曹萌萌 朱利霞 桑成琛 栗婷軒 張艷君

摘 ?要：從長(zhǎng)期覆膜農(nóng)田土壤中篩選出一種能夠降解聚乙烯的菌株——哈茨木霉（Trichoderma harzianum）.將篩選出的哈茨木霉接種到以聚乙烯為唯一碳源的培養(yǎng)基中培育30天，聚乙烯失重率約為10%，聚乙烯薄膜表面出現(xiàn)明顯的孔洞和裂痕.

關(guān)鍵詞：聚乙烯；地膜；哈茨木霉；降解

[ ? 中圖分類號(hào) ? ?]X172[ ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼 ? ] ?A

Screening and Identification of Polyethylene-degrading Fungus Trichoderma harzianum

CAO Mengmeng，ZHU Lixia*，SANG Chengchen，LI Tingxuan，ZHANG Yanjun

（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

Abstract：A Trichoderma harzianum strain capable of degrading polyethylene was isolated from soil collected from a field with long-term plastic film mulching.After the fungus was isolated，Trichoderma harzianum was incubated for 30 days in a liquid medium with polyethylene film as the sole carbon source.The results showed that the weight loss of polyethylene film was about 10% after the incubation，obvious erosion holes and cracks appeared on the surface of degraded polyethylene film.

Key words：polyethylene；plastic film；Trichoderma harzianum；degradation

聚乙烯地膜殘留在土壤中嚴(yán)重影響土壤生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為了實(shí)現(xiàn)環(huán)保高效降解聚乙烯殘膜，亟需篩選可降解聚乙烯的微生物.地膜是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的生產(chǎn)資料之一，自地膜覆蓋技術(shù)被引入到我國(guó)后，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中地膜的用量逐年增長(zhǎng)，我國(guó)成為全球地膜覆蓋面積最大的國(guó)家.聚乙烯是一種穩(wěn)定性好、抗腐蝕性強(qiáng)的高分子聚合物，是農(nóng)業(yè)地膜最常用的塑料.[1]聚乙烯地膜可以改善土壤水熱狀況，提高作物產(chǎn)量，然而當(dāng)季作物收獲后，聚乙烯地膜常常由于風(fēng)化破敗而無法繼續(xù)使用，導(dǎo)致大量聚乙烯地膜殘留在土壤中，造成白色污染[2] ，導(dǎo)致土壤生產(chǎn)力的降低和生態(tài)環(huán)境的破壞，影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.目前解決聚乙烯殘膜污染的方法主要是焚燒、填埋、回收利用等.聚乙烯農(nóng)用地膜厚度過薄，回收成本較高，焚燒和填埋成為處理聚乙烯殘膜的主要方法，而焚燒和填埋聚乙烯殘膜又會(huì)造成嚴(yán)重的二次污染.[3]探尋清潔高效的聚乙烯殘膜降解途徑，解決由聚乙烯殘膜引起的環(huán)境問題至關(guān)重要.微生物生長(zhǎng)繁殖速度快，代謝旺盛，代謝類型多，是一種有效降解聚乙烯的途徑.[4]對(duì)單一菌種的降解效果研究表明，真菌的菌絲可以更好地附著在聚乙烯殘膜的表面并能穿透殘膜，其降解效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于細(xì)菌.[5]因此，真菌在緩解聚乙烯殘膜造成的環(huán)境問題方面具有更大的潛力.[6]本研究從長(zhǎng)期覆蓋地膜的農(nóng)田土壤中分離出一株能有效降解聚乙烯塑料的真菌.

1 材料和方法

1.1 供試材料

2021年11月，采集周口市川匯區(qū)農(nóng)田的土壤，該農(nóng)田從2009年以來長(zhǎng)期種植蔬菜并覆蓋聚乙烯地膜，土壤中殘留大量聚乙烯薄膜.

試驗(yàn)所用聚乙烯為農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購置的農(nóng)用地膜，在實(shí)驗(yàn)開始前將其剪成4 cm×4 cm的方塊形，依次用1%十二烷基硫酸鈉溶液、95%乙醇和75%乙醇浸泡并滅菌，在超凈工作臺(tái)中風(fēng)干，備用.

培養(yǎng)基為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基和固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基.固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基由液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基添加1.8%的瓊脂制得.馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂制成，pH值自然.

1.2 聚乙烯降解菌的分離純化

將采集的土壤樣品5 g加入45 mL無菌生理鹽水中，150 r/min振蕩30 min，制得土壤稀釋液.移取20 μL土壤稀釋液于100 mL以1%聚乙烯為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，用于分離以聚乙烯為唯一碳源的菌株.移取20 μL土壤稀釋液于100 mL不添加聚乙烯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中作為對(duì)照.將接種過的培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，振蕩（150 r/min）培養(yǎng)10天.棄去聚乙烯膜，將所得培養(yǎng)液用無菌生理鹽水梯度稀釋后取稀釋液0.2 mL，涂布法接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用平板劃線法進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接，獲得菌株的純培養(yǎng).

將得到的菌株以涂布法接種到鋪有4 cm×4 cm聚乙烯的固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，觀察聚乙烯膜片周圍菌落的形成情況，篩選出具有潛在降解聚乙烯能力的菌株.

1.3 聚乙烯降解菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定 參考楊合同[7]等的分類方法，對(duì)PDA培養(yǎng)皿上的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察對(duì)比，初步判定其分類地位.

分子生物學(xué)鑒定[8-9] ?將篩選到的菌株采用生工生物工程（上海）有限公司柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，測(cè)定ITS序列.采用ITS通用引物ITS1 （5′-TCCGTACCTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果用Bioedit軟件分析，截取可信度較高的序列，使用NCBI-BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將截取序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)ITS序列的相似度鑒定菌株. 采用鄰接法用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株之間的親緣關(guān)系.

1.4 聚乙烯降解菌降解效能分析

聚乙烯失重率測(cè)定 在無菌條件下將純化的菌株以5%的接種量接種到含聚乙烯片的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min培養(yǎng)30天，分別在第5，10，15，20，25和30天測(cè)定聚乙烯片的失重率.用去離子水反復(fù)清洗聚乙烯片，去除其表面附著的菌體，并將聚乙烯片置于50 ℃烘箱中干燥過夜，冷卻稱重.根據(jù)培養(yǎng)前后聚乙烯膜片的質(zhì)量變化計(jì)算失重率.

培養(yǎng)基中降解菌生長(zhǎng)情況 將菌株P(guān)T1的菌懸液按照體積比10%的比例接種到以聚乙烯為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，聚乙烯薄膜加入量按照1%的質(zhì)量比加入聚乙烯薄膜，在28 ℃條件下振蕩（150 r/min）培養(yǎng)30天，分別記錄第5，10，15，20，25和30天液體培養(yǎng)基的光密度值（OD600）.

掃描電鏡觀察聚乙烯微觀形態(tài) 將降解30天的聚乙烯薄膜清洗去除其表面附著的菌膜及其他雜質(zhì)后，自然風(fēng)干，用掃描電子顯微鏡觀察接種與未接種菌株P(guān)T1培養(yǎng)基中聚乙烯薄膜的特征，比較聚乙烯薄膜表面微觀形態(tài)變化情況.

2 結(jié)果和分析

2.1 聚乙烯降解菌的篩選

將接種土壤懸液的無機(jī)鹽培養(yǎng)基置于28 ℃，150 r/min培養(yǎng)10天后，含有聚乙烯片的培養(yǎng)基明顯渾濁，未加聚乙烯片的培養(yǎng)基清澈.采用平板劃線法分離純化獲得菌株，將其命名為PT1.

2.2 菌株P(guān)T1的鑒定

在28 ℃條件下，聚乙烯降解菌PT1菌株在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上的菌落氣生菌絲呈白色絨毛狀，中心部位有產(chǎn)孢簇，初始顏色綠色，之后逐漸加深（圖1），這與楊合同[7]等描述的木霉屬菌落特征基本一致.初步判定該菌株為木霉屬微生物.

將提取的DNA序列擴(kuò)增后回收測(cè)序，序列片段長(zhǎng)度為618 bp.將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株與哈茨木霉的ITS序列同源性高于99%，從親緣關(guān)系上判定菌株P(guān)T1為木霉屬哈茨木霉.構(gòu)建PT1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)T1與哈茨木霉（Trichoderma harzianum，Genebank ID： AF345950.1）位于同一分支.因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)特征，判定該聚乙烯降解菌株P(guān)T1為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）.

2.3 哈茨木霉對(duì)聚乙烯的降解效能

在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基光密度值OD600呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)（圖3A）.在培養(yǎng)前10天，OD600較小（OD600<0.05），培養(yǎng)液中菌株濃度較低，這可能是菌株適應(yīng)培養(yǎng)液環(huán)境的過程，根據(jù)微生物生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，此時(shí)菌株處于延滯期；在10～20天，OD600增加較快，此時(shí)哈茨木霉已經(jīng)適應(yīng)該環(huán)境，菌株大量增長(zhǎng)并以聚乙烯為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，菌株處于快速生長(zhǎng)期；在第20～30天，OD600增加緩慢，培養(yǎng)液中菌體數(shù)量下降，可能是由于此時(shí)培養(yǎng)液中無機(jī)鹽含量逐漸減少，成為菌株生長(zhǎng)的限制因子，且菌株代謝產(chǎn)物的積累抑制其自身的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致此時(shí)菌株生長(zhǎng)處于衰亡期.此外，菌株在生長(zhǎng)過程中為了利用碳源而大量附著在聚乙烯片表面也可能導(dǎo)致培養(yǎng)液中菌株濃度下降.

比較聚乙烯薄膜在接種哈茨木霉前后的質(zhì)量損失，評(píng)價(jià)聚乙烯薄膜的表觀降解狀況.經(jīng)過30天的培養(yǎng)后，聚乙烯薄膜失重率約為10%，表明哈茨木霉能夠降解聚乙烯（圖3B）.

哈茨木霉接種于聚乙烯薄膜為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)中30天后，用掃描電鏡檢測(cè)聚乙烯表面微觀形態(tài)的變化（圖4）.聚乙烯片表面結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，出現(xiàn)孔洞和裂痕，未接種哈茨木霉的聚乙烯片表明光滑，無變化，說明哈茨木霉能夠附著在聚乙烯片表面并以聚乙烯為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，哈茨木霉能夠有效降解聚乙烯.

3 討論

聚乙烯由乙烯單體經(jīng)過聚合反應(yīng)形成，是一種高分子聚合物，具有耐用、抗腐蝕的特點(diǎn)，被廣泛用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域.農(nóng)膜的使用使得大量聚乙烯殘留在土壤中，影響土壤生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展.本研究從長(zhǎng)期覆蓋聚乙烯薄膜的土壤中篩選出一株聚乙烯降解真菌——哈茨木霉，該菌株能夠降解低密度聚乙烯.哈茨木霉是一種腐生真菌，隸屬于盤菌亞門、肉座菌目、肉座菌科、木霉屬.哈茨木霉具有降解纖維素的能力，能夠分泌促生因子，降解多環(huán)芳烴等.[10]已有的降解聚乙烯的真菌主要為曲霉屬真菌，也有關(guān)于青霉屬真菌降解聚乙烯的報(bào)道，關(guān)于木霉屬真菌的報(bào)道較少.李夏[11]等分離出一種能夠降解聚乙烯農(nóng)膜的枯青霉，培養(yǎng)100天后，聚乙烯薄膜結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，在該條件下枯青霉對(duì)聚乙烯的降解速度較慢.

聚乙烯微生物降解過程是微生物附著、菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)酶降解最終被分解為CO2和水的過程.[12]在聚乙烯降解的整個(gè)過程中，哈茨木霉菌株處于寡營(yíng)養(yǎng)條件下，30天后聚乙烯失重率10%左右.微生物在寡營(yíng)養(yǎng)條件下會(huì)啟動(dòng)適應(yīng)機(jī)制以維持自身生長(zhǎng)[13]，菌株在聚乙烯無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)濃度較高，可能是由于菌株在生長(zhǎng)過程中啟動(dòng)了適應(yīng)機(jī)制，缺乏有效碳源的條件下微生物會(huì)改變其對(duì)碳源的利用偏好[14]，由此，哈茨木霉以聚乙烯為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝活動(dòng).由于哈茨木霉能夠以聚乙烯作為碳源，經(jīng)過30天的培養(yǎng)后，大量菌絲侵入并穿透聚乙烯薄膜，使得聚乙烯出現(xiàn)明顯的破損和孔洞，這直接證明了哈茨木霉能夠有效降解聚乙烯.

目前已發(fā)現(xiàn)的菌株對(duì)聚乙烯等塑料的降解效率較低，具有高效生物降解性能的菌株還很稀少，尋找高效的聚乙烯降解微生物和酶系統(tǒng)，豐富降解菌種資源庫的研究亟待加強(qiáng).Khan[15]等發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中額外添加2%葡萄糖，可大大提高賓曲霉對(duì)塑料地膜的降解能力.此外，在利用微生物降解塑料制品試驗(yàn)中，可以通過調(diào)節(jié)pH值、控制培養(yǎng)溫度、添加金屬離子及其他化學(xué)物質(zhì)等改善菌株對(duì)聚乙烯等塑料的降解效果，挖掘其降解潛能.由于微生物在降解聚乙烯過程中會(huì)分泌相應(yīng)的降解酶（如水解酶、氧化還原酶），這就使得了解降解酶及其產(chǎn)生過程顯得更為重要.因此，在今后的研究中，我們將從哈茨木霉在降解聚乙烯過程中產(chǎn)生降解酶及調(diào)控降解酶產(chǎn)生的基因入手，深入了解哈茨木霉降解聚乙烯的機(jī)制，挖掘其在降解聚乙烯方面的潛能，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù).

4 結(jié)論

從長(zhǎng)期覆膜的農(nóng)田土壤中分離篩選出1株能夠有效降解聚乙烯塑料的菌株，通過形態(tài)學(xué)特征和ITS序列同源性比對(duì)，初步鑒定該菌株為木霉屬哈茨木霉.通過失重法、培養(yǎng)液光密度值和表面微觀形態(tài)等方法驗(yàn)證了該菌株能夠有效降解聚乙烯.本研究中篩選出的菌株尚未進(jìn)行降解條件的優(yōu)化及其降解機(jī)制的研究，后期我們將探究如何提高該菌株對(duì)聚乙烯的降解效能，以期為農(nóng)田聚乙烯殘膜的高效環(huán)保降解提供參考.

參考文獻(xiàn)

[1]Qi R M，Jones D L，Li Z，et al.Behavior of microplastics and plastic film residues in the soil environment： A critical review[J].Science of The Total Environment，2020，703： 134722.

[2]Geyer R，Jambeck J R，Law K L.Production，use，and fate of all plastics ever made[J].Science Advances，2017，3（7）： e1700782.

[3]陳雷，姜玉，龔斌，等．可生物降解塑料與沸石載體體系對(duì)硝酸鹽氮污染地下水的生物修復(fù)研究[J]．環(huán)境污染與防治，2017，39（4）：345-351，355．

[4]李鵬飛，侯德義，王劉煒，等.農(nóng)田中的（微）塑料污染：來源、遷移、環(huán)境生態(tài)效應(yīng)及防治措施[J].土壤學(xué)報(bào)，2021，58（2）：314-330．

[5]Shen M C，Song B，Zeng G M，et al.Are biodegradable plastics a promising solution to solve the global plastic pollution[J].Environmental Pollution，2020，263： 114469.

[6]Sánchez C.Fungal potential for the degradation of petroleum-based polymers： An overview of macro- and microplastics biodegradation[J].Biotechnology Advances，2020，40： 107501.

[7]楊合同，唐文華，徐硯珂，等.木霉菌屬的定義及其屬下分類[J].山東科學(xué)，2002，15（2）：15-22．

[8]穆燕，律鳳霞，艾鑫，等.野生蜜環(huán)菌（Armillaria Mellea）的分離純化及抑菌作用[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2022（2）：62-64．

[9]趙世明，律鳳霞.番茄早疫病病原菌分離純化及分子鑒定[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2020（4）：31-34．

[10]Zhang F G，Zhou Z B，Xiao Y.Trichoderma biofertilizer facilitating Leymus chinensis production in different growth stages is strongly linked to dynamically altered soil microbiomes[J].Agriculture，Ecosystems and Environment，2022，324：107706.

[11]李夏，顧文杰，楊少海，等.一株地膜降解真菌的篩選及其降解性能分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2019，59（1）：56-67．

[12]Kim M Y，Kim C，Moon J，et al.Polymer film-based screening and isolation of polylactic acid （PLA）-degrading microorganisms[J].Journal of Microbiology and Biotechnology，2017，27（2）： 342-349.

[13]鐘越，李雨竹，張榕麟，等.一株聚乙烯降解菌的篩選及其降解特性研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2017，26（4）：681-686．

[14]翁曉虹，隋心，李夢(mèng)莎，等.模擬氮沉降對(duì)三江平原小葉章濕地土壤微生物碳源利用能力的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2022，43（9）：4674-4683.

[15]Khan S，Nadir S，Shah Z U，et al.Biodegradation of polyester polyurethane by Aspergillus tubingensis[J].Environmental Pollution，2017，225： 469-480.

編輯：琳莉