jìng)爭(zhēng)，搶奪營(yíng)養(yǎng)與空間，后逐漸占據(jù)生態(tài)位，在根際土壤微生物菌群占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)通過(guò)分泌大量胞外拮抗物質(zhì)持續(xù)抑制青枯菌增殖，從而降低根際土壤青枯菌數(shù)量。而莖基組織內(nèi)青枯菌數(shù)量變化趨勢(shì)不同于根際土壤，尤其是在接種120～192 h時(shí)間內(nèi)，CLP-6處理的煙草莖內(nèi)青枯菌數(shù)量遠(yuǎn)低于CK處理，但呈下降后緩慢上升趨勢(shì)，說(shuō)明接種后期，CLP-6不能有效抑制侵入莖內(nèi)的青枯菌數(shù)量，因此建議在有效間隔時(shí)間加強(qiáng)接種CLP-6菌株保護(hù)根際，以達(dá)到延遲發(fā)病時(shí)間，減輕發(fā)病程度和有效減輕病害損失的目的。

4? 結(jié)? 論

本研究經(jīng)分離和篩選獲得了一株具有耐酸性且對(duì)青枯菌具有較強(qiáng)拮抗活性的護(hù)衛(wèi)假單胞菌CLP-6，該菌株生長(zhǎng)的最佳初始pH為5.5，最佳培養(yǎng)時(shí)間為72 h。在偏酸性（pH 5.0～6.5）條件下，尤其是pH 5.5條件下CLP-6菌發(fā)酵液和無(wú)菌上清液抑菌活性最強(qiáng)，胞外抑菌蛋白和抗生素2，4-DAPG產(chǎn)量增多，拮抗活性增強(qiáng)。該菌株能有效抑制煙草根際土壤和莖基組織內(nèi)青枯菌的生長(zhǎng)，且酸性條件更有利于該菌株發(fā)揮抑菌作用，在提高連作酸化土壤條件下煙草青枯病或其他茄科作物細(xì)菌性青枯病的防病效果方面具有重要的應(yīng)用潛力。

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